Quy trình định tính vibrio cholerae

Quy trình định tính vibrio cholerae

Quy trình định tính Vibrio cholerae Nhóm 9 3/5/2015 MỤC LỤC Lời mở đầu Vibrio cholerae (còn gọi là Kommabacillus) là một loài vi trùng gram âm gây bệnh tả ở người. Vibrio cholerae được nhà giải phẫu học người Ý Filippo Pacini xác định gây ra bệnh tả vào năm 1854, tuy vậy khám phá của ông không được công nhận rộng rãi đến khi Robert Koch nghiên cứu độc lập sau đó ba mươi năm và công bố thông tin về bệnh cũng như phương pháp phòng chống. Bệnh tả hầu hết có liên quan đến thực phẩm. Một nghiên cứu bệnh chứng của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cho thấy các yếu tố nguy cơ cao mắc tả là: ăn thịt chó, mắm tôm, rau sống, tiết canh. Bệnh lây theo đường tiêu hoá thông qua nguồn nước, thực phẩm, rau quả... đặc biệt là một số hải sản như sò, ốc, hến được bắt từ những nơi ô nhiễm hoặc tay bẩn, dụng cụ ăn uống bị ô nhiễm, qua ruồi, nhặng, chuột, dán... làm lây lan mầm bệnh. Hàng năm trên thế giới có khoảng 3-5 triệu ca mắc tả, 100.000-120.000 trường hợp tử vong. Vì vậy, việc tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi khuẩn Vibrio cholerae là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng và cộng đồng, Vibrio cholerae có thể được phát hiện thông qua nhiều phương pháp truyền thống hoặc phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử khác nhau. GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 1 Quy trình định tính Vibrio cholerae 1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Vibrio cholerae 1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới Bệnh tả được nói đến từ thời Hippocrates và Sanskrit, được mô tả lần đầu tiên bởi Garcia del Huerto năm 1563 và được John Snow chứng minh được vai trò lây truyền của nước năm 1849. Trong vòng gần 200 năm qua loài người đã trải qua qua 7 vụ đại dịch tả: - Đại dịch tả lần thứ nhất (1816-1826): Bắt đầu từ Bengal sau lan sang Ấn Độ, Trung Quốc và biển Caspian. - Đại dịch tả lần thứ hai (1829-1851): Năm 1831 dịch lan sang London (6.536 người chết), Paris (20.000 người chết trong tổng số 650.000 dân), tổng số chết toàn nước Pháp là 100.000. Sau dịch lan sang Liên Xô, Quebec, Ontario và New York - Đại dịch tả lần thứ ba (1852-1860): Xảy ra ở nhiều vùng của Liên Xô, làm hàng triệu người chết. Ở London, dịch làm 10.738 người chết. Dịch xảy ra ở Chicago làm chết 5,5% dân số. - Đại dịch tả lần thứ bốn (1863-1875): Dịch xảy ra chủ yếu ở Châu Âu và Châu Phi. Dịch xảy ra ở London làm chết 5.596 người. - Đại dịch tả lần thứ năm (1881-1896): Năm 1892 dịch xảy ra ở Hamburg làm 8.600 người chết. Đây là vụ dịch nặng cuối cùng ở Châu Âu. - Đại dịch tả lần thứ sáu (1899-1923): Dịch ở Châu Âu giảm đi do các điều kiện vệ sinh tốt hơn nhưng dịch vẫn xảy ra nặng nề ở các thành phố của Liên Xô. - Đại dịch tả lần thứ bảy (1961 - những năm 70): Dịch bắt đầu ở Indonesia năm 1963, với chủng vi khuẩn El Tor, sau lan sang Bangladesh (1963), Ấn Độ (1964), Liên Xô (1966). Từ Bắc Phi dịch lan sang Italy năm 1973, Nhật Bản và Nam Thái Bình Dương. Từ 1/1991 - 9/1994, dịch xảy ra ở Nam Mỹ, bắt đầu ở Peru với 1 triệu người mắc và 10.000 người chết, do chủng tả O1 - El Tor gây nên, có khác một chút với chủng tả của đại dịch lần thứ bảy là sự tái tổ hợp giữa chủng tả cổ điển và tả El Tor. Từ đó đến nay, dịch thường xuyên xảy ra ở một nước Châu Phi, Châu Á và Mỹ La Tinh. Tả vẫn là một đe doạ toàn cầu về y tế công cộng và là một trong các chỉ số về phát triển xã hội. Năm 2006, số ca tả báo cáo trên thế giới tăng lên đáng kể, tăng 79% so với năm 2005 với tổng số là 236.896 được báo cáo từ 52 nước, 6.311 trường hợp tử vong. Theo Tổ chức Y tế Thế giới con số này chỉ chiếm 10% tổng số ca bệnh xảy ra trên thực tế. Năm 2014 dịch tả vẫn có diễn biến phức tạp tại Trung Mỹ và tại các quốc gia ở Tây và Trung Phi. 1.2. Tình hình tả tại Việt Nam Bệnh tả lần đầu tiên xuất hiện ở Việt Nam năm 1850 với 2 triệu trường hợp bệnh được thông báo. Từ năm 1910-1938, hàng năm số bệnh nhân mắc tả được thông báo dao động từ 5.000 - 30.000 người. Bệnh tả El Tor lần đầu tiên xuất hiện ở miền Nam GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 2 Quy trình định tính Vibrio cholerae năm 1964 với 20.009 người mắc bệnh trong đó 821 người tử vong. Từ đó đến năm 1975, ở miền Trung và miền Nam, bệnh tả xảy ra dưới dạng dịch lưu hành. Hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tả được thông báo. Năm 1994, bệnh tả xuất hiện ở khu vực Tây Nguyên với 1.459 bệnh nhân . Sau năm 1975, do việc thông thương giữa hai miền Nam, Bắc, bệnh tả đã lây lan ra miền Bắc và gây ra những vụ dịch tả rải rác ở Hải Phòng. Từ năm 1993 -2004, dịch xảy ra ở cả ba miền Bắc, Trung, Nam với khoảng vài nghìn ca bệnh được báo cáo hàng năm. Tuy nhiên, bệnh không bùng phát thành dịch lớn, có rất ít trường hợp tử vong. Các năm 2005-2006, cả nước không ghi nhận trường hợp nào. Từ cuối năm 2007, dịch lại bùng phát ở 19 tỉnh/thành phố phía Bắc, hàng ngàn trường hợp mắc nhưng không có trường hợp nào tử vong. Năm 2009 đã có 930.496 ca mắc tiêu chảy, trong đó có 4 người chết. Năm 2008 có 853 ca bệnh tả, không có người chết, năm 2009 có 479 người mắc tả, trong đó có một người chết, năm 2010 có 606 ca bệnh tả, không có người chết, và năm 2011 có ba ca mắc tả, không có người chết. Cuối tháng 7/2014, tại huyện Bình Chánh (TP Hồ Chí Minh) đã bùng phát một ổ dịch tiêu chảy cấp khiến hơn 10 người mắc phải nhập viện điều trị , trong đó có 1 bệnh nhi tử vong. Kết quả xét nghiệm nuôi cấy và PCR phát hiện mẫu ốc bươu dương tính V.cholera O1 tuýp huyết thanh Inaba. Theo điều tra người bán ốc lấy ốc ở chợ đầu mối Bình Điền giáp ranh với huyện Bình Chánh. Việc phát hiện vi khuẩn tả trong ốc bươu vàng có nghĩa nguồn nước đã bị nhiễm vi khuẩn này, có khả năng lây lan trong cộng đồng. 2. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae Vibrio cholerae và các loài khác thuộc chi Vibrio thuộc về lớp gamma của ngành Proteobacteria. Có hai chủng Vibrio cholerae chính, chủng cổ điển và chủng El Tor, và một số nhóm huyết thanh (serogroup) khác. Hình 1: Vi khuẩn Vibrio cholerae GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 3 Quy trình định tính Vibrio cholerae Vibrio cholerae thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn có hình cong như dấu phẩy, bắt màu gram âm, không có vỏ, không sinh nha bào, di động được nhờ có lông. Phẩy khuẩn tả dễ nuôi cấy trong môi trường nghèo dinh dưỡng, pH kiềm (pH từ 8,5-9,0) và mặn.. ở môi trường thích hợp như trong nước, thức ăn, trong các động vật biển (cá, cua, sò biển...) v.v... nhất là trong nhiệt độ lạnh, phẩy khuẩn tả có thể sống được vài ngày đến 2-3 tuần. Dễ bị diệt bởi nhiệt độ (80 0C/5 phút), bởi hoá chất thông thường và môi trường axit. Vibrio cholerae có mặt trong nước, sữa, thực phẩm, côn trùng, thủy sản,… sinh độc tố ruột và nội độc tố trong đường tiêu hóa. Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng AMP vòng, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl- và nước gây tiêu chảy cấp tính. Phẩy khuẩn tả có thể chuyển hóa trong thiên nhiên, thay đổi tính di truyền do đột biến từ chủng không gây dịch có thể thành chủng gây dịch và kháng nhiều loại kháng sinh. Là vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, gây dịch tả, dịch bệnh dễ phát sinh nơi nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm trùng. V. cholerae có khoảng 140 nhóm huyết thanh và được chia thành V. cholerae-O1 và V.cholerae non-O1(Vibrio cholerae không ngưng kết với O1 còn được gọi là chủng NAG). V. cholerae O1 được phân thành 2 typ sinh học (biotyp) dựa theo đặc điểm kiểu hình là V. cholerae classica và V. cholerae eltor. Dựa vào đặc điểm các quyết định kháng nguyên A, B, C của kháng nguyên thân O, V.cholerae được phân thành 3 typ huyết thanh (serotyp) sau: • Serotyp Ogawa (có quyết định kháng nguyên A, B). • Serotyp Inaba (có quyết định kháng nguyên A, C). • Serotyp Hikojima (có cả ba quyết định kháng nguyênA, B, C). V. cholerae-non O1 nhóm huyết thanh O139 là thủ phạm gây dịch tả ở ấn Độ và một số nước châu á từ năm 1992 đến nay. Phẩy khuẩn tả gây bệnh nhờ độc tố tả (choleragen). Đây là nội độc tố có cấu trúc gồm hai đơn nguyên: đơn nguyên A (trọng lượng phân tử là 27 000 dalton, mang độc tính cao) và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích thích tăng AMP vòng (Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat 3. Các phương pháp phân tích vi khuẩn Vibrio cholerae 3.1. Phương pháp truyền thống • Môi trường nuôi cấy: GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 4 Quy trình định tính Vibrio cholerae Các phương pháp truyền thống xác định các loài Vibrio trong thực phẩm theo tiêu chuẩn hiện nay (ISO) cũng đã được phổ biến, ISO/TS 21872-1:2007 dùng để xác định V. cholerae. Phương pháp truyền thống thường dùng môi trường chứa muối với pH khoản 8,6 như môi trường tăng sinh nước peptone kiềm (alkaline saline peptone water). Môi trường phân lập thường dùng là TCBS, các khuẩn lạc của V.cholerae trên môi trường này có đặc điểm là tròn, bóng và có màu vàng. Tuy nhiên những phát hiện gần đây cho thấy môi trường TCBS có hạn chế là không phát hiện được các chủng V.cholerae lên men saccharose chậm dẫn đến sai sót trong phát hiện. Một môi trường đặc hiệu hơn cần quan tâm là môi trường tạo màu (Chromogenic agar media) theo cơ chế enzyme như chromID™ Vibrio agar (bioMérieux) hay CHROMagar™ Vibrio có thể phát hiện cả chủng lên men saccharose chậm . Nguyên tắc • Một lượng mẫu xác định (10g hoặc 25g) được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng đỉnh bằng các phản ứng sinh hóa và huyết thanh học. Môi trường tăng sinh chọn lọc cho V. cholerae là nước peptone kiềm. Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật len men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hóa môi trường bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không len men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. 3.2. Phương pháp phân tích hiện đại 3.2.1 Phương pháp miễn dịch học – ELISA (Enzyme Linked mmunosorbent Assays) ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Kỹ thuật ELISA có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng do V.harveyi trên tôm, mẫu nước và có thể xác định tất cả các dòng Vibrio spp. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau: - Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt. Kháng thể biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 5 Quy trình định tính Vibrio cholerae - Thêm vào một cơ chất (substance): enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa. Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA):kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra. Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể có thể sảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này. Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Có những phương pháp ELISA như sau: ELISA gián tiếp (indirect ELISA),Sandwich ELISA,ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 6 Quy trình định tính Vibrio cholerae Hình 2: Phương pháp miễn dịch học – ELISA 3.2.2. Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của các dNTP tự do là enzyme polymerase, sau 20-35 chu kì có thể nhân được số bả sao rất lớn của đoạn DNA cần khuếch đại. Kỹ thuật PCR chuẩn chỉ thực hiện được khi biết rõ các trình đặc hiệu ở 2 đầu DNA cần nhân gen (đoạn khuôn) để có thể thiết kế các cặp mồi đặc hiệu . Hiện nay có thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh do Vibrio spp trong vài giờ mà không mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn. Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho Vibrio spp. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 7 Quy trình định tính Vibrio cholerae Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Trong một phản ứng PCR để khuyếch đại một trình tự đặc biệt nào đó, ta cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự đó để thiết kế các mồi bổ sung ở hai đầu mạch bao gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Một khi được cung cấp hai mồi bổ sung ở hai đầu, phản ứng sẽ cho ra hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó. Các giai đoạn của phản ứng PCR Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: - - Giai đoạn biến tính: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao trong vòng 30 giây – 1phút, thường là ở 940C. Giai đoạn bắt cặp: ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 30° – 70°C khoảng 40 giây – 1 phút. - Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 720C cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thưòng kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số nhân và theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu. Sau phản ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua điện di sản phẩm trong agarose và quan sát dưới tia UV. 3.2.3. Phương pháp lai phân tử (Hybridization) Phương pháp này sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đăc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là lai phân tử. Quá trình bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoán kép DNAkhi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy của DNA (T m) và sự tái bắt cặp của các đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong 2 mạch DNA bổ sung được cố định trên giá thể rắn và nằm nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử sảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 8 Quy trình định tính Vibrio cholerae tiêu gặp nhau do chuyển động của nhiệt độ và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn T m ít nhất vài độ. Quy trình định tính Vibrio cholera 4.1. Phạm vi áp dụng 4. Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 7905-1:2008 (ISO 21872-1:2007) dùng để phát hiện Vibrio cholerae trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. 4.2. Nguyên tắc Phát hiện V.cholerae trong thực phẩm được thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu xác định và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. Từ đây dịch khuẩn được cấy chuyển sang môi trường rắn chọn lọc. những khuẩn lạc giống V.cholerae sẽ được thử nghiệm các phản ứng sinh hóa. Yêu cầu chung Việc phát hiện Vibrio cholerae cần đến bốn giai đoạn liên tiếp . 4.3. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Thiết bị và dụng cụ 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh CHÚ THÍCH: Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu đáp ứng được các yêu cầu tương tự. Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau: 6.1. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 0C ± 1 0C. 6.2. Tủ ấm hoặc nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 41,5 0C ± 1 0C. 6.3. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ từ 44 0C đến 47 0C. 6.4. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 0C ± 1 0C. Nên sử dụng các nồi cách thủy (6.2, 6.3 và 6.4) có chứa chất kháng khuẩn. 7. Lấy mẫu Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu sản phẩm có liên quan thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này. 8. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) và/hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn có liên quan đến sản phẩm. Nếu không tiêu chuẩn riêng đó thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này. GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 9 Quy trình định tính Vibrio cholerae 17.1. Môi trường và hóa chất, mục đích sử dụng Bảng 1: Môi trường và hóa chất, mục đích sử dụng Môi trường hóa chất APW và Mục đích Tăng sinh chọn lọc: phục hồi sức sống của các vi sinh vật bị tổn thương và nhằm gia tăng tăng mật độ tương đối của vi sinh vật cần phát hiện, ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn. TCBS Phân lập: Môi trường thạch Thiosulfate Citrate Bile Salts (Thiosulphate Sucrose là môi trường chọn lọc dùng để phân lập các loài citrate bile salt Vibrio từ mẫu xét nghiệm phân có lẫn với vi khuẩn khác. Các sucrose) loài Vibrio được phân biệt bằng đặc điểm do khuẩn lạc sinh ra trên môi trường. Các kiểu khuẩn lạc khác nhau được sinh ra từ các loài Vibrio khác nhau, thể hiện qua sự lên men của sucrose. Khi dùng thạch TCBS, chúng ta nên dùng chất nuôi cấy đặc, những loài Vibrio dễ chết đột ngột và môi trường này có để ngăn chặn được điều đó. Mẫu xét nghiệm tươi là tốt nhất, vì vi sinh vật này nhạy cảm với điều kiện khô, ánh sáng và pH acid NA/TSA Phục hồi TSI/KIA Khẳng đinh sơ bộ: Môi trường thạch Kligler Iron Agar được sử dụng để nuôi cấy trực tiếp cho trực khuẩn gram âm lên men đường glucose, đây là đặc điểm cơ bản trong phân loại bước đầu của các trực khuẩn gram âm. Môi trường này cũng đồng thời thử tính lên men đường lactose, sinh hơi trong quá trình lên men carbohydrat và sinh H2S. Tất cả những đặc điểm đó đã được sử dụng cho các trực khuẩn gram âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột Đĩa giấy Oxidase Khẳng định sơ bộ: dùng để thử nghiêm Oxidase Dung dịch NaCl Khẳng định sơ bộ: môi trường để thử nghiệm tính chịu mặn KOH 3% Thử Strinrg test để khẳng định sơ bộ Arginine Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định dehydrolase Ornithine decarboxylase Lysine decarboxylase TW (Tryptone Water) ONPG Kowac’s Thuốc thử Indol GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 10 Quy trình định tính Vibrio cholerae HCl và NaOH Chỉnh pH (KOH) 10% Kháng huyết thanh Thử nghiệm kháng huyết thanh polyvalent O Quy trình phân tích Các bước tiến hành • Bước 1: Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 25g (10g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm 225ml (90ml) dung dịch pha loãng mẫu APW. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Đồng mẫuthao với 225 ASPW Thời gian dập mẫu là 60 giây.nhất Tất25g cả các tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. • Bước 2: Tăng sinh chọn lọc Dùng nước peptone kiềm chứa 1% muối NaCl sau đó đem ủ trong 24 giờ. Vibrio cholerae có thể có 6-8 mặtgiờ một lượng nhỏ và thường đi kèm với một lượng lớn đáng kể các loài vi sinh vật khác thuộc họ Vibrionaceae hoặc các họ khác. Do đó, cần phảisinh có hai tăng sinh chọn lọc liên tiếp để phát hiện cáclập vi lên sinhTCBS vật đích này. Tăng lần bước 1 Phân - Tăng sinh lần đầu trong môi trường lỏng chọn lọc Cấy phần mẫu thử vào môi trường tăng sinh ở nhiệt độ môi trường. Ủ huyền phù ban đầu ở 37 0C trong 6 h ± 1 h đối với các sản phẩm đông lạnh sâu hoặc ở 41,5 0C trong 6 h ± 1 h đối với sản phẩm tươi, khô hoặc sản phẩm đã ướp muối. Cần chú Tăng sinh lầný 2khi áp dụng toàn bộ phương pháp cho các sản phẩm có hàm lượng muối cao, vì nồng độ muối cuối cùng trong môi trường có thể làm thay đổi các đặc tính - Tăng sinh lần thứ hai trong môi trường lỏng chọn lọc Chuyển 1 ml dịch cấy thu được trong 9.2 được lấy từ bề mặt cho vào ống Ủ ở 37.0 ± 0.5 0C trong khoảng 24 giờ nghiệm chứa 10 ml môi trường APW. Ủ trong môi trường APW trong 18 h ± 1 h ở nhiệt độ 41,5 0C. • Bước 3: Phân lập Sau 24 giờ, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối trên môi trường APW và cấy lên bề mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập kính khuẩn lạc đơn, ủ 37 oC trong 24 V. cholerae : Khuẩn lạc vàng, đường 3-4mm giờ. Trên môi trường thạch TCBS khuẩn lạc V. cholerae tròn, lớn có màu vàng, đường kính 2-3mm. 17.2. 17.3. Cấy chuyền sang BHI hay TSA có 1% NaCl Sinh hóa sơ bộ, khẳng định, kháng huyết thanh GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 11 KẾT LUẬN Quy trình định tính Vibrio cholerae Hình 3: Khuẩn lạc V.cholerae trên môi trường TCBS Bước 4: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ đĩa trên môi trường phân lập TCBS. Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA có bổ sung 1,5% NaCl. Ủ ở 37±10C trong 24 giờ. - Trường hợp 1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện. - Trường hợp 2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả sinh hóa không phù hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạc này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện và ngược lại thì kết luận không phát hiện. Các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa. • Bước 5: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh Để khẳng định, từ môi trường chọn lọc, lấy ra ít nhất năm khuẩn lạc được coi là điển hình hoặc giống với từng V. cholease có khả năng gây bệnh để cấy truyền. Nếu trên đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc thì cấy truyền tất cả các khuẩn lạc này. Các loại thực phẩm, đặc biệt là hải sản có thể chứa một lượng lớn vi khuẩn, kể cả Vibrio spp. không gây bệnh mà có thể phát hiện nhờ quá trình cấy chọn lọc. Việc cấy truyền các lượng nhỏ các khuẩn lạc có thể làm thất thoát các loài có khả năng gây bệnh. • GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 12 Quy trình định tính Vibrio cholerae Thử nghiệm sinh hóa : Bước 5.1. Thử nghiêm sơ bộ Bảng 2: Các phép thử nghiệm sơ bộ Phép thử Phản ứng tiêu biểu của V. cholera Tính chịu mặn - 0% NaCl + - 2% + - 6% - 8% - 10% Tính di động + Oxidase + - Thử nghiệm với các canh thang trypton muối Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 2; 6; 8 và 10 %. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 18 - 24 giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 2% và làm đục môi trường. - Thử nghiệm tính di động Nguyên tắc: Xác định khả năng di động của V. cholerae Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn sang ống nghiệm thạch bán lỏng NA, đâm thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường, ủ 370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi V. cholerae lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu. Phản ứng âm tính khi V. cholerae chỉ mọc trên đường cấy. Hình 4: Thử nghiệm tính di động GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 13 Quy trình định tính Vibrio cholerae - Thử nghiệm oxidaza Nguyên tắc: Xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở V. cholera. Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidaza. Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidaza. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 30 giây đến 1 phút. Không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này. Bước 5.2. Thử nghiệm khẳng định Bảng 3: Các phép thử nghiệm khẳng định Phép thử ADH ODC LDC ONPG TSI Indol Sinh khí (glucoza) Lactoza Sacaroza Phản ứng tiêu biểu của V. cholera + + + + + Thử nghiệm decarboxylase +ADH: enzyme arginine dihydrolase +ODC: enzyme ornithine decarboxylase +LDC: enzyme lysine decarboxylase Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithine, lysine, arginine và ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1-2 ml dầu khoáng vô trùng. Ủ các ống ở nhiệt độ 37 0C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường trở nên đục và có màu tím. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày ( tương tự màu của ống đối chứng). V. cholera cho phản ứng lysine và ornithine dương tính, phản ứng arginine âm tính. - GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 14 Quy trình định tính Vibrio cholerae - Hình 5: Thử nghiệm decarboxylase Thử nghiệm ONPG: Xác định sự hiện diện của enzyme -galactosidase ở vi sinh vật. Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng hợp trong tế bào của hai ezyme là -galactosidase có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose và permease có vai trò vận chuyển lactose vào bên trong tế bào. Lấy vi khuẩn đã phát triển trên môi trường TSI hoặc từ môi trường không chọn lọc khác có chứa 1,0% lactose vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hòa tan. Thêm 1 giọt toluene vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG, ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37 0C. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi môi trường chuyển sang vàng, âm tính khi môi trường không chuyển màu. Hình 6: Thử nghiệm ONPG GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 15 Quy trình định tính Vibrio cholerae - Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA(Kligler Iron Agar): + Môi trường KIA gồm glucose và lactose (có thể lên men carbohydrat), đỏ phenol (chỉ thị pH), pepton (nguồn carbon/nitrogen) và muối sắt cộng với thiosulfate natri. + Môi trường TSI gồm Pepton, dịch chiết thịt, dịch chiết nấm men, NaCl, Lactose, Sacarose, Glucose, sắt (III) xitrat, đỏ phenol, thạch, nước. Nguyên tắc: nhằm xác định vi sinh vật sử dụng các nguồn carbohydrate nào, có sinh ga hay không, có sinh H2S hay không. Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI hoặc KIA. Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 18 - 24 giờ. Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S, V. cholerae lên men đường glucose nhưng không lên men đường lactose. Thời gian ủ không quá 24 h, vì cấy bề mặt nghiêng thì màu vàng V. cholerae có thể chuyển sang màu đỏ sau 24 h. Hình 7: Thử nghiệm KIA/TSI Thử nghiệm indol Cấy khuẩn nghi ngờ vào ống chứa 5 ml môi trường muối tryton-tryptophan (5.10). Ủ ở 37 0C trong 24 h-3 h. Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử Kowac’s. Việc hình thành vòng màu đỏ phản ứng dương tính (hình thành indol). Vòng màu nâu-vàng chứng tỏ phản ứng âm tính. Thử nghiệm kháng huyết thanh - GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 16 Quy trình định tính Vibrio cholerae Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chứng âm trong quá trình thực hiện. Bảng 4: Phân biệt V.cholerae O1 và V.cholerae non-O1 Kháng nguyên Khá ng huyết thanh đa giá O1 + Chủng có kết quả sinh hóa tương tự V.cholerae Chủng có kết quả sinh hóa tương tự V.cholerae Chủng có kết quả sinh hóa tương tự V.cholerae Dun g dịch muối sinh lý - Kết luận V.cholerae O1 - - + + V.cholerae non-O1 Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm 1 Bảng 5: Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V. cholera O1 Kháng nguyên V. cholera O1 V. cholera O1 V. cholera O1 Kháng Inaba + + V. cholera O1 - 17.4. huyết Kháng Ogawa + + - huyết Dung dịch muối sinh lý - Kết luận Chủng Inaba Chủng Ogawa Chủng Hikojima Chủng không đặc hiệu Đọc kết quả Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g mẫu rắn hoặc 25 ml mẫu lỏng. Tài liệu tham khảo [1] Bài giảng phân tích vi sinh thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM,2014. GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 17 Quy trình định tính Vibrio cholerae [2] Trần Linh Thước(chủ biên), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo Dục Việt Nam. [3]Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM, Nguyễn Thúy Hương, 2011. [4]http://www.dieutri.vn/bgtruyennhiem/2-11-2012/S2975/Bai-giang-benh-taCholera.htm#ixzz3D127RjvE [5]http://www.case.vn/vi-VN/34/96/114/details.case [6]http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-quy-trinh-phat-hien-vibrio-trong-thuyhai-san-dong-lanh-52639/ [7] TCVN 7905-1:2008, ISO/TS 21872-1:2007, vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp phát hiện Vibrio spp. Có khả năng gây bệnh đường ruột – phần 1: phát hiện Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae [8]http://www.nihe.org.vn/new-vn/dao-tao-ngan-han--tap-huan-412312272/511/Dactinh-mot-so-moi-truong-phan-lap-va-chan-doan-vi-khuan-gay-benh.vhtm GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 18 [...]... giờ Phản ứng dương tính khi môi trường trở nên đục và có màu tím Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày ( tương tự màu của ống đối chứng) V cholera cho phản ứng lysine và ornithine dương tính, phản ứng arginine âm tính - GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 14 Quy trình định tính Vibrio cholerae - Hình 5: Thử nghiệm decarboxylase Thử nghiệm ONPG: Xác định sự hiện diện... V cholerae lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu Phản ứng âm tính khi V cholerae chỉ mọc trên đường cấy Hình 4: Thử nghiệm tính di động GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 13 Quy trình định tính Vibrio cholerae - Thử nghiệm oxidaza Nguyên tắc: Xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở V cholera Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt... kính khuẩn lạc đơn, ủ 37 oC trong 24 V cholerae : Khuẩn lạc vàng, đường 3-4mm giờ Trên môi trường thạch TCBS khuẩn lạc V cholerae tròn, lớn có màu vàng, đường kính 2-3mm 17.2 17.3 Cấy chuyền sang BHI hay TSA có 1% NaCl Sinh hóa sơ bộ, khẳng định, kháng huyết thanh GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 11 KẾT LUẬN Quy trình định tính Vibrio cholerae Hình 3: Khuẩn lạc V .cholerae trên môi trường TCBS Bước 4:... thể phát hiện nhờ quá trình cấy chọn lọc Việc cấy truyền các lượng nhỏ các khuẩn lạc có thể làm thất thoát các loài có khả năng gây bệnh • GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 12 Quy trình định tính Vibrio cholerae Thử nghiệm sinh hóa : Bước 5.1 Thử nghiêm sơ bộ Bảng 2: Các phép thử nghiệm sơ bộ Phép thử Phản ứng tiêu biểu của V cholera Tính chịu mặn - 0% NaCl + - 2% + - 6% - 8% - 10% Tính di động + Oxidase... vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG, ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37 0C V cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi môi trường chuyển sang vàng, âm tính khi môi trường không chuyển màu Hình 6: Thử nghiệm ONPG GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 15 Quy trình định tính Vibrio cholerae - Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA(Kligler Iron Agar): + Môi trường KIA gồm glucose và lactose... dương tính (hình thành indol) Vòng màu nâu-vàng chứng tỏ phản ứng âm tính Thử nghiệm kháng huyết thanh - GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 16 Quy trình định tính Vibrio cholerae Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn Kết luận dương tính. . .Quy trình định tính Vibrio cholerae HCl và NaOH Chỉnh pH (KOH) 10% Kháng huyết thanh Thử nghiệm kháng huyết thanh polyvalent O Quy trình phân tích Các bước tiến hành • Bước 1: Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 25g (10g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm 225ml (90ml)... dụng chủng chứng dương và chứng âm trong quá trình thực hiện Bảng 4: Phân biệt V .cholerae O1 và V .cholerae non-O1 Kháng nguyên Khá ng huyết thanh đa giá O1 + Chủng có kết quả sinh hóa tương tự V .cholerae Chủng có kết quả sinh hóa tương tự V .cholerae Chủng có kết quả sinh hóa tương tự V .cholerae Dun g dịch muối sinh lý - Kết luận V .cholerae O1 - - + + V .cholerae non-O1 Chủng không đặc hiệu với kháng... ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa V cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 2% và làm đục môi trường - Thử nghiệm tính di động Nguyên tắc: Xác định khả năng di động của V cholerae Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn sang ống nghiệm thạch bán lỏng NA, đâm thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường, ủ 370C trong 24 giờ Phản ứng dương tính khi V cholerae lan ra... Ogawa Chủng Hikojima Chủng không đặc hiệu Đọc kết quả Phát hiện hoặc không phát hiện được V cholerae trong 25 g mẫu rắn hoặc 25 ml mẫu lỏng Tài liệu tham khảo [1] Bài giảng phân tích vi sinh thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM,2014 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page 17 Quy trình định tính Vibrio cholerae [2] Trần Linh Thước(chủ biên), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực ... nhóm huyết (serogroup) khác Hình 1: Vi khuẩn Vibrio cholerae GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page Quy trình định tính Vibrio cholerae Vibrio cholerae thuộc họ Vibrionaceae, vi khuẩn có hình cong dấu phẩy,... Kim Oanh Page Quy trình định tính Vibrio cholerae Các phương pháp truyền thống xác định loài Vibrio thực phẩm theo tiêu chuẩn (ISO) phổ biến, ISO/TS 21872-1:2007 dùng để xác định V cholerae Phương... sung cố định giá thể rắn nằm nằm tế bào hay mô Sự lai phân tử sảy đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với vùng trình tự DNA mục GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Page Quy trình định tính Vibrio cholerae