Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

Hiện đã biết trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mói đuợc phát hiện. Trong tuơng lai chắc chắn còn có nhiều chất kháng sinh khác nữa cũng sẽ đuợc tìm ra vì đa số các vi sinh vật có khả năng tạo thành chất kháng sinh đã đuợc nghiên cửu cho tới nay đều chỉ thuộc về các chi Streptomyces và Bacillus. Nhiều nhà nghiên cửu về các chất kháng sinh tin rằng sẽ có nhiều chất kháng sinh mới đuợc phát hiện nếu tìm thêm ở các nhóm vi sinh vật khác. Mặt khác các kỹ thuật của công nghệ di truyền sẽ cho phép thiết kế một cách nhân tạo các chất kháng sinh mới khi mà các chi tiết về bản đồ gen của các vi sinh vật sản sinh chất kháng sinh đã đuợc biết rõ.

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh thực phẩm Trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM Khoa kỹ Thuật Hóa học Bộ mơn cơng nghệ thực phẩm BÁO CÁO TIÊU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHÃM CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG DƯ THUỐC KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh thực phẩm Mục lục 1.1 Lời nói đầu .6 I Tổng quan chất kháng sinh 1.2 Định nghĩa 1.3 Khái niệm chất khảng sinh [1] 1.3.1Tác dụng chất kháng sinh .6 1.5Phân loại thuốc kháng sinh [4] 1.6Sàn xuất thuốc khảng sinh 10 1.7Mặt trái thuốc khảng sinh 10 1.8Một sổ thuốc kháng sinh thường gặp 12 1.8.1 .Thuốc kháng sinh họ fluoroquinolone [10] 12 1.8.2 Chloramphenicol [13] 15 1.8.3 Penicillin [13] 19 II Các phương pháp xác định hàm lượng chất khảng sinh thực pham 21 2.1 Dư lượng Chloramphenicol thủy sản kít elừa thơng qua phân tích khắng 1.4 định LC - MS/MS [5] 21 2.1.1Giới thiệu .21 2.1.2Đối tượng .22 2.1.3Phương pháp phân tích .22 2.1.4Phân tích - nhận xét .23 2.2 Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh streptomycin [7] 25 2.2.1Đặc tinh chung 25 2.2.2Nguyên tắc 26 2.2.3Lẩy mau 26 2.2.4Dụng cụ, thiết bị hoá chất .26 2.2.5Tiến hành thủ .28 2.3 Phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone tơm phương pháp ELISA 1.5 [15] 29 2.3.1Nguyên liệu 29 2.3.2Phương pháp .30 2.3.3Kết 31 2.3.4 Khả phát h iện kít 2.3.5 Độ đặc hiệu, tỉnh chọn lạc độ xác thực phương pháp 2.3.6 Kết luận 2.4 Phương pháp kiếm tra nhanh Chloramphenicol [6] 2.4.1 Mục đích 2.4.2 Tóm tắt 2.4.3 Nguyên lí 2.4.4 Lưu ỷ 2.4.5 Bảo quản độ on định 2.4.6 Thiết bị 2.4.7 Xử li mâu 2.4.8 Quy trình thực 2.4.9 Đọc kết quà 2.4.10 Kiếm soát chất lượng 2.4.11 Hiệu suất 2.5 Phương pháp định lượng Sulfonamit sản phắm thuỳ sàn bang sắc ký lỏng hiệu cao [16] 2.5.1 Phạm vi áp dụng 2.5.2 Phương pháp tham chiểu 2.5.3 Nguyên tắc Tài liệu tham khảo 32 33 34 34 34 34 34 35 35 35 35 35 36 37 37 37 37 38 38 43 Mục lục hình ảnh Hình 1.1: Penicillin G Hình 1.2 Sơ đồ chế tác dụng thuốc kháng sinh vi khuắn Hình 1.3 Cấu trúc nhóm Quinolone Hĩnh 1.4 Cân bang Acid Base nhóm Acidic Quinolone Hĩnh 1.5 Cân bang acid base nhóm Piperazinyl Quinolone Hĩnh 1.6 Cơng thức cấu tạo Ciprofloxacin Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo Enrofloxacin Hình 1.8 Cơng thức phân tử chung họ chloramphenicol Hình 1.9 Sơ đồ tong hợp chloramphenicol từ acid shikimic Hĩnh 1.10 Sảnpham penicillin men tự nhiên nhờ p.chrysogenum Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS Hĩnh 2.4: Máy xay sinh tổ Hĩnh 2.5: Máy ly tâm Hình 2.6: Bình định mức loại Hình 2.7: Pipet loại Hình 2.8: Phều chiết cỡ 250 ml Hình 2.9: Quy trình thực Hình 2.10: Ẵm tỉnh: Hai vạch Hình 2.11: Dương tỉnh: Hai vạch Hình 2.12: Kết quà sai: vạch chuan không xuất Mục lục bảng số liệu Bảng 1.1: Danh mục chất kháng sinh cam sử dụng sản xuất, kinh doanh thủy sàn Bảng 1.2 Yêu cầu thị trường giới hạn phát phương pháp phân tích sổ kháng sinh cam Bảng 2.1 Tống hợp kết quà phân tích sàng lọc CAP ELISA khắng định LC-MS/MS Bảng 2.2 Tương quan nồng độ CAP xác định ELISA tỷ lệ dương giả Bảng 2.3 Kết quà phân tích kiếm tra đường chuan Đồ thị 2.4 Đường chuan Bảng 2.5 Khả phát phương pháp nồng độ giới hạn phát giới hạn nồng độ toi đa cho phép theo Quyết định 2377/90 CE Uỷ ban Châu Au đoi với sổ Quinolone Bảng 2.6 Các tham so độ mạnh phương pháp đổi với quinolone thử ngưỡng phát tồi thiếu Bảng 2.7: Chương trình pha động Lời nói đẩu Cùng vói phát hiển cơng nghệ sinh học đại, vi sinh vật học công nghiệp - nhánh có vai trị trọng yếu ngành công nghệ sinh học thu đuợc nhiều thành tựu to lớn sản xuất sinh khối, duợc phấm, chất điều vị thục phấm sử dụng công nghiệp, y, duợc học, nông nghiệp nhờ vi sinh vật - máy sản xuất sinh khối kì diệu Hiện biết 8000 chất kháng sinh năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mói đuợc phát Trong tuơng lai chắn cịn có nhiều chất kháng sinh khác đuợc tìm đa số vi sinh vật có khả tạo thành chất kháng sinh đuợc nghiên cửu thuộc chi Streptomyces Bacillus Nhiều nhà nghiên cửu chất kháng sinh tin có nhiều chất kháng sinh đuợc phát tìm thêm nhóm vi sinh vật khác Mặt khác kỹ thuật công nghệ di truyền cho phép thiết kế cách nhân tạo chất kháng sinh mà chi tiết đồ gen vi sinh vật sản sinh chất kháng sinh đuợc biết rõ Ngày nay, chất kháng sinh đuợc sử dụng rộng rãi ngành nông nghiệp nhu chăn nuôi, trồng trọt, nuôi trồng thủy hải sản, có tác dụng lớn giúp cho vật nuôi hồng chống lại bệnh tật từ vi sinh vật Tuy vậy, chất kháng sinh nhu dao hai luỡi Một mặt giúp sinh vật chông lại bệnh tật, mặt khác, làm cho sinh vật xuất phản úng phụ, đặc biệt luợng chất kháng sinh tồn du sinh vật ảnh huởng đến chất luợng thục phấm, súc khỏe nguôi tiêu dùng Với luợng thục phẩm khổng lồ từ động vật đuợc tiêu thụ thị truờng, song nghĩ đến việc ngày chủng ta phải tích lũy du luợng chất kích thích tăng họng thuốc kháng sinh miếng thịt động vật loại sản phấm Bởi chăn nuôi gia súc, gia cầm nay, nguời dân sử dụng tùy tiện loại thúc ăn tăng trọng thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh giúp vật nuôi mau ăn chóng lớn Hậu du luợng chất kích thích thuốc kháng sinh thịt gia súc, gia cầm vuợt nguỡng cho phép gấp nhiều lần, không gây ngộ độc cấp tính túc thịi, nhung gây nguy hại lâu dài cho súc khỏe nguôi tiêu dùng I Tống quan chất kháng sinh 1.1 Định nghĩa 1.2 Khái niệm chất kháng sinh [1] Kháng sinh đuợc gọi trụ sinh chất có khả tiêu diệt vi khuấn hay kìm hãm sụ phát fríen vi khuấn cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuấn cấp độ phân tử, thuờng vị trí quan trọng vi khuấn hay phản úng trình phát trien vi khuấn Từ ''antibiotics'' (kháng sinh) có nguồn gốc từ chữ ''antibiosis'' ''anti'' có nghĩa " c h ố n g l i " "biosis" có nghĩa " c u ộ c s ắ n g " Chất kháng sinh tác động, chống lại số loại vi khuấn Thật vậy, chất kháng sinh chất hoá học lấy từ vi sinh vật nhu vi khuấn, nấm mốc, vài thục vật 1.3.1 Tác dụng chất khảng sinh Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh thực phẩm Thuốc kháng sinh chất có tác động chống lại sống vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên cách tác động mức phân tử, tác động vào hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết đời sống vi khuẩn tác động vào cân lý hóa Thịi đại chất kháng sinh bắt đầu vào khoảng năm 1928 với việc khám phá loại Penicillin bác sĩ Alexandra Flemning Flemning đặt tên cho chat Penicillin Chất kháng sinh hữu hiệu cho việc điều trị bệnh viêm phối, họ , viêm cuống họng, mụn mũ, đau nhức, v.v Streptomycin chất kháng sinh khác dùng để điều trị bệnh lao phổi Ngồi cịn có chất kháng sinh khác ampicilin, tetracyclin, Chloromycetin, v.v dùng để trị bệnh khác Một vài loại kháng sinh hữu hiệu việc chống lại số vi sinh vật, vài loại khác hữu hiệu việc chống lại vi sinh vật phạm vi lớn gọi chất kháng sinh phố rộng [1], Hĩnh 1.1: Penicillin G Mỗi năm hàng triệu bệnh nhân giới chữa trị nhờ chất kháng sinh Năm 1930, 20% đến 85% tống số tử vong Mỹ bệnh lao phối Năm 1960 số giảm xuống 5% Tương tự, số tử vong sốt thương hàn gây giảm từ 10% đến 2% Các bệnh truyền nhiễm đỡ nhiều nhờ chất kháng sinh Chất kháng sinh hữu dụng việc ngăn ngừa bệnh nhiễm trùng cuống họng, bệnh sốt gây đau nhức khớp xương bệnh lây qua đường tình dục, v.v [1] 1.4 Cơ chế động chất khảng sinh [3] Khi chất kháng sinh đưa vào thể, giết chết vi khuấn gây bệnh Kháng sinh diệt trùng nhiều cách: • ức chế thành lập vách tế bào: Ngăn cản tống họp thành tế bào vi trùng penicillin, cephalosporin, vancomycin • ức chế nhiệm vụ màng tế bào • ức chế chuyển hoá vi trùng sulfamides, trimethoprim, Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh thực phẩm • ức chế tổng họp protein: ức chế tổng họp protein vi trùng tetracyclin, aminoglycosides, macrolides (erythromycin ), • ức chế tổng họp acid nucleic: ức chế tổng họp hoạt động acid nucleic fluoroquinolones rifampicin ehí Sv’sí'9 t*9p v*c* tSbto Ifed»* v/lắnọh^-p K'S nucltlc Ciqpcr^d1! c¿t c*;*\jV3*r khơng có chúc tống họp protein Tetracyclines • Thuốc gắn vào tiếu đơn vị 30 s / Ribo -> ngăn chặn amino acid gắn vào chuỗi peptid đuợc thành lập • Chloramphenicol • Thuốc gắn vào tiếu đơn vị 50S / Ribo -> ửc chế peptidyltransferase -> ngăn amino acid gắn vào chuỗi peptid thành lập Các khoa học gia thật sụ khơng biết tồn cách thúc mà chất kháng sinh giết đuợc vi khuấn mầm bệnh Một vài khoa học gia cho chất kháng sinh ngăn chặn oxy không tới đuợc vi khuấn mầm bệnh nên vi khuấn chết thiếu oxy Một vài khoa học gia khác cho rằng, chất kháng sinh ngăn chặn vi khuấn không lấy đuợc thúc ăn Dù cho cách thúc tác động chất kháng sinh có nhu nữa, loại thuốc hữu ích cho nguôi Kháng sinh chống lại vi khuấn cách làm hu hại thành phần cấu tạo chủng nhu lớp vỏ bảo vệ, màng trao đổi chất v.v Tuy nhiên, phuơng diện điều trị, nguôi ta quan tâm đến hai loại tác dụng: tác dụng diệt khuấn tác dụng kìm khuấn (kìm khuấn có cịn đuợc gọi hãm khuấn, trụ khuấn, tĩnh khuấn) Kháng sinh diệt khuấn có tác dụng giết chết vi khuấn, cịn kháng sinh kìm khuấn làm cho vi khuấn ngung phát triến, không sinh sản không bị tiêu diệt Kháng sinh kìm khuấn đuợc dùng ngi bệnh súc đề kháng, hệ thống miễn dịch đủ mạnh đế tiêu diệt vi khuấn bị thuốc làm cho yếu Neu nguôi bệnh yếu, bắt buộc phải dùng loại kháng sinh diệt khuẩn 1.5 Phân loại thuốc khảng sinh [4], • Nhóm ß lactam penicilin: Penicilin, Methicilin, Ampicilline, Amoxicilline, Cloxacilline, Sultamicillin, Piperacilline, Imipenem ã Nhúm ò lactam cỏc cephalosporin: Th h 1: Cefadroxil, Cephalexin, Cefalothin, Cephazolin Thế hệ 2: Cefaclor Thế hệ 3: Cefixime, Ceftriaxone, Ccfuroximc, Cefixime, Ceftazidime, Cefotaxime, Celpodoxime • Nhóm tetracyline: Tetracycline, Doxycyline, Clotetracyclin, Oxytetracyclin, Minocyclin, hexacyclin • Nhóm aminosid: Amikacin, Tobramycin, Neomycin, Gentamycin, Kanamycin, Streptomycin • Nhóm macrolid: Azithromycin, Roxithromycin, Erythromycin, rovamycin, Clarithromycin, Spiramycin • Nhóm licosamid: Lincomycin, Clindamycin • Nhóm quinolon: Acid nalidixic, lomefloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin, levofloxacin, Gatifloxacin, Moxifloxacin, Pefloxacin, Sparfloxacin Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh thực phẩm • N tổng số mẫu phân tích = N^ + N' • hT số mẫu thực duơng tính (mẫu củng cố) • N' số mẫu thực âm tính (mẫu trắng) • PA số mẫu duơng tính theo kết phân tích số N mẫu • FN số mẫu âm tính theo kết phân tích số N+ mẫu • FP số mẫu duơng tính theo kết phân tích số N" mẫu • NA số mẫu âm tính theo kết phân tích số N- mẫu Mỗi kít phân tích 20 mẫu bao gồm mẫu hắng mẫu củng cố kháng sinh đại diện Mau đuợc chuấn bị tách chiết theo huớng dẫn kèm theo kít Sau đọc giá trị OD (mật độ quang) giếng khay buớc sóng 450 nm, kết đuợc tính tốn nhờ vào công thúc thiết lập Microsoft Office Excel 2003 Đe khang định khả úng dụng kít đế phát quinolone buớc đầu đánh giá tình hình du luợng nhóm quinolone tơm, đuợc phân tích phuơng pháp ELISA phuơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS/MS) đế khang định lại nồng độ định danh xác quinolone 2.3.3 Kết Tỉnh on định khả phát a Kết phân tích đường chuan Dung dịch chuẩn Mật độ quang (OD) Ki hiệu NSB* co Cl C2 C3 C4 C5 C6 NSB Nồng 0( n g / m ỉ ) 0.5 0.3 0.2 0.1 0.05 = Specific độ ~±SD 0,071 ± 0,006 1,226 ±0,037 0,307 ±0,008 0,485 ±0,016 cv (%) 6,88 0,642 0,801 0,923 1,043 3.24 2.72 2.44 2.65 ±0,021 ± 0,022 ± 0, 022 ± 0, 028 3.05 2.57 3.23 Non Binding: sử dụng dung dịch đệm Bảng p h o2.3 t pKết h a tquả phân tích kiếm tra đường chuấn Ket cho thấy mật độ quang giếng chửa nồng độ thiết lập đuờng chuẩn 10 kít ổn định (hệ số biến động từ 2,44% đến 6,88%) Đặc biệt, lnỊnồng độ] dung dịch xây dụng đuờng chuẩn đáp úng kít [logarit ((B -NS)/(B0 - NS))] có quan hệ tuyến tính chặt chẽ, tuơng quan nghịch, với giá trị trung bình R2 0,9915 (Bảng 1, Đồ thị 1) Đuờng chuấn tuyến tính khoảng nồng độ từ 0,05 đến ng/ml tính ốn định kít tuơng đối cao (Đồ thị 1) Hay nói cách khác, lý thuyết kít xác định xác nồng độ kháng ngun (trong truờng họp saraíloxacin) mẫu sau tách chiết nồng độ khoảng 0,05 đến ng/ml Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh thực phẩm Đồ thị 2.4 Đường chuấn (B BO tương ứng mật độ quang dung dịch chuan nồng độ khác nồng độ 2.3.4 bang NS mật độ quang dung dịch không đặc hiệu) Khả phát kít Đối với mẫu trắng 20 lần lặp lại khơng phát quinolone Cịn mẫu khác phát kháng sinh đuợc củng cố (Bảng 2) Tuy nhiên, dù đuợc củng cố nồng độ nhung kết khác mẫu củng cố khác so vói nồng độ thục mẫu (nồng độ củng cố) Ở hai nồng độ củng cố (0,7 ppb nồng độ MRL), kít nhạy phát tốt saratloxacine enrotloxacine, tiếp nortloxacine, ciprotlorxacine phát tlumcquin Kết khả phát kháng thể đặc hiệu kít Các kháng sinh có cấu trúc giống với kháng nguyên sử dụng để kích thích sản xuất kháng thể khả phát kít cao Theo thơng tin ghi kít kháng nguyên sử dụng để sản xuất kháng thể dẫn xuất saratloxacine, kết hồn tồn phù họp Nhu vậy, kết luận kít có khả phát tốt kháng sinh thuộc nhóm quinolone đuợc thử nồng độ 0,7 ppb Cũng từ kết này, theo chủng tôi, áp dụng kít vào thục tế phân tích mẫu kiểm sốt du luợng để có kết luận xác nồng độ du luợng đặc biệt định danh xác họp chất quinolone, cần áp dụng phuơng pháp khang định nhu phuơng pháp sắc ký lỏng khối phố Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh thực phẩm Mẫu Quinolon đại diện Mẫu trắng - Mẫu củng cố giới hạn phát Mẫu củng cố nồng độ tối đa cho phép theo Qui định 2377/90 CE Nồng độ củng cố (ppb) Kết phán tích, 0 Enrofloxacin 0,7 0,521 ± 0,060= Flumequin 0,7 0,095 ± 0,236= Norfloxacin 0,7 0,475 + 0,035= Ciprofloxacin Sarafloxacin 0,7 0,7 0,334 ± 0,053= 0,638 ± 0,023= Enrofloxacin 100 73,559 ± 2,236 Flumequin 200 5,010 ± 0,581 Norfloxacin 100 43,004 ± 1,351 Ciprofloxacin 100 37,352 ± 2,283 Sarafloxacin 30 28,519 ± 0,929 n=20 (ppb) Các số mang chừ số khác cột khác có ý nghĩa thống kê (P