Đề tài: Định tính Vibrio cholerae

Vibrio cholerae được nhà giải phẩu người Ý Kilippo Pacini xác định gây ra bệnh tả vào năm 1854, tuy vậy khám phá của ông không được công nhận rộng rãi đến khi Robert Koch nghiên cứu độc lập sau đó ba mươi năm và công bố thông tin về bệnh cũng như phương pháp phong chống.

Định tính Vibrio cholerae Tổng quan về Vibrio cholerae: Vibrio cholerae được nhà giải phẩu người Ý Kilippo Pacini xác định gây  ra bệnh tả  vào năm 1854, tuy vậy khám phá của ơng khơng được cơng nhận rộng rãi đến khi  Robert Koch nghiên cứu độc lập sau đó ba mươi năm và cơng bố thơng tin về bệnh  cũng như phương pháp phong chống Bệnh tả hầu hết có liên quan đến thực phẩm. Một nghiên cứu bệnh chứng của Viện  Vệ sinh dịch tể Trung ương cho thấy các yếu tố gây nguy cơ cao là: ăn thịt chó,mắm  tơm, rau sống, rau quả  đặc biệt là một số hải sản như cá, sò, ốc, hến được bắt từ  nơi ơ nhiễm hay dùng tay bẩn, dụng cụ ăn uống dơ bẩn, thức ăn tiếp xúc với ruồi,  nhặng, chuột, dán,  làm lây lan mầm bệnh Hàng năm trên thời giới có khoảng 3­5 triệu c mắc tả, 100.000­120.000 tường hợp tử  vong. Vì vậy, việc tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi khuẩn Vibrio cholerae  là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng và cộng đồng, Vibrio  cholerae có thể được phất hiện thơng qua nhiều phương pháp truyền thống hoặc  phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử khác nhau 1.1 Tình trạng ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Vibrio cholerae Tình hình dịch tả trên thế giới Bệnh tả được nói đến từ thời Hippocrates và Sanskrit, được mơ tả lần đầu tiên bởi  Garcia Huerto năm 1563 và được John Snow chứng minh được vai trò lây truyền của  nước nước năm 1849. Trong vòng gần 200 năm qua lồi người đã trải qua 7 vụ đại  dịch tả: ­ Đại dich tả lần thứ nhất  (1816­ 1826): Bắt đầu từ Bengal sau lan sang Ấn Độ,  Trung Quốc và biển Caspian ­ Đại dịch tả lần thứ hai(1829­ !826): Naawm1831 dịch lan sang Ln Đơn (6.536  người chết, Pái (20.000 người chết trong tổng số 650.000 dân), tổng số tử vong  tồn nước Pháp là 100.000 nguwoif. Sau dịch lan sang Liên Xơ, Quebec, Ontario  và New York ­ Đại dịch tả lần thưa ba (1852­ 1860): xay ra ở nhiều vùng của Liên Xơ, làm  hàng triệu người chết. Ở Ln Đơn làm 10.738 người tư vong. Dịch xảy ra ở  Chicago làm chết 5,5% dân số ­ Đại dịch lần thứ tư (1863­ 1875): Dịch xảy ra chủ yếu là ở Châu Au và Châu  Phi. Dịch xảy ra ở Luân Đôn làm 5.596 người chết ­ Đại dịch tả lần thứ năm (1881­ 1896): Năm 1892 dịhj xảy ra ở Hamburg làm  8.600 người chết. Đây là vụ dịch lớn cuối cùng ở Châu Âu ­ Đaih dịch tả lần thứ sáu (1899­1923): Dịch ở Châu Âu giảm đi do các điều kiện  về vệ sinh tốt hơn nhưng dịch vẫn xảy ra nặng nề ỏ các thành phố của Liên  Xô ­ Đại tả lần thứ bảy (1961­ngững năm bảy mươi): Dịch bắt đầu ở Indonẽia năm  1963, với chủng vi khuẩn El Tor, sau lan sang Bangladesh (1973), Ấn Độ (1964),  Liên Xơ (1966). Từ Bắc Phi dịch lan sang Italy năm 1973, Nhật Bản và Nam  Thái Bình Dương. Từ 1/1991 – 9/1994, dịch xảy ra ở Nam Mỹ, bắt đầu ở Beru  với 1trieeuj người mắc và 10.000 người chết, do chủng tả O1­ E1 Tor gây nên,  có khác một chút so với chủng tả của đại dịch lần thứ bảy là sự tái tổ hợp giữa  chủng tả coorddieent và tả El Tor. Từ đó đến nay dịch xảy ra thường xun ở  một số nước Châu Phi, Châu Á và Mỹ La Tinh. Tả là một mối đe dọa tồn cầu  về y tế cơng cộng và là một trong những chỉ số về phát triển xã hội. Năm 2006,  só ca tả báo cáo trên thới giới tăng lên đáng kể, taawng 79% so với năm 2005  với tổng số là 236.896 được báo cáo từ 52 nước, 6.311 trường hợp tử vong.  Theo tổ chức Y tế Thế giới con số này chỉ chiếm 10% tổng số ca bệnh xảy ra  trên thực tế ­ Năm 2014 dịch tả vẫn có chuyển biến phức tạp tai Trung Mỹ và các quốc gia ở  Tây va Trung Phi 1.2 Tình hình tả ở Việt Nam Bệnh tả lần đầu tiên xuất hiện ở Việt nam năm 1850 với  2 triệu trường hợp bệnh  được thơng báo. Từ năm 1910­ 1938, hàng năm số bệnh nhân mắc tả được thơng báo  dao động từ 5.000­ 30.000 người. Bệnh tả El Tor lần đầu tiên xuất hiện ở miền Nam ,  bệnh tả xảy ra dưới dạng dịch lưu hành . Hàng năm có  hàng trăm bệnh nhân bị bệnh  tả được thơng báo. Năm 1994, bệnh tả xuất hiện đầu tiên ở Tây Ngun với 1.459  bệnh nhân. Sau năm 1975, do việc thơng thương giữa hai miền Nam, Bắc, bệnh tả đã  lây lan ra miền Bắc và gây ra những vụ dịch tả rải rác Hải Phong. Từ năm 1993 ­2004,  dịch xảy ra liên tiếp cả ba miền Bắc, trung , Nam với khoang vài nghìn ca bệnh được  báo cáo hàng năm. Tuy nhiên, bệnh khơng bùng phát thành dịch lớn, có rất ít trường  hợp tư vong. Các năm 2005 ­2006, cả nước khơng ngi nhận trường hợp nào. Từ cuối  năm 2007,dịch lại bùng phát ở 19 tỉnh/ thành phố phía Bắc, hang ngàn  trương hợp   mắc nhưng khơng có trường hợp tử vong Năm 2009 đã có 930.946 ca mắc tiêu chay, trong đó có người chết,. Năm 2008 có 453  ca bệnh tả , chết, năm 2009 có 853 người mắc tả,khơng có  người chết, năm 2009 có  479  ca mắc tả, trong đó có một người chết, năm 2010 có 606 ca bệnh tả, khơng có  người chết, năm 2011, có ba người mắc bệnh tả, khơng có người chết Cuối tháng 7/2014, tại huyện Bình Chánh (TP.HCM) đã bung phát một ổ dịch tiêu chảy  cấp khiến hơn 10 người mắc phải nhập viện điều trị, trong đó có một bệnh nhi tử  vong. Kết quả xét nghiệm ni cấy và PCR phát hiên mẫ ốc bươu dương tính V.  cholerae O1 tp huyết thanh Inaba. Theo điều tr người bán ốc lấy ốc ở chợ đầu mối  Bình Điền giáp ranh với huyeenj Bình Chánh Việc phát hiện vi khuẩn tả trong ốc bươu vàng có ngĩa nguồn nước đã bị nhiễm vi  khuẩn này, có khả năng lây lan tromng cộng đồng 1.3 Đặc điểm của Vibrio cholerae Virio cholera (còn gọi là Kommabaccillus) sih vật gram âm hình que hai đầu khơng đều  nhau tạo hình dấu phẩy, di động, sống kị khí tùy ý có khả năng lên men glucose nhưng  khơng sinnh hơi, khơng sinh H2S. V. cholerae có phản ứng oxidase (+), ADH(­),  LDC(+), lên men được sucrose, có thể tăng trưởng được trong mơi trường chứa 0­3%  NaCl,khơng phát triển được trong mơi trường chứa 6, 8, 10% muối Vibrio choleaevaf các lồi thuộc chi Vibrio Proteobacteria. Có hai chủng Vibrio  cholerae chính, chủng cổ điển và chủng El Tor, và một sơ nhóm huyết thanh  (serogroup) khác Vbrio cholerae thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn có hình cong như dấu phẩy, bắt  màu gram âm, khơng có vỏ, khơng sinh nha bào , di dộng dược nhờ có lơng, khuẩy  khuẩn dễ ni cấy trong mơi trường nghèo dinh dưỡng, pH kiềm (8,5 ­9) và mặn ở  mơi trường thích hợp như trong nước, thức ăn trong các đọng vật biển ( cá, cua, ốc,sò  biển, )  nhất là ở nhiệt độ thấp, khuẩy khuẩn tả có thể sống được vài ngày đến 2,3  tuần. dễ bị diệt ở nhiệt độ (85oC/ 5 phút), bởi hóa chất thơng thường và mơi trường  axit Vibrio cholerae có mặt trong nước, sữa, thực phẩm, thủy sản, cơn trung,  sinh độc tố  ruột và nội độc tố trong dường tiêu hóa. Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt  hóa emzyme andenylcyclase dẫn đến tăng AMP vogf, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết  Cl­ và nước gây tiêu chảy cấp tính. Phẩy khuẩn tả có thể chuyển hóa trong thiên  nhiên, thay đổi tính di truyền do đọt biến từ chủng khơng gây dịch có thể thành chủng  gây dịch và kháng nhiều loại kháng sinh. Là vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên , gây  dịch tả, dịch bệnh dễ phát sinh nơi nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm trùng V. cholerae có khòagr 140 nhóm huyết thanh và được chia thành V. cholerae­O1 và Vi.  Cholerae no­O1(V. cholerae khơng ngưng kết với O1 còn được gọi là chủng NAG) V.cholerae O1 được phân thành 2 typ sinh học (biotyp) dựa theo đặc điểm kiểu hình là  V. cholerae classica và V. cholerae Eltor. Dựa vào đặc điểm các quyết định kháng  ngun A,BC của kháng ngun O, V. cholerae được phân thành 3 typ huyết thanh (sero  typ) sau: ­ Serotyp Ogawa ( có quyết định kháng ngun A,B) ­ Serotyp Inaba ( có quyết định kháng ngun A, C0 ­ Serotyp Hikojima ( có ca ba quyết định kháng ngun A, B,C) V. cholerae­non O1 nhóm huyết thanh O139 là thủ phạm gây dịch tả ở Án Độ và một  số nước ở Châu Á từ năm 1992 đến nay Phẩy khuẩn tả gây bệnh nhờ độc tố tả ( choleragen). Đây là nội đọc tố có cấu trúc  gồm hai đơn ngun: đơn ngun A ( trọng lượng phân tử là 27.000 dalton, mang độc  tính cao) và đơn ngun B có tính kháng ngun đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác  dụng kích thích tăng AMP vong ( Adenosin 3,5­Cyclic mơn phosphat Các phương pháp phân tích vi khuẩn Vibrio cholerae 2.1 Phương pháp truyền thống 2.1.1 Mơi trường ni cấy Các phương pháp truyền thống xác định các lồi Vibrio trong thực phẩm theo tiêu  chuaamr hiện nay (ISO) cũng đã được phổ biến, ISO/TS 21872­1:2007 dùng để xác  định V. cholerae Phương pháp thường dùng mơi trương chứa muối với pH khoảng 8.6 như mơi trường  tăng sinh nước peptone kiềm ( alkaline saline peptone wate). Mơi trường phân lặp  thương dùng là TCBS,  các khuẩn lạc của V. cholerae trên mơi trường này thương có  đặc điểm là tròn bóng và có màu vàng. Tuy nhiên các phát hiện gần đay cho thấy mơi  trường TCBS có hạn chế là khơng phát hiện được các chủng V. cholerae lên men  saccharose chậm dẫn đến sai sót trong phát hiện . Một mơi trường đặc hiệu hơn cần  quan tâm là mơi trường tạo màu ( chromogenic arga media) theo cơ chế enzyme như  chromIDTTM Vibrio arga (bioMesrieus) hay CHROMargaTM  Vibrio có thể phát hiện cả  chủng lên men saccharose chậm Ngun tắc Một lượng mẫu xác định ( 10g hoặc 25g) được tăng sinh trong mơi trường chọn lọc  đặc trưng. Cấy phân lập từ mơi trường tăng sinh sang mơi trường phân biệt chọn lọc  đặc trưng. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ  trên mơi trương phân lập dược khẳng định băng  các phản ứng sinh hóa và huyết thanh học . Mơi trường tăng sinh chọn lcoj cho V.  cholerae là TCBS ( Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Argar). Các vi sinh vật lên men  dược surose trong mơi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm axits hóa mơi  trương bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật khơng lên men được đường sucrose sẽ  cho khuẩn lạc mù xanh 2.2 Phương pháp phân tích hiện đại  Phương pháp miễn dịch học – ELISA ( Enzyme Linked  Immunosorbent Assays) 2.2.1 ELISA (Enzyme­Linked Immunosorben Asa) hay EIA ( Enzyme Immunosorbent) là một  kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng ngun trong mẫ xét nghiệm. kỹ  thuật ELISA có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng  V. harveyi trên tơm,  mẫu nuwowcsvaf có thể xác định tất cả các dòng Vibrio spp. Phương pháp này được  thực hiện dựa trên nguyentawcs bắt dính đặc hiệu của kháng ngun và kháng thể và  gồm các bước cơ bản sau: ­ Kháng ngun chưa biết được gắn trên một bề mặt ­ Kháng thể biết trước được “rữa” qua bề mặt đó.  Kháng thể này được gắn  Enzyme ­ Thêm vào cơ chất (substance): enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu  có thể xác định được. Đối với các ELISA  phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra  từ mẫu chứa kháng ngun­ kháng  thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng  ngun­ kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với ngun lý trên,  ELISA giúp xác định sự có mặt hay khơng cũng như lượng kháng ngun trong  mẫu nghiên cứu Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng  ngun chưa biết. Thơng thường kháng ngun được cố định tại các giếng của  vi phiếm (polystyrene microtiter plate). Phương thức cố định khơng đặc hiệu:  kháng ngun gắn trực tiếp vào bề mặt đĩa Phương thức đặc hiệu (“sandwich” ELISA): kháng ngun được gắn với một  kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng ngun cần kiêm tra Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phanr ứng tạo phức hợp kháng ngun – kháng thể có thể xảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín  hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng ngun  cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary  antibody) được gắn với enzyme thơng qua các liên kết cộng hóa trị giữa các  phân tử sinh học (bioconjugation ) kháng ngun cần xác định sẽ được nhận  biết qua kháng thể thứ cấp này Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể khơng đặc hiệu, kháng  thể khơng gắn với kháng ngun sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng  “rửa”. Sau bước “ rửa” cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng ngun  được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên  kết với kháng thể trong phức hơn kháng ngun­kháng thể. Phản ứng phát  quang (biến đổi cơ chất ) sẽ xảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được  sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi  làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Có những phương pháp  ELISA như sau: ELISA gián tiếp (inderect ELISA),  Sandwich ELISA, ELISA  cạnh tranh (Competive ELISA)  Phương pháp PCR (Polymer Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ)  phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các  nghiên cứu sinh học trên tồn thế giới. Đây là phương pháp intro sử dụng các  cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt  dựa vào hoạt động của các dNTP tự do là enzyme polymerase, sau 20­35 chu kì  có thể nhân được khi biết rõ các trình đặc hiệu ở 2 đầu DNA cần nhân gen  (đoạn khn) để có thể thiết kế các cặp mồi đặc hiệu Hiện nay có thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đốn nhanh bệnh  do Vibrio spp trong vài giờ mà khơng mất nhiều thời gian đê phân lập vi khuẩn Ngun tắc Ngun tắc của phương pháp này là phát hiện một DNA đặc hiệu cho Vibrio  spp. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của enzyme DNA polymerase trong  q trình tổng hợp DNA mới từ mạch khn.Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối   dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hồn  chỉnh. Trong một phản ứng PCR để khuếch đại một trình tự đặc biệt nào đó, ta  cần phải có những thơng tin tối thiểu về trình tự đó để thiết kế các mồi bổ  sung ở hai đầu mạch  bao gồm một mồi xi (sense primer) và một mồi ngược  (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Một khi được cung cấp hai  mồi bổ sung ở hai đầu, phản ứng sẽ cho ra hàng loạt bản sao của đoạn DNA  nắm giữa hai mồi đó Các giai đoạn của PCR  Một phản ứng PCR làm một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm  ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính: trong  một dung dịch phanr ứng bao gồm các thành phần  cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao trong  vòng 30 giầy­ 1 phút, thường là ở 94oC Giai đoạn bắt cặp: ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi  bắt cặp với khn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này giao động trong khoảng từ  300C­700C khoảng 40­60  giây.  Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 720C cho DNA polymerase sử  dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy  thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại thường kéo dài từ 20 giây đến  nhiều phút Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần  làm tăng bản sao gấp đơi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số nhân và  theo tính tốn, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại là 106 so với số lượng bản mẫu  ban đầu. Sau phản ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có  thể quan sát thấy thơng qua điện di sản phẩm trong agarose và quan sát dưới tia  UV Phương pháp này sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm  dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc  sử dụng mẫu dò là lai phân tử Q trình bao gồm sự tách rời hai mạch đơi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt  độ vượt q nhiệt độ nóng chảy của DNA (T m) và sự tái bắt cặp của các đoạn  DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong  2 mạch DNA bổ sung được cố định trên giá thể rắn và nằm ngay trên tế bào  hay mơ. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ  sung với  một trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động của nhiệt độ và khi  nhiệt độ mơi trường thấp hơn T m ít nhất vài độ   Phạm vi ứng dụng  Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 7905­1:2008 (ISO 21872­1:2007 dùng để phát  hiện V. cholerae trong thực phẩm và thức ăn chăn ni Ngun tắc Phát hiện V. cholerae trong thực phẩm đượ c thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu  xác định và ni ủ trong mơi trường lỏng chọn lọc. Từ đây dịch khuẩn được cấy  chuyển sang mơi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc giống V. cholerae sẽ được thí  nghiệm phản ứng sinh hóa Mơi trường và mơi chất  Mơi trường và hóa chất APW (Alkaline Phosphat Water) TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose) NA/KSA TSI/KIA Đĩa giấy Oxidase Dung dịch NaCl KOH 3% Arginine dehydrolase Ornithine Decarboxylase Lysine Decarboxylase TW (Tryptone Water) ONPG Kowac’s HCL và NaOH (KOH) 10% Mục đích Tăng sinh chọn lọc Phân lập Phục hồi  Khẳng Định sơ bộ Thử String test sinh hóa để khẳng định  Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định sơ  Thuốc thử Indol Chỉnh pH ... Vibrio choleaevaf các lồi thuộc chi Vibrio Proteobacteria. Có hai chủng Vibrio cholerae chính, chủng cổ điển và chủng El Tor, và một sơ nhóm huyết thanh  (serogroup) khác Vbrio cholerae thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn có hình cong như dấu phẩy, bắt ... dịch tả, dịch bệnh dễ phát sinh nơi nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm trùng V. cholerae có khòagr 140 nhóm huyết thanh và được chia thành V. cholerae O1 và Vi.  Cholerae no­O1(V. cholerae khơng ngưng kết với O1 còn được gọi là chủng NAG) V .cholerae O1 được phân thành 2 typ sinh học (biotyp) dựa theo đặc điểm kiểu hình là ... V .cholerae O1 được phân thành 2 typ sinh học (biotyp) dựa theo đặc điểm kiểu hình là  V. cholerae classica và V. cholerae Eltor. Dựa vào đặc điểm các quyết định kháng  ngun A,BC của kháng ngun O, V. cholerae được phân thành 3 typ huyết thanh (sero