BÁO CÁO PHƢƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Ngộ độc thực phẩm ở các nƣớc đang phát triể n hiện đang ở mức báo động. Đặc biệt tình trạng ngộ độc tập thể đang ngày càng có xu hƣớng gia tăng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM BÁO CÁO PHƢƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH VI SINH TRONG THỰC PHẨM I Giới thiệu Ngộ độc thực phẩm nƣớc phát triển mức báo động Đặc biệt tình trạng ngộ độc tập thể ngày có xu hƣớng gia tăng Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm, chiếm 55,8% số đến từ lồi vi sinh vật nhƣ Staphylococcus aureus, Coliform, E Coli… Chỉ tính riêng Việt Nam, hàng năm tổn thất ngộ độc thực phẩm lên đến 30 tỷ đồng Nắm bắt đƣợc tình hình thực tế, tuần tháng vừa qua ( từ 16/05 đến 21/05/2011) khoa Sinh học tiến hành cho sinh viên thực nghiệm phƣơng pháp để kiểm định vi sinh thực phẩm nhằm giúp sinh viên thực hành phƣơng pháp kiểm định gia tăng kiến thức trình tiếp cận với phƣơng pháp thực tế II Mẫu thực phẩm Tên mẫu: thịt heo tƣơi Ngày thu: 16/05/2011 Nơi thu: Khu chợ- ĐHKHXH & NV III Tiêu chuẩn kiểm nghiệm: TCVN 7046 : 2002 Thịt tƣơi- quy định kỹ thuật IV Kết kiểm định Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc 1(g) mẫu (TPC) 1.1 Quy trình định lượng VŨ THÙY LINH 0715174 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM 1.2 Kết đếm khuẩn lạc Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N ( CFU) -4 10 >300 -5 10 >300 -6 10 323 358 1.3 Kết luận - Kết quả: Tổng số vi sinh vật hiếu khí (g) mẫu lớn 3x106 CFU/g VŨ THÙY LINH 0715174 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM 1.4 - - - Kết luận: Tổng số vi sinh vật hiếu khí (g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép tiêu chuẩn Việt Nam (106 CFU/g) Mở rộng Phƣơng pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc phƣơng pháp phổ biến đƣợc sử dụng rộng rãi để định lƣợng vi sinh vật, cụ thể định lƣợng vi sinh vật hiếu khí có mẫu thực phẩm Trong thực tập mẫu đƣợc tiến hành pha loãng lên đến 10-4 , 10-5 , 10 -6 đƣợc xem nồng độ tƣơng đối loãng để tiến hành nuôi cấy môi trƣờng PCA Kết đếm khuẩn lạc lớn 300 Từ ta thấy mẫu thịt tƣơi nhiễm nhiều vi sinh vật hiếu khí Nhiều chủng loại khác Về thịt tƣơi thực phẩm dễ bị nhiễm vi sinh vật có đầy đủ phẩm chất giúp vi sinh vật tồn phát triển nhƣ t0, pH, độ nƣớc, thành phầm dinh dƣỡng…Quá trình nhiễm chế biến, gia nhiệt chƣa tới hạn, nhiễm từ dụng cụ chế biến, vật chứa từ khơng khí, đất Giải pháp: Cần giữ q trình chế biến thịt tƣơi Khơng dùng thiết bị bẩn để đựng thịt, vùng chế biến phải thoáng, tránh xa cống rãnh vùng rác thải Xử lý phế phẩm không dùng đến Quá trình bảo quản vận chuyển phải giữ nhiệt độ theo yêu cầu để tránh ảnh hƣởng đến chất lƣợng thịt tƣơi Hình 1: Tổng số vi sinh vật hiếu khí mơi trƣờng PCA nồng độ 10-6 Coliform tổng số (g) mẫu (C) 2.1 Quy trình định lượng VŨ THÙY LINH 0715174 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM 2.2 Kết đếm khuẩn lạc ống sinh Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N ( CFU) -4 10 50 15 - Số đĩa pha loãng nồng độ: n= VŨ THÙY LINH 0715174 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM - Thể tích cấy vào đĩa: V=1ml Tỷ lệ xác nhận: R= số khuẩn lạc sinh ống BGBL/tổng số khuẩn lạc đem cấy=1 ( năm ống sinh hơi) N NxVxF 2.3 2.4 xR C = 32,5 x 104 ( CFU/g) Kết luận - Coliform tổng số / g mẫu thịt tƣơi 32,5 x 104 CFU/g - Kết luận: Coliform tổng số 1(g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép theo TCVN 102 CFU Mở rộng - Môi trƣờng VRB không hấp vô trùng nhƣ môi trƣờng khác, mà đƣợc cân vơ trùng Đun lị vi ba cho tan hết giữ nhiệt 450C - Môi trƣờng BGLB Mật bò bile) brilliant green ức chế hầu hết vi khuẩn gram vi khuẩn gram– Coliform Brilliant green có nồng độ đặc hiệu nhằm ngăn vi khuẩn kị khí lên men lactose sinh trƣởng 44 0C , Tránh đƣợc tƣợng dƣơng giả, lúc Coliform phát triển làm đục mơi trƣờng sinh khí ống durham lên men lactose - Vì đặc tính nhóm Coliform có khả lên men lactose sinh môi trƣờng nuôi cấy lỏng Do q trình định lƣợng Coliform tổng số ta sử dụng môi trƣờng BGBL để quan sát khả sinh Coliform từ khẳng định có xuất Coliform mẫu Trong thực tập kết cho ta thấy ống BGBL có cấy khuẩn lạc Coliform sinh - Coliform đƣợc xem vi sinh vật thị số lƣợng chúng diện mẫu thị khả diện vi sinh vật gây bệnh khác thực phẩm Sự diện Coliform mẫu thịt tƣơi lớn điều cho thấy diện vi sinh vật gây bệnh khác mẫu thịt tƣơi lớn - Khuẩn lạc có màu đỏ đỏ đậm màu môi trƣờng thêm tủa quầng muối mật có mơi trƣờng VŨ THÙY LINH 0715174 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Hình 2: Khuẩn lạc Coliform mơi trƣờng VRB Quy trình định tính Escherichia Coli giả định 3.1 Quy trình định tính VŨ THÙY LINH 0715174 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM 3.2 - Kết luận Kết quả: Phản ứng thử Indol dƣơng tính Xuất vịng màu hồng mặt dung dịch Kết luận: Phát E Coli giả định 1(g) mẫu VŨ THÙY LINH 0715174 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Mở rộng Thuốc thử sử dụng phản ứng Indol Kovac’s Cơ chất tham gia phát Indol mơi trƣờng nuôi cấy p-dimethyaminobanzaldehyde Chất phản ứng với indol tạo thành phức hợp màu đỏ nhân pyrol indol phản ứng với nhóm ahdehyde DMAB tạo thành nhân quinone có màu đỏ - E.coli đƣợc xem nhƣ vi sinh vật thị môi trƣờng ô nhiễm phân hay chất thải Ngƣời ta thƣờng xác định diện E.coli để kiểm tra xem mẫu thực phẩm có bị nhiễm bẩn từ mơi trƣờng hay thơng qua nguồn nƣớc hay khơng Quy trình định lượng Staphylococcus aureus 4.1 Quy trình định lượng 3.3 - VŨ THÙY LINH 0715174 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM 4.2 - 4.3 4.4 - - - Kết Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N (CFU) -3 10 21 14 Số ống huyết tƣơng đông tụ Tỷ lệ xác nhận: R= Số khuẩn lạc đông tụ huyết tƣơng/ tổng số khuẩn lạc cấy = 4/5 N xR NxVxF C = 14 x 103 (CFU/g) Kết luận Staphylococcus aureus có (g) mẫu 14 x 103 CFU/g Kết luận: Staphylococcus aureus (g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép TCVN: 102 CFU/g Mở rộng Thành phần mơi trƣờng BPA có lithium chloride tellurite có tác dụng ức chế quần thể vi khuẩn thƣờng diện Staphylococcus pyruvate glycine kích thích phát triển Staphylococcus Khuẩn lạc Staphylococcus có hai đặc điểm: Khuẩn lạc có màu đen khử telurite thành telurium, dạng lồi tạo vòng xung quanh khuẩn lạc,đƣờng kính từ – mm thủy phân protein Sau xuất vịng đục vịng có tác động lecithinase, loại lipase) Đây đặc tính thƣờng thấy có tính chun biệt tụ cầu khuẩn gây bệnh Coagulase enzyme đƣợc tạo S.aureus, enzyme liên quan đến khả bền nhiệt, bền đến 600C 30 phút Enzyme protein tự nhiên, đƣợc S.aureus tiết tế bào, dễ bị bất hoạt protease Coagulase đóng vai trị đơng tụ huyết tƣơng, chúng kết hợp với cấu tử huyết tƣơng thành khối hay cục Ứng dụng nguyên tắc ngƣời ta sử dụng huyết tƣơng thỏ để tiến hành phản ứng định lƣợng Staphylococcus aureus Sự diện mật độ cao S aureus thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh kiểm sốt nhiệt độ q trình chế biến VŨ THÙY LINH 0715174 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Hình 3: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus VŨ THÙY LINH 0715174 10 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Định tính Samonella 25 (g) mẫu 5.1 Quy trình định tính VŨ THÙY LINH 0715174 11 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM 5.2       Kết Thử nghiệm KIA: Đối chứng: Trên đỏ dƣới vàng, có vệt đen nứt thạch Mẫu: Không đổi màu môi trƣờng màu đỏ), không nứt thạch không xuất vệt đen Thử nghiệm LDC: Đối chứng: Môi trƣờng LDC giữ ngun màu tím (+) Mẫu: Mơi trƣờng LDC giữ nguyên màu tím (+) Thử nghiệm Manitol Phenol Red Broth: Đối chứng: Môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang vàng (+) Mẫu: Môi trƣờng giữ nguyên màu đỏ (-) Thử nghiệm Urea Broth: Đối chứng: Môi trƣờng giữ nguyên màu hồng nhạt (-) Mẫu: Môi trƣờng giữ nguyên màu hồng nhạt (-) Thử nghiệm Canh Trypton: Đối chứng: Không xuất vịng màu hồng (-) Mẫu: Khơng xuất vịng màu hồng (-) Kết luận: Không phát Samonella 25 (g) mẫu Mở rộng Salmonella trực trùng gram âm, hiếu khí kị khí tùy ý, có khả di động không tạo bào tử, lên men glucose mannitol sinh acid nhƣng không lên men saccharose lactose, khơng sinh Indole, khơng phân giải ure, khơng có khả tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết chủng sinh H2S Salmonella phân tích định tính mộ quy trình gồm bƣớc: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập khẳng định Salmonella thƣờng có mặt mẫu với số lƣợng nhỏ, bị tổn thƣơng diện chung với số lƣợng lớn với loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh ức chế tăng trƣởng Salmonella Vì mơi trƣờng KIA lƣợng đƣờng chiếm 1% lactose 0,1% glucose thuốc thử phenol red Do sau lên men glucose hết Samonella bắt đầu sử dụng đến pepton môi trƣờng, q trình trao đồi làm giải phóng NH3, làm kiềm hóa mơi trƣờng phần nghiêng có màu đỏ Ở phần sâu mơi trƣờng có pH acid lên 5.3 VŨ THÙY LINH 0715174 12 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM men kỵ khí glucose, sản phẩm thu đƣợc acid hữu cơ, làm cho mơi trƣờng chuyển thành màu vàng Khi enzyme lisine decarboxylase tác động lên amino acid L- lisin khử nhóm carboxyl, chúng tạo thành amin CO2 làm kiềm hóa mơi trƣờng Tiến hành thử phản ứng LDC để xác định khả tổng hợp enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ acid amin Nếu sau nuôi cấy mơi trƣờng chuyển màu vàng âm tính, giữ ngun màu ban đầu dƣơng tính Từ kết ta thấy Samonella vi sinh vật tổng hợp nhóm enzyme khử nhóm carboxyl tách hydrogen từ acid amin môi trƣờng giữ nguyên màu tím (+) Vi khuẩn Samonella có khả lên men đƣờng manitol sinh acid có thuốc thử phenol red làm môi trƣờng chuyển từ đỏ sang vàng Samonella có khả lên men đƣờng manitol mơi trƣờng ống đối chứng chuyển từ đỏ sang vàng Emzyme urease enzyme quan trọng tế bào vi sinh vật Khi có chất urea diện mơi trƣờng, enzyme đƣợc tổng hợp phóng thích bên ngồi tế bào xúc tác phản ứng thủy giải urea Sản phẩm sau phản ứng làm cho mơi trƣờng hóa kiềm chuyển sang màu đỏ Samonella khơng có khả sinh enzyme urease phân giải ure mơi trƣờng giữ ngun màu Tryptophan aminoacid bị oxy hóa số vi sinh vật định tạo hợp chất indol Sự tách amin từ tryptophan phản ứng khử Qua trình nhóm amin đƣợc tách chuyển thành NH3 DMAB môi trƣờng nuôi cấy phản ứng với indol tạo màu đị Samonella khơng có khả tách nhóm amin từ tryptophan khơng sinh indol Phản ứng thử indol âm tính (-) khơng phát sinh vịng màu đỏ Hình 3: Hình dạng khuẩn lạc Samonella VŨ THÙY LINH 0715174 13 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Mục lục: Giới thiệu I II Mẫu thực phẩm 1 Tên mẫu: thịt heo tƣơi Ngày thu: 16/05/2011 Nơi thu: Khu chợ- ĐHKHXH & NV III Tiêu chuẩn kiểm nghiệm: IV Kết kiểm định 1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc 1(g) mẫu (TPC) 1.1 Quy trình định lƣợng 1.2 Kết đếm khuẩn lạc 1.3 Kết luận 1.4 Mở rộng Coliform tổng số (g) mẫu (C) 2.1 Quy trình định lƣợng 2.2 Kết đếm khuẩn lạc ống sinh 2.3 Kết luận 2.4 Mở rộng Quy trình định tính Escherichia Coli giả định 3.1 Quy trình định tính 3.2 Kết luận VŨ THÙY LINH 0715174 14 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM 3.3 Mở rộng Quy trình định lƣợng Staphylococcus aureus 4.1 Quy trình định lƣợng 4.2 Kết 4.3 Kết luận 4.4 Mở rộng Định tính Samonella 25 (g) mẫu 11 5.1 Quy trình định tính 11 5.2 Kết 12 5.3 Mở rộng 12 VŨ THÙY LINH 0715174 15 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 16 ... KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM 1.4 - - - Kết luận: Tổng số vi sinh vật hiếu khí (g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép tiêu chuẩn Vi? ??t Nam (106 CFU/g) Mở rộng Phƣơng pháp. .. Phƣơng pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc phƣơng pháp phổ biến đƣợc sử dụng rộng rãi để định lƣợng vi sinh vật, cụ thể định lƣợng vi sinh vật hiếu khí có mẫu thực phẩm Trong thực tập mẫu đƣợc tiến hành pha... NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Hình 2: Khuẩn lạc Coliform mơi trƣờng VRB Quy trình định tính Escherichia Coli giả định 3.1 Quy trình định tính VŨ THÙY