CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG DƯ THUỐC KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM

Hiện đã biết trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện

Trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM

Khoa kỹ Thuật Hóa học

Bộ môn công nghệ thực phẩm

BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG DƯ THUỐC KHÁNG SINH

TRONG THỰC PHẨM

GVHD : TS Vũ Ngọc Hòa

Trương Đờ Kháng 60901168

TP HCM 12/2011

Mục lục

Lời nói đầu 6

I Tổng quan về chất kháng sinh 6

1.1 Định nghĩa 6

1.2 Khái niệm về chất kháng sinh [1] 6

1.3.1 Tác dụng của chất kháng sinh 6

1.5 Phân loại thuốc kháng sinh [4] 9

1.6 Sản xuất thuốc kháng sinh 10

1.7 Mặt trái của thuốc kháng sinh 10

1.8 Một số thuốc kháng sinh thường gặp 12

1.8.1 Thuốc kháng sinh họ fluoroquinolone [10] 12

1.8.2 Chloramphenicol [13] 15

1.8.3 Penicillin [13] 19

II Các phương pháp xác định hàm lượng chất kháng sinh trong thực phẩm 21

2.1 Dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng kít elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC – MS/MS [5] 21

2.1.1 Giới thiệu 21

2.1.2 Đối tượng 22

2.1.3 Phương pháp phân tích 22

2.1.4 Phân tích – nhận xét 23

2.2 Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh streptomycin [7] 25

2.2.1 Đặc tính chung 25

2.2.2 Nguyên tắc 26

2.2.3 Lấy mẫu 26

2.2.4 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất 26

2.2.5 Tiến hành thử 28

2.3 Phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm bằng phương pháp ELISA [15] 29 2.3.1 Nguyên liệu 29

2.3.2 Phương pháp 30

2.3.3 Kết quả 31

2.3.4 Khả năng phát hiện của kít 32

2.3.5 Độ đặc hiệu, tính chọn lọc và độ xác thực của phương pháp 33

2.3.6 Kết luận 34

2.4 Phương pháp kiểm tra nhanh Chloramphenicol [6] 34

2.4.1 Mục đích 34

2.4.2 Tóm tắt 34

2.4.3 Nguyên lí 34

2.4.4 Lưu ý 35

2.4.5 Bảo quản và độ ổn định 35

2.4.6 Thiết bị 35

2.4.7 Xử lí mẫu 35

2.4.8 Quy trình thực hiện 35

2.4.9 Đọc kết quả 36

2.4.10 Kiểm soát chất lượng 37

2.4.11 Hiệu suất 37

2.5 Phương pháp định lượng Sulfonamit trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [16] 37

2.5.1 Phạm vi áp dụng 37

2.5.2 Phương pháp tham chiếu 38

2.5.3 Nguyên tắc 38

Tài liệu tham khảo 43

Mục lục hình ảnhHình 1.1: Penicillin G

Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh trên vi khuẩn

Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone

Hình 1.4 Cân bằng Acid Base của nhóm Acidic Quinolone

Hình 1.5 Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl Quinolone

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin

Hình 1.8 Công thức phân tử chung của họ chloramphenicol

Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp chloramphenicol từ acid shikimic

Hình 1.10 Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum

Bảng 1.2 Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của

phương pháp phân tích một số kháng sinh cấm

Bảng 2.1 Tổng hợp kết quả phân tích sàng lọc CAP trên ELISA và khẳng định trên LC-MS/MS Bảng 2.2 Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dương giả

Bảng 2.3 Kết quả phân tích kiểm tra đường chuẩn

Đồ thị 2.4 Đường chuẩn

Bảng 2.5 Khả năng phát hiện của phương pháp ở nồng độ giới hạn phát hiện và giới hạn nồng

độ tối đa cho phép theo Quyết định 2377/90 CE của Uỷ ban Châu Âu đối với một số Quinolone Bảng 2.6 Các tham số độ mạnh của phương pháp đối với các quinolone được thử tại ngưỡng phát hiện tối thiểu

Bảng 2.7: Chương trình pha động

Lời nói đầu

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, vi sinh vật học công nghiệp một nhánh có vai trò hết sức trọng yếu trong ngành công nghệ sinh học đã thu được rất nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất sinh khối, dược phẩm, các chất điều vị thực phẩm sử dụng trongcông nghiệp, y, dược học, nông nghiệp nhờ vi sinh vật – bộ máy sản xuất sinh khối kì diệu

-Hiện đã biết trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện Trong tương lai chắc chắn còn có nhiều chất kháng sinh khác nữa cũng sẽ được tìm ra vì đa số các vi sinh vật có khả năng tạo thành chất kháng sinh đã được nghiên cứu cho tới nay đều chỉ thuộc về các chi Streptomyces và Bacillus Nhiều nhà nghiên cứu về các chấtkháng sinh tin rằng sẽ có nhiều chất kháng sinh mới được phát hiện nếu tìm thêm ở các nhóm vi sinh vật khác Mặt khác các kỹ thuật của công nghệ di truyền sẽ cho phép thiết kế một cách nhântạo các chất kháng sinh mới khi mà các chi tiết về bản đồ gen của các vi sinh vật sản sinh chất kháng sinh đã được biết rõ

Ngày nay, chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp như chăn nuôi, trồng trọt, nuôi trồng thủy hải sản, có tác dụng rất lớn là giúp cho vật nuôi trồng chống lại bệnh tật từ vi sinh vật Tuy vậy, chất kháng sinh như một con dao hai lưỡi Một mặt giúp sinhvật chông lại bệnh tật, mặt khác, có thể làm cho sinh vật xuất hiện phản ứng phụ, và đặc biệt là lượng chất kháng sinh tồn dư sinh vật có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm, nhất là sức khỏe người tiêu dùng

Với một lượng thực phẩm khổng lồ từ động vật đang được tiêu thụ trên thị trường, song ít ai nghĩ đến việc mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đang phải tích lũy… dần dần dư lượng chất kích thích tăng trọng và thuốc kháng sinh trong từng miếng thịt động vật của các loại sản phẩm này Bởi trong chăn nuôi gia súc, gia cầm hiện nay, người dân sử dụng rất tùy tiện các loại thức

ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chóng lớn Hậu quả là dư lượng chất kích thích và thuốc kháng sinh trong thịt gia súc, gia cầm vượt ngưỡngcho phép gấp nhiều lần, tuy không gây ngộ độc cấp tính tức thời, nhưng sẽ gây nguy hại về lâu dài cho sức khỏe của người tiêu dùng

I Tổng quan về chất kháng sinh

1.1 Định nghĩa

1.2 Khái niệm về chất kháng sinh [1]

Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp

độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn

Từ "antibiotics" (kháng sinh) có nguồn gốc từ chữ "antibiosis" "anti" có nghĩa là

"chống lại" và "biosis" có nghĩa là "cuộc sống" Chất kháng sinh tác động, chống lại một số loại

vi khuẩn Thật vậy, chất kháng sinh là chất hoá học lấy từ cơ thể các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, hoặc một vài thực vật

1.3.1 Tác dụng của chất kháng sinh

Thuốc kháng sinh là những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa

Thời đại chất kháng sinh bắt đầu vào khoảng năm 1928 cùng với việc khám phá các loạiPenicillin của bác sĩ Alexandra Flemning Flemning đã đặt tên cho chất Penicillin Chất kháng sinh này rất hữu hiệu cho việc điều trị các bệnh như viêm phổi, họ , viêm cuống họng, mụn mũ, đau nhức, v.v Streptomycin là một chất kháng sinh khác được dùng để điều trị bệnh lao phổi Ngoài ra còn có những chất kháng sinh khác như ampicilin, tetracyclin, chloromycetin, v.v được dùng để trị những căn bệnh khác Một vài loại kháng sinh rất hữu hiệu trong việc chống lạimột số vi sinh vật, vài loại khác hữu hiệu trong việc chống lại các vi sinh vật ở phạm vi lớn đượcgọi là chất kháng sinh phổ rộng [1]

Hình 1.1: Penicillin G

Mỗi năm hàng triệu bệnh nhân trên thế giới được chữa trị nhờ chất kháng sinh Năm

1930, 20% đến 85% tổng số tử vong ở Mỹ là do bệnh lao phổi Năm 1960 con số này giảm xuống còn 5% Tương tự, số tử vong do sốt thương hàn gây ra đã giảm từ 10% đến 2% Các bệnh truyền nhiễm cũng đỡ đi nhiều nhờ chất kháng sinh Chất kháng sinh cũng hữu dụng trong việc ngăn ngừa những căn bệnh như nhiễm trùng cuống họng, bệnh sốt gây đau nhức các khớp xương và các bệnh lây qua đường tình dục, v.v [1]

1.4 Cơ chế động của chất kháng sinh [3].

Khi một chất kháng sinh được đưa vào cơ thể, nó sẽ giết chết các vi khuẩn gây bệnh Kháng sinh diệt trùng bằng nhiều cách:

 Ức chế sự thành lập vách tế bào: Ngăn cản sự tổng hợp thành của tế bào vi trùngnhư penicillin, cephalosporin, vancomycin

 Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào

 Ức chế sự chuyển hoá của vi trùng như sulfamides, trimethoprim,

 Ức chế sự tổng hợp protein: Ức chế sự tổng hợp protein của vi trùng như tetracyclin, aminoglycosides, macrolides (erythromycin…),

 Ức chế sự tổng hợp acid nucleic: Ức chế sự tổng hợp và hoạt động của acid nucleic như fluoroquinolones và rifampicin

Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh trên vi khuẩn

Ví dụ về cơ chế của việc ức chế sự tổng hợp protein Aminoglycosides : Streptomycin

 GĐ 1: Thuốc gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30S

 GĐ 2 : Phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên trong quá trình thành lập chuỗi peptid

 GĐ 3 : Thông tin mRNA bị đọc sai à 1 acid amine không phù hợp

 GĐ 4 : Làm vỡ các polysomes thành monosomes à không có chức năng tổng hợpprotein

Kháng sinh chống lại vi khuẩn bằng cách làm hư hại thành phần cấu tạo của chúng như lớp vỏ bảo vệ, màng trao đổi chất v.v Tuy nhiên, trong phương diện điều trị, người ta quan tâmđến hai loại tác dụng: tác dụng diệt khuẩn và tác dụng kìm khuẩn (kìm khuẩn có khi còn được gọi là hãm khuẩn, trụ khuẩn, tĩnh khuẩn) Kháng sinh diệt khuẩn có tác dụng giết chết vi khuẩn, còn kháng sinh kìm khuẩn chỉ làm cho vi khuẩn ngưng phát triển, không sinh sản chứ không bị tiêu diệt Kháng sinh kìm khuẩn được dùng khi cơ thể người bệnh còn sức đề kháng, hệ thống miễn dịch còn đủ mạnh để tiêu diệt vi khuẩn đã bị thuốc làm cho yếu đi Nếu cơ thể người bệnh quá yếu, bắt buộc phải dùng các loại kháng sinh diệt khuẩn

1.5 Phân loại thuốc kháng sinh [4].

 Nhóm β lactam các penicilin: Penicilin, Methicilin, Ampicilline, Amoxicilline,

Cloxacilline, Sultamicillin, Piperacilline, Imipenem

 Nhóm licosamid: Lincomycin, Clindamycin

 Nhóm quinolon: Acid nalidixic, lomefloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin, levofloxacin, Gatifloxacin, Moxifloxacin, Pefloxacin, Sparfloxacin

 Nhóm 5-nitro-imidazol: Clotrimazole, Metronidazole, Tinidazole, Secnidazole,

Miconazole, ornidazole

 Nhóm Sulfamid: Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol, Sulfadiazin, Sulfasalazin

1.6 Sản xuất thuốc kháng sinh

Hầu hết các kháng sinh đều được làm từ vi khuẩn và nấm

 Penicillin được sản xuất từ nấm mốc, vi sinh vật

 Kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis

 Cloramphenicol ban đầu được phân lập từ Streptomyces venezuaelae, nay được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp

 …

1.7 Mặt trái của thuốc kháng sinh

Với nhiều tác dụng có ý nghĩa thực tiễn như thế vậy phải chăng việc sử dụng càng nhiềuthuốc kháng sinh sẽ càng đem lại nhiều tác dụng tích cực?

Cơ thể người thường bị dư thuốc kháng sinh khi sử dụng không đúng thuốc hoặc do lượng kháng sinh còn tồn dư trong thực phẩm Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách Lạm dụng hoặc chưa hợp lý, dẫn đến những hậu quả khôn lường Không những chi phí tiền thuốc tăng do sử dụng nhiều loại kháng sinh đắt tiền mà còn làm nhiều loại kháng sinh mới dần dần bị vô hiệu hóa

Chất kháng sinh cũng có những phản ứng phụ, tạo ra phản ứng của cơ thể đối với chất kháng sinh chẳng hạn như chứng ban đỏ và các triệu chứng khác có thể gây ra những căn bệnh khác Phản ứng trầm trọng nhất là dẫn tới tử vong Đôi khi, chất kháng sinh không có hữu hiệu đối với một số vi khuẩn mầm bệnh

Phó khoa Vệ sinh Trung tâm Y tế dự phòng TPHCM, khẳng định kháng sinh thuộc dạnghóa chất nên phần lớn không phân hủy được trong môi trường nhiệt độ như nấu nướng

Theo một tài liệu của Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Đại Học Bách Khoa TP HCM, lượng kháng sinh tồn dư trong gia súc, gia cầm cao sẽ chuyển hóa protein thành các histamins gây chứng nhức đầu cho người sử dụng Người thường xuyên sử dụng gia súc, gia cầm nhiễm kháng sinh sẽ rất dễ bị “nhờn” thuốc, khi bị bệnh khó chữa trị do lượng kháng sinh này sẽ tích tụtrong cơ thể gây nên hiện tượng vi khuẩn thích ứng với kháng sinh

Các loại kháng sinh này thường không bị phân huỷ và tồn lưu trong môi trường nuôi trồng thuỷ sản trong thời gian dài, khiến các loại vi khuẩn thích nghi với môi trường có kháng sinh Kết quả là các loại vi khuẩn gây bệnh trong thuỷ sản lại có khả năng kháng thuốc kháng sinhNếu kháng sinh được trộn lẫn vào thức ăn nuôi thuỷ sản, có thể tìm thấy dư lượng kháng sinh trong thịt thuỷ sản và các sản phẩm chế biến Những người ăn thuỷ sản chứa dư lượng kháng sinh sẽ vô tình hấp thụ kháng sinh vào cơ thể, dẫn đến những thay đổi trong môi trường vikhuẩn bình thường, khiến họ trở nên dễ bị nhiễm khuẩn hơn

Đặc biệt việc lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây lờn thuốc, dẫn đên sự phát triển của các loại vi khuẩn có khả năng kháng thuốc trong cơ thể động vật cũng như trong thủy sản

Khoa chăn nuôi Thú y ĐH Nông Lâm TP HCM mới đây đã tiến hành khảo sát tình hình

sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh trong thịt ở các quầy kinh doanh giasúc, gia cầm Đa số người chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý như liều lượng cao, sử

dụng liên tục để phòng ngừa bệnh cho gia súc đến khi nào bán được Xét nghiệm các mẫu thịt được lấy trực tiếp tại các chợ cho thấy có 26 loại kháng sinh được phát hiện Trong đó loại được

sử dụng nhiều nhất là chloramphenicol (chiếm 15,35%), tylosin (15%), colistin (13,24%),

norfloxacin (10%), gentamycin (8,35%), nhóm tetracylin (7,95%), ampicillin (7,24%) Trong

đó, chloramphenicol là kháng sinh hiện đã bị cấm sử dụng trên nhiều quốc gia [14]

Trong 149 mẫu thịt gà được kiểm tra, phân tích có đến 44,96% số mẫu có dư kháng sinhvượt quá mức quy định cho phép từ 2,5 đến 1.100 lần so với tiêu chuẩn ngành Trong đó, loại

kháng sinh chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao nhất đến 87,50%, flumequin chiếm 83,33%,

chlortetracyline chiếm 62,50%, amoxillin chiếm 60% [14]

Do đó cần phải biết được phương pháp xác định dư lượng thuốc trong tực phẩm để hạn chế được những tác dụng nguy hại từ những thực phẩm chứa dư lượng thuốc kháng sinh quá tiêuchuẩn cho phép

1 Aristolochia spp và các chế phẩm từ chúng

Thức ăn, thuốc thú y, hoáchất, chất xử lý môi trường,chất tẩy rửa khử trùng, chấtbảo quản, kem bôi da taytrong tất cả các khâu sản xuấtgiống, nuôi trồng động thựcvật dưới nước và lưỡng cư,dịch vụ nghề cá và bảo quản,

18 Gentian Violet (Crystal violet)

19 Nhóm Fluoroquinolones (cấm sử dụng trong sản xuất, kinh

doanh thuỷ sản xuất khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ)

Bảng 1.1: Danh mục chất kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản [11]

TT Kháng sinh cấm Chỉ tiêu kiểm tra Giới hạn phát hiện tối thiểu

1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb

5 Nitrofurantoin 1-aminohydantoin (AHD) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb

6 Nitrofurazone Semicarbazide (SEM) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb

Bảng 1.2 Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích một số kháng sinh cấm [5]

1.8 Một số thuốc kháng sinh thường gặp

1.8.1 Thuốc kháng sinh họ fluoroquinolone [10].

Quinolone là một kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị nhiễm

trùng ở người và động vật Mục tiêu chính của chúng là vi khuẩn the bacterial enzyme

DNA gyrase hay topoisomerase II Quinolone có thành phần hóa học là dẫn suất của acid

nalidixic Dựa trên phổ kháng khuẩn của nó, quinolone được chia thành nhiều thế hệ như:

 Quinolone thế hệ thứ nhất: cinoxacin, flumequine, nalidixic acid, oxilinic,

 Quinolone thế hệ thứ hai: ciprofloxacin., enoxacin, fleroxacin, lomefloxacin…

 Quinolone thế hệ thứ ba: balofloxacin, gatifloxacin, grepafloxacin…

 Quinolone thế hệ thứ tư: garenoxacin, clinafloxacin, gemifloxacin…

Fluoroquinolone là một nhóm kháng sinh thuộc họ quinolone trong đó có một

nguyên tử F gắn ở vị trí số 6 của hệ thống trung tâm Cả Quinolones và Fluoroquinolones đều là thuốc kháng sinh có khả năng giết chết vi khuẩn

a Công thức cấu tạo

Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolone là hợp chất vòng thơm có chứa N, vị trí thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic Các dẫn suất của

quinolone gồm những hợp chất mà: Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí

6: có thể gắn thêm F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N

Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone Acid Nalidixic

Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone

b Tính chất Acid - Base nhóm quinolone

Quinolone có một nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên đây là một hợp chất có tính

acid Một số quinolone có chứa thêm nhóm amine khác nên có thêm tính base Dựa vào

pKa có thể chia nhóm quinolone thành hai loại: Acidic quinolone (AQ) và Piperazinyl

Quinolone (PQ)

Acidic quinolone (AQ): chỉ có một giá trị pKa thuộc khoảng 6.0 đến 6.9 Trong

nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion Thường AQ gồm những Quinolone thuộc thế hệ thứ nhất

Hình 1.4 Cân bằng Acid Base của nhóm Acidic Quinolone

Piperazinyl quinolone (PQ): có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5.5 – 6.6 và pKa2

khoảng 7.2 – 8.9 Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation,

dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là Danofloxacin, Difloxacin, Norfloxacin,

Ofloxacin, Benofloxacin, Marbofloxacin, Pipemidic acid

Hình 1.5 Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl Quinolone

c Ciprofloxacin

Ciprofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi

khuẩn gram dương và gram âm

 Tên gọi: 1 – cyclopropyl – 6 – fluoro – 1,4 – dihydro – 4 – oxo – 7 – 1 – piperazinyl 3 – quinolinecarboxylic acid

 Công thức hóa học: C17H18FN3O3

 Trọng lượng phân tử: 331.35 g/mol

 Nhiệt độ nóng chảy: 318 – 320oC

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin

 Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong ethanol, methylene chloride Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin

 Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7, có hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8 – 9

e Nguồn gốc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin trong thực phẩm

Ciprofloxacin và Enrofloxacin được đưa vào thịt gà, cá…dưới dạng nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, hoặc do người chăn nuôi trộn vào thức ăn gia súc, gia cầm, hoặc cho

vào môi trường sống của các động vật thủy sản Khi động vật ăn, hoặc sống trong môi

trường đấy hoặc tiêm để chữa bệnh thì kháng sinh sẽ xâm nhập vào cơ thể

f Ứng dụng và ảnh hưởng của Ciprofloxacin và Enrofloxacin

Ciprofloxacin và Enrofloxacin được dùng làm kháng sinh cho người và động vật Hai loại kháng sinh này được con người sử dụng khi mắc các chứng bệnh về đường hô

hấp, nhiễm trùng huyết xương khớp, viêm nhiễm cơ quan sinh dục… Nhóm

fluoroquinolone nói chung (Ciprofloxacin, Enrofloxacin nói riêng) là nhóm kháng sinh có độc tính cao, chỉ sử dụng với liều nhất định, được quy định rất chặt chẽ và đều thuộc

nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng đối với trẻ em vì ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng Nhóm fluoroquinolone nếu dùng liều cao và kéo dài sẽ làm ảnh hưởng trên sụn đầu

xương và quá trình tăng trưởng của bé chậm lại, bị lùn (Theo bác sĩ Đào Thị Yến Phi-

Trung tâm đào tạo – bồi dưỡng cán bộ y tế Tp HCM)

Trường hợp tồn dư 5ppb fluoroquinolone, nếu một người ăn trung bình 150 – 200g thịt/ngày thì lượng fluoroquinolone đưa vào cơ thể khoảng 2µg/ngày Với lượng này sẽ

không gây độc tính ngay, nhưng nếu tích lũy lâu dài hoặc ăn quá nhiều sẽ bị tác hại

Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan cho vật nuôi các loại kháng sinh trong danh mục

thuốc dùng cho người hoàn toàn có khả năng dẫn tới kháng thuốc ở vi khuẩn Như vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng điều trị các bệnh lý nhiễm trùng trong cộng đồng loài người

1.8.2 Chloramphenicol [13]

a Lịch sử

Chloramphenicol là chất kháng sinh được phát hiện đồng thời do ba nhóm nghiên cứu độc lập với nhau: nhóm của Ehrlich (Parke Davis Comp, 1947), nhóm Gottib (Univ.of Illinois, 1948) và nhóm Umezawa (1948) Họ Chloramphenicol được coi là họ kháng sinh có cấu trúc

đơn giản nhất và ngay từ khi phát hiện rất nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu sản xuất các chất kháng sinh này Nhờ vậy chỉ trong vòng hai năm người ta đã xác định được cấu trúc phân tử và triển khai thành công nghệ sản xuất ra loại thuốc kháng sinh này.

Hình 1.8 Công thức phân tử chung của họ chloramphenicol

Chloramphenicol là một kháng sinh phổ biến và trước đây đã được sử dụng để điều trị

có hiệu quả nhiều bệnh Gram âm và Gram dương khác nhau Nhưng do có một số hiệu ứng phụ không mông muốn việc ứng dụng chloramphenicol trong điều trị có xu hướng giảm dần Đồng thời ,việc sử dụng và kiểm tra phát hiện sư lượng chloramphenicol trong thực phẩm trở thành vấn đề rất nhạy cảm, được qui định chặt chẽ và tiếng hành giám sát nghiêm ngặt ở nhiều nước, đặt biệt là nước công nghiệp phát triển

Chloramphenicol là chất độc màu trắng hoặc có ánh vàng vàng, không mùi, vị rất đắng, ít tan trong nước, tan nhiều trong cồn và chất béo, dung dịch chloramphenicol bền vững trong môi trường hơi acid hay trung tính bền vững với nhiệt chịu nhiệt độ đến 1000C

c Tác hại của cloramphenicol

Khi sử dụng trong chăn nuôi, một phần kháng sinh chưa đào thải sẽ tồn dư sang sản phẩm thực phẩm gây nguy hại đến cơ thể con người và một lượng đáng kể trong thức ăn thừa sẽ thoát ra và lắng động vào môi trường, theo thời gian có thể dẫn tới các biến đổi về hệ sinh thái Gây ô nhiểm môi trường, làm cho vật nuôi và cả con người kháng lại thuốc khi sử dụng thục phẫm có nhiễm thuốc, làm cho các vi khuẩn gây bệnh lờn thuốc, và như vậy khi cơ thể người hay loài vật nuôi bị nhiễm loại vi khuẩn đã lờn thuốc thì sẽ không có thuốc trị

Chloramphenicol khi đi vào cơ thể trẻ sơ sinh có thể gây ra “hội chứng xanh tím xám”, đặc biệt là trẻ sinh non Trẻ bị xanh tái dần rồi trị tim mạch và tử vong Chloramphenicol còn ngộ độc cho tủy xương nếu dùng kéo dài Ngoài ra chloramphenicol còn có thể gây suy tỷ, thiếu máu không hồi phục.

Bị nhiễm kháng sinh thuộc nhóm chloramphenicol có thể làm giảm bạch cầu, vàng da.Chloramphenicol không chỉ tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh đường ruột mà còn diệt luôn vi khuẩn có lợi cho ruột gây tiêu chảy dẫn đến thiếu nước nghiêm trọng và làm xuất hiện các bệnh thiếu vitamin

Phơi nhiễm hóa chất độc hại trong lương thực, các mặt hàng thủy sản nuôi trồng (tôm, lươn, cá Basa ) như chloramphenicol, nitrofuran vào cơ thể con người sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ miễn nhiễm, làm mất khả năng kháng thuốc khi tích tụ lâu ngày và có khả năng gâyđột biến, rối loạn nội tiết

d Sản xuất chloramphenicol

Cơ chế sinh tổng hợp chloramphenicol:

Ngày nay người ta có khả năng phân lập được nhiều nhiều vi sinh vật có khả năng sinh

tổng hợp chất kháng sinh thuộc họ chloramphenicol như: Streptomyces, Nocardia, Arthrobacter, Corynebacterium,

Trong đó các chủng có hoạt lực cao thường thuộc loài: Streptomyces venezuelae, S.omiyaensis Streptomyces phaeochromogenes, Streptsporangium viridogriseum và

Corynebacterium hydrocarboclastus.

Do trong phân tử chloramphenicol có chứa vòng phenylpropenoid nên về cơ chế chất kháng sinh nàycũng có thể được tổng hợp qua các acid amin vòng, phenyl alanin, tyrosine Trong môi trường nghèo vói muối nitrat là nguông thức ăn nito, sinh tổng hợp chloramphenicol được cảm ứng rõ rệt mỗi khi bổ sung vào môi trường một trong hai acid này Tuy nhiên hiệu ứngcảm ứng cũng xảy ra cả khi bổ sung một số acid không vòng khác Đồng thời khi sử dụng nguồndinh dưỡng đánh dấu 14C, kết quả thực nghiệm không tìm thấy bằng chứng hai acid amin vòng trên sản phẩm trung gian cho quá trình sinh tổng hợp Từ các dữ liệu trên người ta cho rằng ở

S.venezuelae, trong sơ đồ tổng hợp các acid amin vòng có đường rẽ nhánh sinh tổng hợp

chloramphenicol tại vị trí acid shikimic

COOH

OH O

C CH2

CH2 H2N-CH

NH2

COOH

HC-OH H2N-CH

NH2 COOH

COOH CHCl2

chloramphenicol với hiệu quả kinh tế có khả năng cạnh tranh được với phương pháp tổng hợp hóa học

Để lên men chloramphenicol người ta thường sử dụng các chủng có hoạt tính cao thuộc

loài S.Venezuelae Nguồn dinh dưỡng carbon có thể sử dụng là glucose, lactose, maltose và

glycerine Trong đó ưu thế hơn cả là glycerine Nguồn dinh dưỡng nitơ tốt nhất là tryptone, amoniac, asparagin, glutamine Cảm ứng sụ phát triển sinh khối, nhưng không cải thiện hiệu quảtích tụ kháng sinh Trong khi bổ sung phanlalnine, locine hay izolocine xạ khuẩn tích tụ chậm nhưng cải thiện dược lượng kháng sinh tích tụ Trong việc sản xuất, với nguồn nitơ người ta thường sử dụng nguyên liệu thay thế rẻ tiền hơn như: dạ dày lợn, nấm men thủy phân, dịch nấm men đồng thời cung cấp thêm chất khoáng

Giống xạ khuẩn được nuôi hoạt hóa thu bào tử, rồi cấy chuyền sang môi trường lỏng trong bình tam giác và nuôi ở 250C trong vòng 72h, tiếp theo cấy chuyền sang fermentor dung tích lơn hơn đến khi đủ giống để sản xuất Quá trình sinh tổng hợp chloramphenicol xảy ra gần như đồng thời với sự phát triển sinh khối và phần lớn lượng kháng sinh được sinh tổng hợp và tích tụ trong pha cân bằng Với các chủng hoạt lực cao, nồng độ chloramphenicol trong dung dịch thường đạt khoảng 130 – 150 mg/l sau khoảng 3 ngày lên men Nồng độ chloramphenicol

được định lượng bằng phương pháp sinh hoạc (sử dụng sarcina lute), phương pháp khử vitamin

hóa, phương pháp đo phổ hấp phụ cục đại ở 278nm, phương pháp sắc ký khí và hiệu quả nhất là phương pháp HPLC

Kết thúc quá trình, dịch lên men được acid hóa nhẹ xuống pH = 4.0, lọc tách sinh khối, rồi điều chỉnh pH kiềm nhẹ (pH = 8.5 – 9.0) để trích ly sang ethylacetat hay amin acetate Sau khi phân ly, dịch trích ly được cô chân khong loại dung môi rồi hòa tan lại bằng dầu lửa Dung dịch này được rửa tiếp bằng dung dịch acid acetic, dung dịch natri bicacbonat loãng rửa nước và sau khi phaanly pha sẽ được cô chân không loại dầu lửa Sau khi rửa phần không bay hơi còn lại (bằng ete dầu lửa để loại lipid) người ta thu được bột chloramphenicol thô Bột kháng sinh thô này được hòa tan lại trong dung môi hữu cơ để xử lý tẩy màu qua cột than hoạt tính hay cột nhôm trong nước nóng, tẩy màu lại qua than hoạt tính, lộc, cô chân không rồi làm lạnh xuống nhiệt độ thấp để kết tinh thu chloramphenicol dạng tinh thể Để đạt độ tinh sạch cao hơn, có thể hòa tan và kết tinh lại trong ethylene dicloride hoặc trong dung môi hỗn hợp ethel – ethel dầu lửa

1.8.3 Penicillin [13]

a Lịch sử

Penicilin được tìm ra nǎm 1928 và được sử dụng trong lâm sàng lần đầu tiên vào nǎm

1941 Nǎm 1941, penicilin G là kháng sinh có hiệu quả cao, thậm chí chống được hầu hết các

chủng Staphylococcus aureus Tuy nhiên, đến nǎm 1947, phần lớn các các vi khuẩn phân lập

được trong bệnh viện đều biểu hiện tính kháng penicilin Trong một nỗ lực nhằm vào vấn đề này, các penicilin "bán tổng hợp" đã được triển khai Methicilin, một penicilin ổn định beta-lactamase, được đưa ra thị trường nǎm 1959 ít lâu sau, nafcilin và oxacilin cũng được đưa ra thị

trường Nǎm 1961, ampicilin có hiệu quả cao chống lại E.coli, H.influenzae và N.gonorrhea Ngày nay, một số đáng kể E.coli và H.influenzae đả kháng ampicilin, và ampicilin không còn là liệu pháp hàng đầu chống lại N.gonorrhea nữa.

Hình 1.10 Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum

Carbenicilin được cho phép sử dụng nǎm 1970 và là một penicillin bán tổng phổ rộng

đầu tiên Thuốc có hoạt tính cao chống lại các vi khuẩn gam âm ở ruột và Pseudomonas

aeruginosa Nhóm penicilin này còn được gọi là các penicilinkháng pseudomonas và được chia

theo cấu trúc thành 2 nhóm: Nhóm carboxypennicillin (ticarcillinvà carbenicillin) và nhóm acylureidopenicillin(piperacillin và mezlocillin).Nhóm carboxypenicillin có tỷ lệ gây bất

thường tiểu cầu và xuất huyết trên lâm sàng cao hơn nhóm acylureidopenicillin

b Cơ chế hoạt động

Để đạt được hiệu quả, penicillin phải thấm qua màng tế bào và gắn với các protein gắn

penicillin Các protein gắn penicillin chịu trách nhiệm nhiều bước trong quá trình sinh tổng hợp của màng tế bào và có mặt trong hàng trǎm đến hàng nghìn phân tử trên một tế bào vi khuẩn Các protein gắn penicillin rất khác nhau giữa các chủng vi khuẩn Các kháng sinh beta – lactam cản trở việc tổng hợp màng tế bào qua trung gian PBP, cuối cùng dẫn đến ly giải tế bào Sự ly giải diễn ra qua trung gian là các enzym tự ly giải thành tế bào vi khuẩn (ví dụ: các autolysin) Còn chưa rõ mối liên quan giữa các PBP và các autolysin, nhưng có lẽ kháng sinh beta – lactamgây cản trở bằng một chất ức chế autolysin

f Các đặc điểm phân biệt

Sự khác biệt rõ ràng giữa các penicillin bao gồm khác biệt trong phổ hoạt động của chúng Penicillin trong các muối và các dạng liều khác nhau, ampicillin, và amoxicillin có hoạt

tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram dương và một số vi khuẩn kỵ khí Các chất này dễ bị beta-lactamase phá huỷ và do đó không có hiệu quả chống tụ cầu và các vi khuẩn kỵ khí sản sinh beta-lactamase Ampicillin và amoxicillin có hoạt tính chống lại một số vi khuẩn hiếu khí gram âm, nhưng penicillin thì không Amoxicillin đã thay thế penicillin V làm loại penicillin lý tưởng để phòng viêm nội tâm mạc do sinh khả dụng ưu việt của nó.

Methicillin, nafcillin, mezlocillin, và dicloxacillin là các chất giống hệt nhau ngoại trừ đường dùng của chúng Chúng có hoạt tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram âm, nhưng chúng được dành để điều trị nhiễm tụ cầu Chúng không có hiệu quả chống lại vi khuẩn gram âm

Carbenicillin, ticarcillin, mezlocillin và piperacillin có hoạt tính rộng chống lại các vi khuẩn hiếu khí gam âm nhưng không có hiệu quả chống tụ cầu Các penicillin phổ rộng được sửdụng chủ yếu trong điều trị nhiễm khuẩn nghi ngờ hoặc biết chắc là do vi khuẩn hiếu khí gram

âm Để chống lại Pseudomonas aeruginosa, chúng thường được phối hợp với một

aminoglycosid Trong số các penicillin phổ rộng hay các penicillin kháng pseudomonas, hiệu lực tương đối chống lại Pseudomonas là: Piperacillin > Mezlocillin = Ticarcillin >

Carbenicillin Trừ carbenicillin, các thuốc này được dùng ngoài đường tiêu hóa

g Các phản ứng có hại

Các phản ứng có hại của penicillin bao gồm những phản ứng có hại của tất cả các thuốc kháng sinh (như: nhờn thuốc, các phản ứng quá mẫn) cũng như một số phản ứng huyết học và thần kinh Nhiều, nhưng không phải tất cả các penicillin có liên quan với giảm bạch cầu trung tính và giảm tiểu cầu, và các carboxypenicillin có thể gây rối loạn chức nǎng tiểu cầu Khi dùng liều cao cho bệnh nhân rối loạn chức nǎng thận, penicillin có thể gây ra cơn co giật Methicillin

có liên quan với viêm thận kẽ Được sử dụng đúng, các penicillin là những thuốc cực kỳ an toàn

và hiệu quả

II Các phương pháp xác định hàm lượng chất kháng sinh trong thực phẩm

2.1 Dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng kít elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC – MS/MS [5].

2.1.1 Giới thiệu

Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC – MS, GC – MS/

MS, LC – MS, LC – MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận Tuy nhiên những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên– kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữuhiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method) Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tínhgiả của xét nghiệm