ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực trùng gram âm, hô hấp hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào tửCác loại thực phẩm đều yêu cầu phải kiểm nghiệm Salmonella với tiêu chuẩn không phát hiện25g (ml)Salmonella là loại vi khuẩn có thể sống trong các ống ruột của người và động vật khácBất kỳ thực phẩm tươi có nguồn gốc động vật như thịt lợn, thịt gia cầm, sữa và các sản phẩm sữa, trứng, hải sản cùng với một số rau, quả có thể chứa salmonella.Động vật nuôi trong nhà cũng có thể mang vi khuẩn salmonella..Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:KIATSI: đỏvàng, cókhông H2S, sinh hơikhông Urea (), Indol (), VP ()LDC (+), ONPG ()Thử nhiêm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh:(ngưng kết với ít nhất một trong hai kháng huyết thanh đa giá OMA, OMB)

PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

TRONG THỰC PHẨM

NỘI DUNG

Giới thiệu vi khuẩn Salmonella

Quy trình phân tích

Ví dụ Click to add title in here

1

2

3

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực trùng gram

âm, hô hấp hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào tử

Các loại thực phẩm đều yêu cầu phải kiểm nghiệm

Salmonella với tiêu chuẩn không phát hiện/25g (ml)

1,Giới thiệu vi khuẩn Salmonella

Xác định Salmonella

thông thường chỉ dừng

ở mức độ định tính, tên chủng chỉ được xác định trong những

trường hợp quan trọng

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml dung dịch BPW ủ

37°C, 18-24 giờ

Cấy 0.1ml canh khuẩn BPW sang RV, ủ 42°C, 18-24 giờ và sang Selenit cystein/TT, ủ 37°C /24 giờ

Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường

chọn lọc phân biệt XLD, HE, BS, SS…

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy sang canh BHI

hoặc thạch TSA, ủ qua đêm, 37°C

2.QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

• KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không

•Urea (-), Indol (-), VP (-)

•LDC (+), ONPG (-)

Thử nhiêm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh:

(ngưng kết với ít nhất một trong hai kháng huyết thanh

đa giá OMA, OMB)

Salmonella dương tính/ âm tính trên 25g (ml) thực phẩm

NGUYÊN TẮC

TĂNG SINH

TĂNG SINH CHỌN LỌC

KHẲNG

BƯỚC 1 BƯỚC 2 BƯỚC 4 BƯỚC 3

Qui trình phân tích Samonella gồm 4 bước:

Cân 25g mẫu đã nghiềng, hoặc hút 25 ml mẫu cho vào bình đã chứa sẵn 225ml dung dịch BPW và lắc đều để ở 370C trong

18 – 24 giờ

BƯỚC 1: TĂNG SINH

Hút 1ml canh khuẩn BPW sang môi trường

RV, muôi trong 24h ở 420C

Hút 1ml canh khuẩn BPW sang môi trường

selenit-cystin/TT, muôi trong 24h ở 370C

BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC

-Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên một đặc điểm phát triển của Salmonell

-Một số dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường này mà không thể tăng trưởng trong môi trường khác

Để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh chọn lọc

khác nhau cho cùng một mẫu

BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống

từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho

Salmonella như XLD, HE, BS

Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái của khuẩn lạc Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Môi trường

XLD

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu

hồng

Khẩn lạc đặc trưng của

Salmonella trên môi trường

XLD

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Môi trường

XLD

Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đén quá lớn bao trùm khuẩn lạc

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Khuẩn lạc đặc trưng

của Salmonella trên

môi trường HE

Môi trường BS

BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng

có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu

và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ

Khẩn lạc đặc trưng của

Salmonella trên môi

trường BS

Từ mỗi môi trường

phân lập cấy chuyển

LDC, saccharose, sorbitol

Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S

Jvgvn

phần nghiêng của môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng

Chỉ lên men được đường glucose trong môi trường TSI

Salmonella

xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường TSI

có khả năng H2S

Salmonella

THỬ NGHIỆM TSI/KIA

Cột thạch:

Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)

Màu đỏ hoặc không đổi màu:glucose âm tính (không lên men glucose0

Màu đen: tạo thành sunfua hidro

Có bọt khí hoặc có vết nứt:sinh khí từ glucose

THỬ NGHIỆM UREASE

Phát hiện VSV có mang enzym urease

Mục

đích

(NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2

 tăng pH môi trường  đỏ phenol

 (vàng – đỏ)

Cơ sở

sinh hoá

thạch nghiêng)

THỬ NGHIỆM UREASE

Môi trường Urea Broth

Ủ ở 37oC trong 48h

Quan sát

THỬ NGHIỆM UREASE

Thử nghiệm ure

Salmonella không phản ứng với ure nên không làm thay đổi pH môi trường Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu

Phản ứng dương tính việc phân giải ure sẽ sinh ra NH3 làm

thay đổi màu phenol red sang màu hồng và sau đó sang

màu tím hoa cà

Lấy một que cấy

đầy khuẩn lạc trên

môi trường TSA cấy

Salmonella phát triển sẽ làm đục và chuyển màu môi

trường sang tím hay đỏ tía, phản ứng dương tính

Phản ứng âm tính khi môi trường màu

vàng.

KẾT

QUẢ

Mục đích

Cở sở sinh hóa

Môi trường

Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính

(acetoin) trong quá trình lên men glucose

Methyl Red-Voges-Proskauer (MR-VP)

Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn

toàn 2 pyruvate → acetoin + 2 CO2.

Thử nghiệm VP

Thêm 2 giọt creatin , 6 giọt dd 1- naphthol trong cồn ,sau đó thêm 2 giọt KOH 40%

Ủ ở 37oC trong 24h

Lấy 0,2ml dịch cấy vào 1 ống nghiệm,

Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào các ống môi trường MR-VP

CÁCH TIẾN

HÀNH

Thử nghiệm VP

Salmonella cho phản ứng âm tính với thừ nghiệm VP ,

không đổi màu trên bề mặt môi trường

• Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi

trường

THỬ NGHIỆM SINH INDOL

Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol

 các VSV có hệ emzym tryptophanase

Mục đích

Chủng VSV MT canh trypton

Thuốc thử Kovac’s

Salmonella cho phản ứng

âm tính với thử nghiệm

Phản ứng dương tính khi có vòng

đỏ trên bề mặt môi trường

THỬ NGHIỆM SINH INDOL

Kết quả:

(a) An uninoculated tube of tryptone broth (b) A positive indole test (c) A negative

indole test

• ONPG → nitrophenol

o-Không màu Màu vàng

PHẢN ỨNG β-GALACTOSIDASE VỚI ONPG

Lactose agar

qua đêm ủ

37o C

Màu vàng

CÁCH TIẾN HÀNH

THỬ NGHIỆM β-GALACTOSIDASE VỚI ONPG

Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm

β-galactosidase

Phản ứng dương tính đổi máu môi trường sang vàng

PHẢN ỨNG β-GALACTOSIDASE VỚI ONPG

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Kiểm tra sự tự dính kết của các chủng

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Kiểm tra kháng nguyên O

Kiểm tra kháng nguyên

nguyên Vi

Nếu các vi khuẩn vón lại thành các đơn vị ít

nhiều có kết dính thì chủng này được coi là

tự kết dính, không cần phải thử tiếp vì việc

phát hiện kháng nguyên không thể thực hiện

Lắc nhẹ phiến kính trong 30-

60 giây

Quan sát

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Kiểm tra sự tự dính kết của các chủng

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Sử dụng một khuẩn lạc thuần khiết

không tự ngưng kết

Tiến hành như phương pháp kiểm

tra sự tự dính ở trên bằng cách thay

một giọt kháng huyết thanh O thay

cho dung dịch muối

Kiểm tra kháng nguyên O

Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng được coi là dương tính

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Tiến hành như phương pháp kiểm tra sự kết

dính bằng cách thay một giọt huyết thanh Vi

thay cho dung dịch nước muối

Nếu xuất hiện kết dính, phản ứng coi là

dương tính

Kiểm tra kháng nguyên Vi

Cấy từ 1 khuẩn lạc không tự

dính kết thuần khiết lên thạch

dinh dưỡng thể nữa dặc Ủ ấm 18-24 giờ, 37+- 10C

Kiểm tra kháng nguyên H

THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH

Tiến hành như phương pháp kiểm tra sự tự dính kết,nhưng sử dụng một giọt huyết thanh H thay cho dung dịch nước muối sinh lý

Nếu xuất hiện kết dính, phản ứng coi là dương tính

3.VÍ DỤ

 Nghiên cứu và phát hiện Salmonella trên một số mẫu thịt

gà tươi sống trên địa bàn hai quận Phú Nhuận và Bình Thạnh thành phố Hồ Chí Minh

25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong

30 giây độ pha loãng 10-1

Đem ủ ở 37oC trong 24 giờLấy 0.1ml canh trường cho vào môi trường RV

Ủ ở 42oC ± 0,5 trong 24 giờ

Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 37 oC

trong 24 giờ

KL đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD : tròn,

lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ

Cấy chuyển vào môi trường test sinh hóa : môi trường TSI, Manitol phenol red, Urea, LDC,

Trypton, VP

Biểu hiện đặc trưng của Salmonella : trên TSI:

đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+)/; Manitol(+); Urea(-);

LDC(+); Indol(-); VP(-)

Ủ ở 37oC trong 24 giờ

Chuẩn

bị mẫu

Cấy mẫu.

Thử nghiệm khẳng định Kết quả

Chuẩn bị mẫu

Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không

lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), cho vào

bao nilong vô khuẩn

Thêm vào 225ml môi trường PBW đã

-Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD

-Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.

Cấy mẫu

- Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào

ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV

- Ủ ở 42 ± 0,5 oC trong 24 giờ.

Tăng sinh Tăng sinh

phân lập

Khuẩn lạc đặc trưng của

Salmonella

Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi

trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc và ủ ở

37 ± 0,5oC trong 24 giờ

Thử nghiệm khẳng định.

- Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa

Thử nghiệm

Lên men mannitol

Thử nghiệm trên môi trường TSI Thử nghiệm Urea Broth

Thử nghiệm LDC Thử nghiệm khả năng sinh Indol Thử nghiệm Voges – Proskauer

Thử nghiệm trên môi trường thạch TSI

Thử nghiệm Urea Broth

Salmonella không phân giải urea nên không làm

thay đổi pH môi trường Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu tím

Lên men mannitol

 Môi trường sử dụng là môi trường phenol red broth base có pH 7.4,

 Chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8

Môi trường sau khi nuôi cấy salmonella

bị acid hóa và chuyển thành màu vàng

Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống Durnham

Sinh acid (+):

môi trường màu cam chuyển sang vàng

Lên men Mannitol

Sau khi nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành

kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu

Thử nghiệm LDC

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Cấy VSV thử nghiệm qua

môi trường canh trypton ủ

khoảng 24 giờ ở 37oC.

Nhỏ vài giọt ether để kéo

indol lên bề mặt môi trường,

thêm vài giọt Kovac’s

Thử nghiệm Indol

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Thử nghiệm Voges – Proskauer

Description of the contents

Description of the contents

Description of the contents

Nhận định tính sinh hoá đặc hiệu

Tính chất sinh hoá Dương hoặc âm tính Tỷ lệ % với vi khuẩn

Lên men mannitol +

KẾT QUẢ

Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với

quy đinh mức độ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25g

Thank You!