ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Đề tài: ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ SVTH: NHĨM GIỚI THIỆU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH NỘI DUNG VÍ DỤ THỰC TẾ 11 Giới thiệu Vibrio Cholerae Hình ảnh Vibrio cholerae kính hiển vi sau nhuộm màu Phân loại khoa học Giới (regnum): Bacteria Ngành (phylum): Proteobactreia Lớp (class): Gamma proteobacteria Bộ (ordo): Vibrionales Họ (familia): Vibrionaceae Chi (genus): Vibrio Loài (species): V.cholerae - Giới thiệu Vibrio Cholerae Thuộc giống Vibrio - Phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, có khả di dộng V cholerae gây bệnh dịch tả vệ sinh kém, nguồn nước ô nhiễm, gây ngộ độc thực Phát triển nhiệt độ 42 C, tồn nước mặn nước phẩm - Phát triển nhanh thực phẩm nhiệt độ thường thực phẩm giữ lạnh - đông lạnh Các chủng V.cholerae gây dịch chủ yếu thuộc nhóm huyết O1 O139 điều kiện khô không sống 48h - Rất nhạy với nhiệt nên loại bỏ dễ dàng đun nấu Cách thức sinh trưởng: Cholerae lên men khơng sinh khí, có khả làm dịch hóa gelatin Có khả khử nitrat thành nitrit phân giải trytophan thành indol Cách thức sinh trưởng Vibrio Vibrio cholerae phát triển vùng có nồng độ muối cao 3% Có khả lên men đường glucose, sucrose,mannose, khử lysine cholerae Quy trình phân tích Tiến hành phân tích    Bước 1: Đồng mẫu Cân vô trùng 25g mẫu hải sản vào túi PE vô trùng Cắt mẫu lớn thành mảnh nhỏ rời thêm 225ml nước pepton kiềm APW túi, nghiền máy nghiền đồng thể phút Ủ mẫu hai chế độ 0 0 nhiệt 37 C 1,0 C 42 C ,2 C – 24h Tiến hành phân tích    Bước 2: Tăng sinh a Đối với mẫu thơng thường 0 Ủ bình chứa chuẩn bị nhiệt độ 37 C 1,0 C – 8h Sau đó, phân lập qui định, phần lại ủ tiếp 16 – 24h phân lập lại b Đối với mẫu hàu Ủ dãy pha loãng 10 Ủ dãy pha loãng 10 -1 -2 0 đến 10 nhiệt độ 37 C 1,0 C – 8h 16 – 24h -1 -2 0 đến 10 nhiệt độ 42 C ,2 C – 8h 33 Ví dụ Chuẩn bị mẫu Mẫu hải sản Vô trùng, cắt nhuyễn Môi trường ASPW (môi trường nước pepton muối kiềm) Tăng sinh Môi trường ASPW bổ sung 3% NaCl polymycin B 50UI Ủ 8-12 Dịch tăng sinh Phương pháp nghiên cứu  Xác định V cholerae phản ứng hóa sinh Dịch tăng sinh Cấy lên mt TCBS ủ , 18-24h Chọn khuẩn lạc đặc trưng Cấy lên mt TSI ủ , 24h Chọn mt chuyển màu vàng, khơng sinh để thử hóa sinh khẳng định Phương pháp nghiên cứu Thử nghiệm Oxidase + Thử nghiệm indole + Lên men Glucose + Lên men Frutose + Lên men Mannose + Lên men Lactose - Lên men Arabinose - H2 S - Thử nghiệm Urease (c) - Enzyme (Catalase, Lysine Orithine decarboxylase) + Enzyme (Arginine dihydrolase) NaCl 3% + Phương pháp nghiên cứu Cấy lên thạch TCBS Chuyển vào canh BHI ủ , 18-24h Bảo quản gốc BHI bổ sung 20% glycerol, giữ Phương pháp nghiên cứu  Xác định V cholerae kỹ thuật m-PCR Dịch tăng sinh Ly trích DNA Chạy mPCR Điện di Kết  Ly trích DNA   Lấy 1ml dịch tăng sinh, ly tâm 10.000 vòng/phút phút, phần cặn hòa tan 100 TE 0,5X để ly trích DNA Nguyên tắc PCR DNA đích o Biến tính (94 C ) o Bắt cặp (55-65 C) 5’ 3’ 3’ 5’ o Kéo dài (72 C) n n  Chạy mPCR    Thành phần phản ứng mPCR gồm: • 13,5 hỗn hợp master mix (2 UI Ampli Taq gold; 0,2mM dNTP; buffer 10X; 1,5mM ) • 0,5�� đoạn mồi (nồng độ 0,625 ) • 0,5 DNA khn mẫu • 25 nước cất hai lần  Quy trình nhiệt: phút 30 giây; 30 giây, 30 giây, phút lặp lại chu kỳ 40 lần;  Điện di  Quá trình điện di thực với dung dịch TAE 1X gel agarose 1,5%, thời gian điện di 50V/45 phút  Sau điện di, bảng gel agarose dược nhuộm dung dịch ethium bromide 1/10.000 nhận diện nhờ máy chiếu tia UV Kết Bảng So sánh tỷ lệ phát V.cholerae phương pháp sinh hóa m-PCR DNA ly trích từ dung dịch tăng sinh Dung dịch pepton muối kiềm (Môi trường 1) Địa điểm Đồng Nai (n=127) Tp Hồ Chí Minh (n=113) Tổng cơng (N=240) Phương pháp Loại mẫu Sinh hóa m-PCR Sinh hóa m-PCR Sinh hóa m-PCR n % n % n % n % n % n % Tôm 13 34,2 13 34,2 14 42,4 14 42,4 27 38,0 27 38,0 Nhuyễn thể 34 38,2 40 44,9 38 47,5 39 48,7 72 42,6 79 46,7 Chung 47 37,0 53 41,7 52 46,0 53 46,9 99 41,3 106 44,2 Dung dịch nước pepton muối kiềm bổ sung polymycin B 50UI 3% NaCl (Môi trường 2) Địa điểm Đồng Nai (n=127) Tp Hồ Chí Minh (n=113) Tổng công (N=240) Phương pháp Loại mẫu Sinh hóa m-PCR Sinh hóa m-PCR Sinh hóa m-PCR n % n % n % n % n % n % Tôm 0,00 10,5 15,2 12 36,4 8,4 17 23,9 Nhuyễn thể 8,9 50 56,2 12 15,0 43 53,7 18 10,7 93 55,0 Chung 6,3 54 42,5 17 15,0 55 48,7 24 10,0 110 45,8 Kết Ghi chú: Tôm: n = 71 (Đồng Nai: 38 mẫu; Tp Hồ Chí Minh: 33 mẫu) Nhuyễn thể: n = 169 (Đồng Nai: 89 mẫu; Tp Hồ Chí Minh: 80 mẫu) V Cholerae dịnh danh phương pháp m-PCR cao phương pháp sinh hóa môi trường tăng sinh (44,2% so với 41,3% môi trường 45,8% so với 19,0% môi trường 2) L/O/G/O Thank You! ... Vibrionales Họ (familia): Vibrionaceae Chi (genus): Vibrio Loài (species): V .cholerae - Giới thiệu Vibrio Cholerae Thuộc giống Vibrio - Phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, có khả di dộng V cholerae. .. nước nhiễm, gây ngộ độc thực Phát triển nhiệt độ 42 C, tồn nước mặn nước phẩm - Phát triển nhanh thực phẩm nhiệt độ thường thực phẩm giữ lạnh - đông lạnh Các chủng V .cholerae gây dịch chủ yếu...GIỚI THIỆU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH NỘI DUNG VÍ DỤ THỰC TẾ 11 Giới thiệu Vibrio Cholerae Hình ảnh Vibrio cholerae kính hiển vi sau nhuộm màu Phân loại khoa học Giới (regnum):