Định tính salmonella trong thực phẩm

Định tính salmonella trong thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Tên đề tài: ĐỊNH TÍNH SAMONELLA TRONG THỰC PHẨM GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Lớp: 02ĐHTP1 Nhóm: Tp.HCM , ngày 14 tháng năm 2014 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm MỤC LỤC BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC - Công việc Đánh giá Tìm kiếm tài liệu Làm word Thuyết trình Tích cực Chữ kí GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm - Tìm kiếm tài liệu Làm word Thuyết trình - Tìm kiếm tài liệu Làm powerpoint Thuyết trình Tích cực - Tìm kiếm tài liệu Thuyết trình Tích cực - Tìm kiếm tài liệu Thuyết trình Tích cực Tích cực MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày trở nên cấp thiết, báo cáo cho thấy phần lớn vụ ngộ độc thực phẩm vi sinh vật Đã có nhiều cảnh báo, tình trạng ngộ độc thực phẩm leo thang ngày nghiêm trọng GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Có nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ Clostridium butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… đó, Salmonella loài vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết nhiều bệnh nghiêm trọng khác Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu độc tố, khả gây bệnh cách phát cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella, thực nghiên cứu đề tài “định tính samonella thực phẩm” để có nhìn tổng quan vi khuẩn Salmonella số chủng vi sinh vật khác NỘI DUNG CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VỀ SALMONELLA 1.1 Lịch sử phát Năm 1885 Slamon Smith (Mỹ) tìm Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả gọi tên Bacilus cholerasuis, gọi Salmonella Nhưng sau Schweinittz Dorset 1903 chứng minh bệnh dịch tả loại vi rút gây nên xác định S.choleraesuis vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Năm 1888 A.Gartner phân lập mầm bệnh từ thịt bò lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn Bacillus enteritidis ngày vi khuẩn gọi S.enteritidis Vi khuẩn gọi nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner… Năm 1889 Klein phân lập S.gallinarum Rettger phân lập S.pullorum năm 1909 Trước người ta cho hai loại vi khuẩn gây hai bệnh khác lên gọi chung bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) bệnh có tên chung S.gallinarum–pullorum Năm1896 C.Archard Rbensauded phân lập vi khuẩn S.paratyphi equi S.paratyphi bacilus Ngày vi khuẩn gọi tên S.paratyphi Bvà đến năm 1898,S.paratyphi Ađã tìm N.Guyn H Keyser Vi khẩn Salmonella 1.2 Phân loại Salmonella theo loài theo kiểu huyết - Về phân loại khoa học Salmonella xếp vào: Giới : Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống:Salmonella lignieres1900 • • • • • • GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Các loài điển hình:  Salmonella typhi: Gây bệnh thương hàn Hình 1.2 Vi khuẩn Salmonella typhi   Salmonella cholera_suis: Gây bệnh nhiễm trùng máu Hình 1.3 Vi khuẩn Salomonella cholera_suis Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa • • • • • • • Hình 1.4 Vi khuẩn Salmonella entertidis GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Lúc đầu, loài Salmonella đặt tên theo hội chứng lâm sàng chúng S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), theo vật chủ S.typhimurium gây bệnh chuột,về sau người ta thấy loài Salmonella gây nhiều hội chứng phân lập nhiều loài khác Vì lý mà chủng Salmonella phát đặt tên theo nơi mà phân lập S.teheran,S.congo,S.london Hiện theo phân loại hệ thống Viện Pasteur giới, Trung tâm Kiểm soát ngăn ngừa dịch bệnh Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center), giống Salmonella chia làm hai loài: S enterica S bongori Trong S bongori gồm tất kiểu huyết (serotype) loài phụ số V, S enterica chia làm loài phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV VI Các loài loài phụ phân biệt phản ứng sinh hóa Trong loài phụ có nhiều kiểu huyết Cho đến xác định 2463 kiểu huyết thuộc giống Salmonella Theo hệ thống Kauffman White, kiểu huyết chia dựa kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H kháng nguyên bề mặt Vi Phần lớn kiểu huyết đặt tên theo công thức kháng nguyên, số khác đặt tên riêng Enteritidis (S enteritidis), Typhi (S typhi), Paratyphi (S paratyphi), Typhimurium (S typhimurium)… Bảng phân loại Salmonella theo loài theo kiểu huyết Loài S enterica S bongori Loài phụ S enterica enterica (I) S enterica salamae (II) S enterica arizonae (IIIa) S enterica diarizonae (IIIb) S enterica houtenae (IV) S enterica indica (VI) Số kiểu huyết 1454 489 94 324 324 12 (V) 20 Loài phụ S enterica I chiếm đa số (99%), tìm thấy hầu hết động vật máu nóng Loài phụ chiếm 59% (1454/2463) tổng số kiểu huyết Salmonella có khả xâm nhập gây nhiễm cao cho người động vật máu nóng, loài phụ khác động vật máu lạnh môi trường Như có tới 41% (1009/2463) số kiểu huyết không phân lập từ bệnh phẩm GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm người, tỉ lệ có ý nghĩa để quan chức xem xét sữa đổi tiêu chuẩn hành Salmonella thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho nhà sản xuất tiêu thụ thực phẩm 1.3 Đặc điểm 1.3.1 Đặc điểm chung đặc điểm nuôi cấy Salmonella trực khuẩn Gram âm, hiếu khí kỵ khí tùy ý kích thước trung bình từ 0,5-3 µm, di chuyển tiên mao trừ S gallimarum S pullorum, không tạo bào tử, chúng phát triển tốt nhiệt độ 0C – 45,60C, thích hợp 370C, phát triển pH 4.1- 9.0 Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn sống đến 15 ngày Salmonella phát triển môi trường nuôi cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn phát triển sau 24 Có thể mọc môi trường có chất ức chế chọn lọc DCA (deoxycholate citrate agar) XLD (xylose lysine deoxycholate).Trong môi trường XLD chất ức chế nên thường dùng để phân lập Salmonella Khẩn lạc đặc trưng Salmonella môi trường tròn, lồi, suốt, có tâm đen, tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ 1.3.2 Tính chất hóa sinh Salmonella lên men glucose mannitol sinh acid không lên men saccharose, lactose, salicin inositol, không sinh indole, không phân giải ure, khả tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết chủng sinh H 2S,sử dụng citrate môn trường Simmons Tuy nhiên loài Salmonella có tính chất trên, ngoại lệ xác định S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate môi trường Simmon, hầu hết chủng S.paratyphi S.Cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli, Shigella số chủng Salmonella khác 1.3.3 Cấu trúc Salmonella GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Salmonella có ba loại kháng nguyên, chất xuất thể tạo kích thích đáp ứng miễn dịch kết hợp đặc hiệu với sản phẩm kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiên mao H kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên Vi (Virulence) yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên tế bào bạch cầu Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O) • Thành phân vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm lớp Trong lớp peptidoglycan mỏng, cách lớp không gian chu chất tới lớp màng (outer membrane) phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein lipopolysaccharide • Bao bên lớp peptidoglycan lớp phospholipid A B (quyết định độc tố Nội độc tố), sau hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu Kháng nguyên nội độc tố có chất hóa học lypopolysaccharide (LPS) Tính đặc hiệu kháng nguyên O LPS một, tính miễn dịch khác : kháng nguyên O LPS bao gồm lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch mạnh LPS Màng có cấu trúc gần giống tế bào chất phospholipid gặp lớp trong, lớp lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm thành phần : Lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O Màng có thêm protein: Protein chất: porin vi khuẩn gọi protein lỗ xuyên màng với chức cho phép số loại phân tử qua chúng dipeptide, disaccharide, ion vô Protein màng ngoài: chức vận chuyển số phân tử riêng biệt đưa qua màng Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên với lớp màng - Kháng nguyên tiên mao (kháng nguyên H) - Kháng nguyên H: Chỉ có Salmonella có lông Hầu hết Salmonella có lông trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm Kháng nguyên H loại kháng nguyên có chất protit, bền kháng nguyên O Kháng nguyên H dễ bị phá huỷ nhiệt độ cao xử lý cồn, axit yếu • Kháng nguyên H chia làm phase :  Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông biểu thị chữa số La tinh thường: a, b, c…  Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại ngưng kết với loại khác thành phần gặp E.coli Pha gồm có loại biểu thị chữa số Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x… • Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn roi chúng Sự ngưng kết tạo thành mảng kết tụ, chúng bị tách yếu tố có khả cắt roi vi khuẩn • GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Kháng nguyên H tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, đặc hiệu cho loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại phương pháp huyết Kháng nguyên vỏ K • Kháng nguyên K: kháng nguyên nằm kháng nguyên O nơi biểu độc tố, cấu tạo polysaccharide vỏ vách tế bào, thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ Nó ức chế biểu kháng nguyên O phát triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn HCl • Không phức tạp, có kháng nguyên vỏ kháng nguyên Vi có type huyết S.typhi S.paratyphi Kháng nguyên Vi-angtigen Felix cộng phát năm 1935 Kháng nguyên Vi gây tượng ngưng kết chậm xuất hạt vỏ, kháng nguyên Vi kháng nguyên vỏ bao bọc bên kháng nguyên O, khánh nguyên Vi không tham gia vào trình gây bệnh • Vị trí kháng nguyên Salmonella 1.3.4 Yếu tố độc lực - Vi khuẩn Salmonella tiết loại độc tố: Ngoại độc tố nội độc tố Nội độc tố Salmonella mạnh gồm loại: Gây xung huyết mụn loét, độc tố ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật Ngoại độc tố phát lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau ngày lấy ra, lại cấy truyền từ đến 10 lần, sau đem lọc, nước lọc có khả gây bệnh cho động vật thí nghiệm Ngoại 10 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu :Pha dung dịch nhuộm DNA sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào khay chứa có miệng rộng gel điện di + Nhuộm gel : Ngâm gel điện di vào dung dịch nhuộm 10 phút Rửa gel nước khoảng - phút để loại bỏ phần etyl bromua dư + Quan sát, chụp hình :Cho gel nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn quan sát vạch sáng đỏ DNA xuất gel Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết + - Ðọc giải thích kết Kết phân tích xem xét kết luận mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại DNA với kích tước 520 bp mẫu đối chứng âm sản phẩm Mẫu kết luận dương tính Salmonella có sản phẩm khuếch đại 520 bp gel Mẫu kết luận âm tính sản phẩm khuếch đại, haysản phẩm khuếch đại có kích thước khác 520 bp 2.2.2 Phương pháp ELISA ELISA sử dụng rộng rãi dạng kiểu thương mại cải tiến để tự động hóa ELISA sử dụng để phát định lượng vi sinh thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh Kĩ thuật có độ nhạy khoảng 10 CFU/ml nhiên phải thực bước tăng sinh tăng sinh chọn lọc trước thực phản ứng miễn dịch Transia Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) kit phát nhanh Salmonella spp dựa nguyên tắc E sanwich Khi hỗn hợp tăng sinh chọn lọc cho vào giếng, có diện vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiêm mao vi sinh vật tạo phức hợp với kháng thể cố định giếng kháng thể tự có gắn enzyme peroxydase tạo thành phức hợp kép (sanwhich) Sau kháng thể có gắn enzyme dạng tự không tạo phức hợp sanwhich bị rửa khỏi phản ứng Phức hợp sanwihch phát nhờ bổ sung chất phản ứng (ure peroxide teramethylbenzidine).Enzyme peroxide thủy phân chất tạo phản ứng màu xanh dương Phản ứng kết thúc cách bất hoạt enzyme dung dịch kết thúc làm acid hóa môi trường lầm môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng.Sự hình thành 26 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm màu vàng chứng minh diện kháng nguyên hay vi sinh vật mục tiêu mật độ màu vi sinh vật xác định cách đo cường độ màu máy so màu 2.2.3 Các biện pháp kiểm soát Salmonella thực phẩm Đối với gia súc gia cầm: Trong chăn nuôi cần ý đề phòng bệnh tật cho chúng Phải kiểm tra thú y giết súc vật, điều làm tốt có hội bán xuất loại thịt nhiễm Salmonella Trong giết thịt phải đảm bảo tính riêng rẽ, tránh lây lan vi khuẩn, ý tới loại dụng cụ dùng giết thịt Trong bảo quản thực phẩm, đảm bảo thời gian cất giữ thực phẩm chế biến nguyên liệu Chú ý thịt băm, patê thịt nghiền mà không ướp lạnh sau tạo điều kiện cho toàn khối nguyên liệu nhiễm trùng mau chóng Đun sôi thực phẩm trước ăn biện pháp tốt Thịt ướp lạnh thời gian đun nấu phải kéo dài bình thường, đun phải đảm bảo nhiệt độ sôi bên miếng thịt (ít phút) Thực phẩm thừa, thực phẩm dự trữ phải đun lại trước ăn Với trứng bị nhiễm Salmonella sớm đẻ (trứng vịt, ngan, ngỗng ), phải chế biến chín hoàn toàn, tuyệt đối không ăn sống hồng đào.Bảo đảm vệ sinh nơi ăn, tránh ruồi, nhặng, chuột Thực nghiêm ngặt chế độ khám tuyển trước vào khám định kỳ (1 năm/1 lần) người tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm thực phẩm nấu chín CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CỤ THỂ 27 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm 3.1 Nguyên tắc Salmonella phát ( phân tích định tính ) quy trình bao gồm bước tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập khẳng định Salmonella thường có mặt mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương diện chung với số lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh ức chế tăng trưởng Salmonella - - - - Bước tăng sinh : tùy theo đặc tính thành phần hóa học mẫu cần chọn quy trình tăng sinh phù hợp Thông thường tỷ lệ mẫu môi trường tăng sinh : 9, nhiên tùy trường hợp mà tỷ lệ thay đổi Bước tăng sinh chọn lọc : Các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng để phát Salmonella mẫu thực phẩm Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth (TT )… Các nghiên cứu gần cho thấy môi trường RV thay cho môi trường khác để phân tích nhiều mẫu khác Tuy vậy, môi trường TT thường dùng để phân tích mẫu thịt tươi sống, mẫu có mật độ nhiễm cao, mẫu thức ăn gia súc… Hiện người ta khuyến khích nên dùng hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc để phát tất serotype Salmonella có diện mẫu Bước phân lập : nhằm tách nhận dạng Salmonella khỏi quần thể vi sinh vật khác mẫu Nhiều loại môi trường rắn khác sử dụng để phân lập Salmonella, môi trường giúp nhận dạng giống nhóm dựa vài đặc tính Hiện nay, tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng loại môi trường phân lập khác để tăng cường khả phát tất dòng Salmonella, đặc biệt môi trường XLD khuyến khích sử dụng Bước khẳng định : nhằm xác định lại khuẩn lạc đặc trưng Salmonella xuất môi trường phân lập Bước dựa thử nghiệm sinh hóa thử nghiệm huyết đặc trưng cho Salmonella Các thử nghiệm sinh hóa khuyến khích sử dụng KIA/TSI, indol, LDC (Lysine decarboxylase), ODC ( Ornithine decarboxylase ), urea, manitol, sorbitol, thử nghiệm huyết O H đa giá Áp dụng tiêu chuẩn: TCVN 4829:05 3.1.1 Dụng cụ thiết bị  Dụng cụ Bình tam giác, cốc, ống đong hình trụ 50, 100, 500 ml, ống nghiệm, hộp đĩa petri, que cấy vòng, que cấy thẳng, đèn cồn, bao PE vô trùng, kéo cắt, pince kim loại, khay kim loại, lame, bơm hút chân không 28 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm  Thiết bị Cân phân tích, máy đo pH, máy dập mẫu,pipetman, kính hiển vi, nồi hấp autoclave, tủ sấy vô trùng, tủ cấy an toàn sinh học, tủ ấm 370C, tủ lạnh 3.1.2 Môi trường hóa chất  Hóa chất Các loại kháng huyết O đa giá, hỗn hợp OMA, OMB kháng huyết đơn nhóm A, B, C, D, E Các loại kháng huyết Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất Các loại carbonhydrate sorbitol, dulcitol Cồn 70 o, cồn 96o nước cất  Môi trường Bao gồm loại môi trường thông dụng để nuôi cấy, phân lập khẳng định Salmonella thực phẩm: Môi trường Buffered Pepton Water (BPW): sử dụng để tiền tăng sinh Salmonella diện mẫu Thành phần môi trường gồm: peptone 10 g/l, NaCl g/l, Na2HPO4.12H2O g/l, KH2PO4 1,5 g/l, hấp khử trùng 121oC 15 phút, pH sau khử trùng • Môi trường Rapparport Vassiliadis broth (RV): sử dụng để tăng sinh chọn lọc cho Salmonella Thành phần môi trường sau: peptone đậu nành 4,5 g/l, MgCl2.6H2O 29 g/l, NaCl g/l, K2HPO4 0,6 g/l, malachite green oxalate 0,036 g/l, pH 5,5 0,2 Phân phối 10ml môi trường vào ống nghiệm Hấp khử trùng 115oC 15 phút • Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate agar (XLD): dùng để phân lập Salmonella Thành phần XLD bao gồm: cao nấm men g/l, L – Lysine HCl g/l, xylose 3,75 g/l, lactose 7,5 g/l, sucrose 7,5 g/l, sodium desoxycholate g/l, NaCl g/l, Na2S2O5 6,8 g/l, ammonium ferrous (II) citrate 0,8 g/l, phenol red 0,8 g/l, agar 18 g/l, pH cuối 7,4 0,2 Đun sôi môi trường, không hấp Để nguội đến 50oC Môi trường đỗ đĩa petri để khô trước cấy • Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA): sử dụng để bảo quản phục hồi giống vi sinh vật trình thí nghiệm Thành phần TSA gồm: tryptone 15 g/l, peptone đậu nành g/l, agar 15 g/l Đun nóng để hòa tan agar cốc bercher, phân phối vào ống nghiệm khoảng – ml Hấp khử trùng 121oC 15 phút, pH sau khử trùng 7,3 Sau để nguội khoảng 50 – 60oC để thạch nghiêng • 29 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm • • • • • • • • Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI) gồm môi trường có thành phần sau: peptone 20 g/l, NaCl g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, glucose g/l, Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O 0,2 g/l, Na2S2O3 0,2 g/l, phenol red 0,025 g/l, agar 13 g/l môi trường gồm thành phần sau: cao thịt 3g/l, cao nấm men 3g/l, peptone 15g/l, proteose peptone g/l, glucose g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, FeSO4 0,2 g/l, NaCl g/l, Na2S2O3 0,3 g/l, phenol red 0,024 g/l, agar 12 g/l Phân phối vào ống nghiệm, ống ml Hấp khử trùng 121oC 15 phút, sau đợi nguội khoảng 50 – 60oC để nghiêng phần thạch sâu đáy ống cao 2,5 cm Môi trường Mannitol phenol red broth: sử dụng để thử nghiệm khả lên men đường mannitol Salmonella Thành phần môi trường bao gồm: peptone thịt g/l, peptone đậu nành g/l, mannitol 10 g/l, NaCl g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau khử trùng 7,4 0,2 Môi trường Lysine Decarboxylate broth (LDC): sử dụng để thử nghiệm khả sinh enzyme lysine decarboxylase Salmonella Thành phần môi trường sau: peptone g/l, cao nấm men g/l, dextrose g/l, L-Lysine HCl 10 g/l, ferric (II) ammonium citrate 0,5 g/l, Na2S2O5 0,04 g/l, bromocresol purple 0,016g/l, pH 6,7 Môi trường Urea broth: dùng để thử nghiệm khả thủy phân urea Salmonella Thành phần môi trường sau: cao nấm men 0,1 g/l, KH2PO4 9,1 g/l, Na2HPO4 9,5 g/l, urea 20 g/l, phenol red 0,08 g/l, pH 6,8 Môi trường Sorbitol phenol red broth: sử dụng để thử nghiệm khả lên men đường sorbitol Salmonella Thành phần môi trường gồm có: peptone thịt g/l, peptone đậu nành g/l, sorbitol 10 g/l, NaCl g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau trùng 7,4 0,2 Môi trường Dulcitol phenol red broth: sử dụng để thử nghiệm khả lên men đường dulcitol Salmonella Thành phần môi trường gồm có: peptone thịt g/l, peptone đậu nành g/l, dulcitol 10 g/l, NaCl g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau trùng 7,4 0,2 Môi trường Malonate broth: sử dụng để thử nghiệm khả sử dụng malonate Salmonella Thành phần môi trường bao gồm: ammonium sulphate g/l, dipotassium phosphate 0,6 g/l, monopotassium phosphate 0,4g/l, sodium chloride g/l, sodium malonate g/l, bromthymol blue 0,025 g/l Phân phối ml vào ống nghiệm Hấp 115oC 10 phút pH cuối 6,7 0,2 Môi trường Lactose agar 1%: sử dụng để cảm ứng tạo enzyme β - galactosidase dùng thử nghiệm ONPG Thành phần môi trường sau: lactose 10 g/l, peptone g/l, cao thịt g/l, NaCl 10 g/l, agar 15 g/l Đĩa giấy ONPG: sử dụng để thử nghiệm ONPG khả tổng hợp enzyme - galactosidase Mỗi đĩa phân phối vào ống nghiệm chứa 0,5ml nước cất vô trùng Đĩa giấy ONPG sản xuất hãng Biorad dạng thương phẩm 30 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm 3.1.3 So sánh môi trường SPW BPW Tiêu chí so sánh Thành phần môi trường Vai trò Cơ chế pH sau khử trùng Nhiệt độ thời gian khử trùng Phạm vi sử dụng Điều kiện bảo quản sau hấp khử trùng 3.2 BPW − NaCl 5g − Pepton 10g − Nước cất lít − Na2HPO4 3,5g − KH2PO4 1,5g Là môi trường tiềm tăng sinh không chọn lọc để phân lập samollena từ thực phẩm Cung cấp dinh dưỡng cho trình hồi phục tế bào bị tổn thương trình bảo quản thực phẩm SPW − − − NaCl 1g Pepton 8,5g Nước cất lít Là môi trường dùng để pha loãng mẫu pH = 7.2± 0.2 Hấp áp lực 15 phút nhiệt độ 121oC pH = 7± 0.2 Hấp áp lực 20 phút nhiệt độ 121oC Sử dụng môi Sử dụng môi trường trường kiểm tra vi sinh vật kiểm tra nhiều loại vi sinh hiếu khí, coliforms, E.coli, vật gây bệnh thuộc họ Clostridium perfringens, Enterobacteriaceae Staphylococcus aureus Môi trường bảo Môi trường bảo quản mát 45oC bể quản mát 45oC bể điều nhiệt điều nhiệt Phương pháp thực 31 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm 3.2.1 Tăng sinh Đối với loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW đồng mẫu 15 30 giây Ủ 37 0C 18 32 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm – 24 Đối với số loại mẫu có chứa chất gây độc ức chế phát triển Salmonella cần tiến hành quy trìnhđặc biệt : - - Đối với thịt gia cầm tươi sống : Đặt gia cầm vào túi PE lớn, cho thêm lít BPW, lắc máy lắc 30 giây để môi trường thấm vào toàn mẫu Đối với mẫu sữa khô : Cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, cho thêm 225ml BPW, để yên nhiệt độ phòng khoảng 60 phút Sau lắc cho tan hoàn toàn Đối với mẫu gia vị hay loại thực phẩm chứa nhiều gia vị : đồng mẫu với tỷ lệ 1/100 BPW ( thay 1/10 bình thường ) trước tăng sinh Biện pháp nhằm giảm nồng độ chất ức chế tăng trưởng Salmonella bước tăng sinh Đối với loại mẫu casein, phomat, bơ sản phẩm tương tự khác : thực dồng mẫu môi trường tăng sinh làm ấm đến 40 C Đối với sản phẩm chứa coca: đồng mẫu môi trường Skim Milk Broth làm ấm đến 40 C Đối với dừa, sản phẩm từ dừa mẫu có hàm lượng chất béo cao: đồng mẫu môi trường BPW, sau cho thêm 2– giọt Triton X –100 trước ủ tăng sinh 3.2.2 Tăng sinh chọn lọc Lắc để trộn dịch tăng sinh, sau chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV ủ ấm đến 42 0C Ủ 420C 18 – 24 giờ, cần thiết kéo dài ủ thêm 24 Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác sử dụng, loại môi trường có tác dụng chọn lọc dựa đặc điểm phát triển Salmonella, số dòng tăng trưởng môi trường mà tăng trưởng môi trường khác Do vậy, để tăng khả phát tất dòng Salmonella diện thực phẩm cần phải dùng hai loại tăng sinh chọn lọc khác cho mẫu Ngoài môi trường cần ủ nhiệt độ khác 3.2.3 Phân lập nhận diện Dùng que cấy vòng thực kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho Salmonella XLD, HE, BS… Cường độ chọn lọc mức độ phân biệt thể hình thái khuẩn lạc Salmonella môi trường khác Để chọn lọc nhận dạng tất dòng Salmonella cần sử dụng hai loại môi trường chọn lọc phân biệt khác cho mẫu Các biểu Salmonella môi trường khác sau 33 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm - Môi trường XLD: khuẩn lạc tròn, lồi, suốt, có hay tâm đen, tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng - Môi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay tâm đen, tâm đén lớn bao trùm khuẩn lạc 34 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm - Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu sau chuyển sang màu đen kéo dài thời gian ủ 3.2.4 Khẳng định Từ môi trường phân lập cấy chuyển khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường không chọn lọc TSA Ủ 37 0C 18 – 24 Các khuẩn lạc đặc trưng môi trường sử dụng cho test sinh hóa huyết - Các thử nghiệm sinh hóa cần thực cho Salmonella là: lên men glucose, urea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol - Các chủng Salmonella cho kết thử nghiệm sau : • Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI): Thử nghiệm khả lên men lactose, glucose sinh khí H2S  Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa loại đường 1% lactose 0.1% glucose Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường có trường hợp xảy tăng trưởng VSV: sử dụng glucose, sử dụng glucose lactose, không sử dụng hai đường Salmonella lên men đường glucose phần nghiêng môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng Thời gian ủ từ 18-24  Về sinh hơi: đa số dòng Salmonella có khả sinh H 2S nên có xuất vệt màu đen môi trường Có thể thấy tượng sinh qua tượng làm vỡ thạch môi trường môi trường bị đẩy lên tạo khoảng không bên đáy ống nghiệm - 35 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Thử nghiệm KIA Ống 1: môi trường KIA VSV Ống 2: xuất màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose cũngtốt) Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí Ống 4: màu đỏ phần thạch nghiêng, màu vàng đáy chứng tỏ VSV lên men glucose Ống 5: màu đen xuất chứng tỏ có trình khử lưu huỳnh sinh H2S • Thử nghiệm khả tổng hợp enzyme lysine decarboxylase (thử nghiệm LDC): dùng que cấy vòng chuyển sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường LDC broth Ủ 37oC 24 giờ, Salmonella cho phản ứng kiềm có biểu LDC dương tính môi trường có sinh khối chuyển sang màu tím màu xanh 36 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm • • Thử nghiệm urea : Dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ môi trường TSA cấy chuyển sang môi trường Urea phenol red Ủ 370C 24 giờ, Salmonella không thủy giải urea nên không làm chuyển màu môi trường Những vi sinh vật có phản ứng urea dương tính làm tăng pH môi trường nên sau nuôi cấy môi trường chuyển sang màu đỏ hồng Kết thử nghiệm urea Thử nghiệm VP (-):môi trường sử dụng môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9 Dùng que cấy vòng cấy vào ống môi trường MR-VP sinh khối từ khuẩn lạc chủng ủ 18-24 môi trường KIA Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A 5% α-naphthol cồn tuyệt đối, dung dịch B 40% NaOH hay KOH Trước tiên nhỏ giọt dung dịch A, sau nhỏ giọt dung dịch B Đọc kết sau 20 phút chậm Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có tượng không đổi màu bề mặt môi trường Thử nghiệm VP (+) có màu đỏ bề mặt môi trường 37 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Kết thử nghiệm VP(-) Bảng biểu đặc trưng củaSalmonella test sinh hóa Thửnghiệm Môi trường Biểu đặc trưng H2 S TSI/KIA LDC LDC Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch xuất vạch đen Không đổi màu Urea Urea Không đổi màu Manitol,sorbitol Manitol, sorbitol Bị acid hóa,môi trường chuyển sang màu vàng Indol Trypton Không xuất vòng đỏ nhỏ thuốc thử Kovac’s VP VP Không đổi màu nhỏ α – napthol 5% KOH 40% 3.2.5 Khẳng định Salmonella kháng huyết 38 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Các thử nghiệm kháng nguyên cần thử nghiệm song song với mẫu đối chứng nước muối sinh lý để tránh tượng ngưng kết giả Hai loại huyết đa giá cần dùng Salmonella Polyvalent O Salmonella Polyvalent H Phản ứng (+) chủng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết không ngưng kết với nước muối sinh lý Thông thường tiến hành thử phản ứng ngưng kết với kháng huyết O đa giá đơn giá để xác định chủng phân lập Salmonella Chia lame kính làm hai phần: phần nhỏ giọi nước muối sinh lý để làm đối chứng âm nhỏ giọt huyết Lấy sinh khối vi sinh vật từ môi trường TSA khuyếch tán vào giọt huyết thanh, làm tương tự với giọt nước muối sinh lý, tán Chờ 30 – 60 giây quan sát đen, phản ứng ngưng kết kháng huyết xảy tượng ngưng kết giọt nước muối sinh lý hỗn hợp đục sữa, giọt huyết có tượng ngưng kết, xuất kết tủa dạng hạt dạng sợi, dịch huyết lại suốt Sau trình thử nghiệm phản ứng sinh hóa phù hợp có ngưng kết huyết O đa giá đơn giá kết luận Salmonella dương tính 25 g mẫu Chỉ làm phản ứng với kháng huyết sau xác định sinh hóa Thực phản ứng ngưng kết với kháng huyết O đa giá vi khuẩn Salmonella trước, sau làm kháng huyết đơn giá sau TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella thực phẩm Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm- Trần Linh 10 Phước Công nghệ vi sinh vật ( tập1-2) – Nguyễn Đức Lượng Công nghệ vi sinh vật-Lương Đức Phẩm Ngộ độc an toàn thực phẩm-Lê Ngọc Tú Vi sinh vật học-Nguyễn Lân Dũng http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-ve-vi-khuan-salmonella-11369/ http://www.about-salmonella.com/ http://www.textbookofbacteriology.net/salmonella.html http://en.wikipedia.org/wiki/Salmonella http://www.cdc.gov/salmonella/general/ 40 [...]... toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm nhất định Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định không... diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại thực phẩm Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT của Bộ Y tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella. .. với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella 18 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo Thông tư 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA 2.1 Phương pháp truyền thống : Phát hiện Salmonella. .. với người tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm nhất là thực phẩm đã nấu chín CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CỤ THỂ 27 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm 3.1 Nguyên tắc Salmonella có thể được phát hiện ( phân tích định tính ) bằng một quy trình bao gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có mặt trong mẫu với một số lượng nhỏ,... 45oC trong bể quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt điều nhiệt Phương pháp thực hiện 31 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm 3.2.1 Tăng sinh Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây Ủ ở 37 0C trong 18 32 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm. .. do kiểm tra bịnhiễm khuẩn Salmonella 1.3.7.2 Trong nước 17 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm Theo ông Nguyễn Công Khẩn, Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện nay, mạng lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nước nhưng thực tế năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địa phương vẫn rất hạn chế Trong 330 mẫu hoa quả có tới... phát hiện Salmonella trong thực phẩm 2.2.1 Phương pháp PCR Nguyên tắc : Phương pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn UV có bước sóng là 302 mm Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch... chung cho tất cả các dòng Salmonella Mỗi loại môi trường tăng sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi 20 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm trường khác Ví dụ: S typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT;... lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990 trở lại đây, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện, sự sai lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể gấp 10 lần như thế Ở Mỹ, tình trạng có khá hơn, ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do kiểm soát tốt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa,... vàng.Sự hình thành 26 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm màu vàng chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên hay vi sinh vật mục tiêu và mật độ màu của vi sinh vật có thể xác định được bằng cách đo cường độ màu bằng máy so màu 2.2.3 Các biện pháp kiểm soát Salmonella trong thực phẩm Đối với gia súc và gia cầm: Trong chăn nuôi cần chú ý đề phòng bệnh tật cho chúng Phải