ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM Nhóm GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ L/O/G/O NỘI DUNG Giới thiệu vi khuẩn Salmonella Quy trình phân tích Ví dụ Click to add title in here 1,GIỚI THIỆU VI KHUẨN SALMONELLA Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực khuẩn gram âm, hơ hấp hiếu khí kị khí tùy ý, có khả di động, không tạo bào tử Các loại thực phẩm yêu cầu phải kiểm nghiệm Salmonella với tiêu chuẩn không phát hiện/25g (ml) 1,GIỚI THIỆU VI KHUẨN SALMONELLA Nơi sống Salmonella loại vi khuẩn sống ống ruột người động vật khác Bất phẩm tươi có nguồn gốc động vật thịt lợn, thịt gia cầm, sữa sản phẩm sữa, trứng, hải sản với số rau, chứa salmonella Nguồn lây ngồi thực phẩm Động vật ni nhà mang vi khuẩn salmonella Nguồn chứa Xác định Salmonella thông thường dừng mức độ định tính, tên chủng xác định trường hợp quan trọng 2.QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Đồng 25g mẫu 225ml dung dịch BPW ủ 37C, 18-24 Cấy 0,1 ml canh khuẩn BPW sang RV (10ml) , ủ 42C, 18-24 sang Selenit cystein/TT, ủ 37C / 24 Phân lập khuẩn lạc đơn mơi trường chọn lọc phân biệt XLD, HE, BS, SS… Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang canh BHB thạch TSA, ủ qua đêm, 37C Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả: • KIA/TSI: đỏ/vàng, có/khơng H2S, sinh hơi/khơng •Urea (-), Indol (-), VP (-) •LDC (+), ONPG (-) Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh: (ngưng kết với hai kháng huyết đa giá OMA, OMB) Salmonella dương tính/ âm tính 25g (ml) thực phẩm NGUYÊN TẮC Qui trình phân tích Samonella gồm bước: TĂNG SINH TĂNG SINH CHỌN LỌC BƯỚC BƯỚC BƯỚC BƯỚC KHẲNG ĐỊNH PHÂN LẬP BƯỚC 1: TĂNG SINH Cân 25g mẫu nghiền, hút 25 ml mẫu cho vào bình chứa sẵn 225ml dung dịch BPW lắc để 370C 18 – 24 BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC Hút 0,1 ml canh khuẩn BPW sang môi trường RV, nuôi 24h 420C Hút 0,1ml canh khuẩn BPW sang môi trường selenit-cystin/TT, nuôi 24h 370C Cấy chuyển vào môi trường test sinh hóa : mơi trường TSI, Manitol phenol red, Urea, LDC, Trypton, VP Ủ 37oC 24 Biểu đặc trưng Salmonella : TSI: đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+)/; Manitol(+); Urea(-); LDC(+); Indol(-); VP(-) Các bước tiến hành Chuẩn bị mẫu Kết Cấy mẫu Thử nghiệm khẳng định Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy chất lỏng có), cho vào bao nilong vô khuẩn Thêm vào 225ml môi trường PBW hấp khử trùng để nguội Tiến hành đồng mẫu độ pha loãng 10-1 Đem ủ nhiệt độ 370C 24 Chuẩn bị mẫu Cấy mẫu Tăng sinh -Cấy - Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml mơi trường tăng sinh chọn lọc RV - Ủ 42 ± 0,5 oC 24 mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD phân lập -Ủ nhiệt độ 370C 24 Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc ủ 37 ± 0,5oC 24 Thử nghiệm khẳng định - Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang môi trường thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm mơi trường TSI Thử nghiệm Urea Broth Lên men mannitol Thử nghiệm LDC Thử nghiệm khả sinh Indol Thử nghiệm Thử nghiệm môi trường thạch TSI Thử nghiệm Urea Broth Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường Sau ni cấy mơi trường giữ ngun màu tím Lên men mannitol  Môi trường sử dụng mơi trường phenol red broth base có pH 7.4,  Chỉ thị mơi trường phenol red có màu đỏ chuyển thành màu vàng pH < 6.8 -Tiến hành -Khả lên cấy vào men chủng ống môi đánh giá trường dựa vào chủng VSV sinh acid cần khẳng sinh định Ủ 370C 18 – 24h Sinh acid (+): môi trường màu cam chuyển sang vàng Sinh (-): có bọt khí ống Durnham Mơi trường sau ni cấy salmonella bị acid hóa chuyển thành màu vàng Thử nghiệm LDC Mục đích: cắt nhóm carboxyl khỏi gốc lysine Phản ứng (+): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục Phản ứng (-): mơi trường từ tím chuyển sang vàng Sau nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu Thử nghiệm LDC Thử nghiệm khả sinh Indol Positive Negative Negative Thử nghiệm Indol KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHIỄM SALMONELLA Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với quy đinh mức độ nhiễm Salmonella CFU/25g The End & Thank You! L/O/G/O ... sinh hóa cho kết quả: • KIA/TSI: đỏ/vàng, có/khơng H2S, sinh hơi/khơng •Urea (-) , Indol (-) , VP (-) •LDC (+), ONPG (-) Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh: (ngưng kết với hai kháng huyết... acetoin + CO2 Môi trường Methyl Red-Voges-Proskauer (MR-VP)  Thử nghiệm VP CÁCH TIẾN HÀNH Hòa vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc môi trường TSA vào ống môi trường MR-VP Ủ 37oC 24h Lấy 0,2ml dịch cấy... khuẩn BPW sang môi trường selenit-cystin/TT, nuôi 24h 370C BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC -Mỗi loại mơi trường có tác dụng chọn lọc dựa đặc điểm phát triển Salmonella -Một số dòng tăng trưởng mơi trường