Định tính salmonella trong thực phẩm

Định tính salmonella trong thực phẩm

KHOA: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Tên đề tài:

ĐỊNH TÍNH SAMONELLA TRONG

THỰC PHẨMGVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh

Lớp: 02ĐHTP1

Nhóm: 4

Tp.HCM , ngày 14 tháng 5 năm 2014

MỤC LỤC

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

1

- Tìm kiếm tài liệu

- Làm word

- Thuyết trình Tích cực

Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ như Clostridium butolinum,

Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… trong đó, Salmonella là loài vi sinh vật gây

ngộ độc rất nguy hiểm Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây ra bệnh thương hàn,

nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác

Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện

cũng như cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella, chúng tôi thực hiện nghiên

cứu đề tài “định tính samonella trong thực phẩm” để có cái nhìn tổng quan hơn về vi

khuẩn Salmonella và một số chủng vi sinh vật khác.

NỘI DUNG CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VỀ SALMONELLA

1.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả

và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella Nhưng sau đó Schweinittz

và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên và đã xác định S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn

Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là S.enteritidis Vi khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner…

Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được S.pullorum năm 1909 Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn bệnh

có tên chung là S.gallinarum–pullorum

Năm1896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S.paratyphi equi

và S.paratyphi bacilus Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S.paratyphi Bvà đến năm 1898,S.paratyphi Ađã tìm được do N.Guyn và H Keyser

Vi khẩn Salmonella

1.2 Phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh.

- Về phân loại khoa học Salmonella được

Các loài điển hình:

 Salmonella typhi: Gây bệnh thương hàn

Hình 1.2 Vi khuẩn Salmonella typhi

 Salmonella cholera_suis: Gây bệnh nhiễm trùng máu

Hình 1.3 Vi khuẩn Salomonella cholera_suis

 Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa

Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), hoặc theo vật chủ như S.typhimurium gây bệnh ở chuột,về sau người ta thấy rằng 1 loài Salmonella có thể gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài khác nhau Vì những lý

do đó mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như S.teheran,S.congo,S.london

Hiện nay theo phân loại của hệ thống Viện Pasteur thế giới, Trung tâm Kiểm soát

và ngăn ngừa dịch bệnh của Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center), giống Salmonella được chia làm hai loài: S enterica và S bongori Trong đó S bongori gồm tất

cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và S enterica được chia làm 6 loài phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI Các loài và loài phụ này có thể phân biệt được bằng phản ứng sinh hóa Trong mỗi loài phụ có nhiều kiểu huyết thanh

Cho đến nay đã xác định được trên 2463 kiểu huyết thanh thuộc giống Salmonella Theo hệ thống của Kauffman White, các kiểu huyết thanh này được chia dựa trên kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H và kháng nguyên bề mặt Vi Phần lớn các kiểu huyết thanh được đặt tên theo công thức kháng nguyên, một số khác được đặt tên riêng như Enteritidis (S enteritidis), Typhi (S typhi), Paratyphi (S paratyphi), Typhimurium (S typhimurium)…

Bảng phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh

S enterica

S bongori

S enterica enterica (I)

S enterica salamae (II)

S enterica arizonae (IIIa)

S enterica diarizonae (IIIb)

S enterica houtenae (IV)

S enterica indica (VI)(V)

1454489943243241220

Loài phụ S enterica I hầu như chiếm đa số (99%), nó được tìm thấy ở hầu hết các động vật máu nóng Loài phụ này chiếm 59% (1454/2463) trong tổng số kiểu huyết thanh của Salmonella có khả năng xâm nhập và gây nhiễm cao cho người và động vật máu nóng, trong khi đó các loài phụ khác hầu như ở động vật máu lạnh và môi trường Như vậy có tới 41% (1009/2463) số kiểu huyết thanh không được phân lập từ bệnh phẩm

của người, đây là một tỉ lệ rất có ý nghĩa để các cơ quan chức năng xem xét và sữa đổi các tiêu chuẩn hiện hành về Salmonella trong thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà sản xuất tiêu thụ thực phẩm

1.3 Đặc điểm

1.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý kích thước trung bình

từ 0,5-3 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S gallimarum và S pullorum, không tạo bào

tử, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 60C – 45,60C, thích hợp nhất ở 370C, phát triển trong

pH 4.1- 9.0 Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày

Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate).Trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella

Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ

1.3.2 Tính chất hóa sinh

Salmonella lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose, lactose, salicin và inositol, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S,sử dụng được citrate ở môn trường Simmons

Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các ngoại

lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.Cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli, Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác

1.3.3 Cấu trúc của Salmonella

Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiên mao H và kháng nguyên vỏ

K Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên Vi (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu

- Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O)

• Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide

• Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố của Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS) Tính đặc hiệu của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau : kháng nguyên O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần : Lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O Màng ngoài còn có thêm các protein: Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài

• Kháng nguyên tiên mao (kháng nguyên H)

- Kháng nguyên H: Chỉ có ở các Salmonella có lông Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm Kháng nguyên H là một loại kháng nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O Kháng nguyên H rất dễ bị phá huỷ ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu

• Kháng nguyên H chia làm 2 phase :

 Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị bằng chữa số La tinh thường: a, b, c…

 Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữa số Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x…

• Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn bởi các roi của chúng Sự ngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có khả năng cắt roi của vi khuẩn

• Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, nó đặc hiệu cho các loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp huyết thanh.

- Kháng nguyên vỏ K

• Kháng nguyên K: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu hiện độc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O khi nó phát triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn và HCl

• Không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type huyết thanh S.typhi và S.paratyphi Kháng nguyên Vi-angtigen được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935 Kháng nguyên Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt

vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, khánh nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh

Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella

1.3.4 Yếu tố độc lực

Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố

- Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật

- Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm Ngoại

độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột

1.3.4.1 Nội độc tố - Endotoxin

Màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng, được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharide (LPS) LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi

và vùng lipit A

Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâm nối kháng nguyên O với vùng lipit A Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi khuẩn Cấu trúc nội độc tố gần giống cấu trúc của kháng nguyên O Cấu trúc nội độc tố biến đổi

sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella

Nội độc tố thường là lipopolysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm ba cầu B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách.Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hoá,

hệ thống miễn dịch; với các biểu hiện bệnh lý: Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hoá, mất tính thèm ăn…

Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, kích thích hình thành kháng thể

- LPS tác động lên các tếbào tiểu cầu, gây sốt nội độc tố, theo cơ chế :

• Giải phóng các chất hoạt động mạnh như: Histamin

• Ngưng kết các tiểu cầu động mạch

• Đông vón, tắc mạch quản

- LPS tác động lên quá trình trao đổi gluxit: LPS làm tăng cường hoạt lực của các men phân giải glucoz, các men phân giải glycogen, làm giảm hoạt lực các men tham gia quá trình tổng hợp glycogen…

1.3.4.2 Độc tố đường ruột

Về cơ chế miễn dịch và di truyền các Enterotoxin của Salmonella có quan hệ gần gũi với Choleratoxin, nên được gọi là Choleratoxin like enterotoxin (CT) Còn về đặc

tính sinh học Enterotoxin của Salmonella không chỉ với giống CT mà còn giống với Enterotoxin của E.Coli

Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm xuất nhanh Rapid permeability facto (RPF) và độc tố thẩm xuất chậm Delayed permeability facto (DPF)

RPF giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, nó thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1-2 giờ và kéo dài 48 giờ và làm trương các tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của E.Coli, được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella ST có khả năng chịu được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở nhiệt độ -20oC Cấu trúc phân tử gồm một chuỗi polysaccharide và một chuỗi polypeptide

RPF kích thích co bóp nhu động ruột, làm tăng sự thẩm thấu thành mạch, phá huỷ

tổ chức tế bào biểu mô ruột, giúp vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế bào và phát triển tăng nhanh về số lượng Vi khuẩn tích cực tăng cường sản sinh độc tố làm rối loạn cân bằng trao đổi muối, nước và chất điện giải Quá trình bệnh lý đường ruột và hội chứng tiêu chảy càng thêm phức tạp và nghiêm trọng

DPF của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E.Coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella Nó thực hiện chức năng phản ứng chậm từ 18-24 giờ LT bị phá huỷở 700C trong vòng 30 phút vàở 560C trong vòng 4 giờ LT có cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptid

DPF làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hoá lớp tếbào villi của thành ruột, gây tiêu chảy

1.3.4.3 Độc tố tế bào

Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy thì kèm theo hiện tượng mất nước và mất chất điện giải là hiện tượng hàng loạt các tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ hoặc bị tổn thương ở các mức độ khác nhau Sự phá huỷhay tổn thương đó là do độc tố tế bào củaSalmonella gây nên, theo cơ chế chung là:Ức chếtổng hợp protein của tế bào Eukaryotic và làm trương tế bào CHO

Ít nhất 3 dạng độc tố của tế bào:

- Dạng thứ nhất: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin Dạng này được phát hiện ở rất nhiều serovar Salmonella; có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 56 đến 78

kDa; không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tố Shigella toxin hoặc Shigella - like Độc tố dạng này tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào

- Dạng thứ hai: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi khuẩn có cấu trúc và chức năng gần giống các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng (ETEC) sản sinh ra Dạng độc tố này cũng phổ biến ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh

- Dạng thứ ba: Có trọng lượng phân tử khoảng 62 kDa; có liên hệ với độc tố Hemolysin Hemolysin liên hệ với các độc tố tế bào có sự khác biệt với các Hemolysin khác về trọng lượng phân tử và phương thức tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào

1.3.5 Cơ chế gây bệnh

Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào trong một gram thực phẩm Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụthực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7 ngày Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễmSamonella đều bị ngộ độc Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễmSamonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy sản Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp Đặc biệt nguy hiểm cho người là các loàiSamonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn

Các chủng Salmonella và các biểu hiện bệnh thường gặp

1.3.5.1 Cơ chế gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn do S.typhi và S.paratyphi A, B, C gây ra Các yếu tố độc lực chính của vi khuẩn thương hàn là khả năng bám và xâm nhập vào tế bào chủ, khả năng nhân lên trong đại thực bào và nội độc tố Kháng nguyên Vi có mặt ở S.typhi và S.pararatyphi C là yếu tố độc lực quan trọng, những chủng vi khuẩn gây bệnh thương hàn không có kháng nguyên Vi thì số lượng cần thiết để gây bệnh cao hơn rấtnhiều so với những chũng có kháng nguyên này

Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa do thức ăn hay nước uống bị nhiễm bẩn, số lượng cần thiết để gây bệnh vào khoảng 10 5 đến 10 7

Đầu tiên, vi khuẩn thương hàn phải vượt qua môi trường axit của dạ dày, mặc dù chúng có khả năng đề kháng với axit nhờ có gen art (acid response tolerance), nhưng ở người bình thường, vi khuẩn thương hàn không thể tồn tại lâu, nuôi cấy dịch dạ dày âm tính sau 30 phút Sau khi vượt qua được rào cản ở dạ dày, vi khuẩn di chuyển xuống ruột non rồi nhân lên ở đó, nhưng trong tuần đầu sẽ có 1 ít vi khuẩn đào thải theo phân, cấy phân dương tính trong 5 ngày không có nghĩa là bệnh thương hàn sẽ xảy ra Từ ruột non,

vi khuẩn thương hàn đi vào hạch mạc treo ruột nhờ tế bào M, một đại thực bào của mảng Peyer Sau đó theo đường bạch huyết và máu gây nhiễm trùng toàn thân Sau khoảng một tuần, nhiễm khuẩn huyết thứ phát xuất hiện Vi khuẩn theo gan qua đường mật lại tiếp tục xâm nhập vào ruột non, tiếp tục nhân lên ở các mảng Peyer Từ máu, vi khuẩn tới lách và các cơ quan khác Trong ruột non, vi khuẩn chết và giải phóng ra nội độc tố Nội độc tố kích thích dây thần knh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây thủng ruột,

vị trí gây tổn thương thường nằm ở các mảng Peyer Đây là biến chứng hay gặp ở cá bệnh nhân ăn sớm khi chưa bình phục, nhất là ăn các thức ăn cứng Nội độc tố theo máu lên hệ thần kinh và kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba Giai đoạn toàn phát bệnh, bệnh nhân sốt cao, biểu đồ thân nhiệt tăng lên theo thởi gian Thân nhiệt tăng những nhiệt độ không tăng gây ra hiện tượng mạch và nhiệt độ phân ly

Thời kì chưa có điều trị bằng kháng sinh, khoản một tuần ủ bệnh, diễn biến điển hình của bệnh thương hàn trải qua 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn khoảng một tuần, Tuần thứ nhất thân nhiệt tăng cao, tuần thứ hai thì đau bụng, gan và lách to dồng thời có sự xuất hiện của các đốm hồng trên da, tuần thứ 3 có thể xuất hiện thêm các biến chứng như xuất huyết, thủng ruột, tuần thứ 4 sẽ xuất hiện thêm các biến chứng nguy hiểm dẫn đến tử vong, nếu không bệnh nhân sẽbình phục

Bệnh nhân thường đau đầu, buồn nôn hoặc nôn, chướng bụng, tiêu chảy, khoảng 50% bệnh nhân sờ thấy gan và lá lách dưới sườn Những trường hợp nặng thường có dấu hiệu ly bì, hôn mê, trụy tim mạch, không chữa trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong Những biến chứng khác như viêm phổi cấp, viêm màng não, viêm gan, viêm tủy xương cũng có thể gặp

Những bệnh nhân qua khỏi có khoảng 5 – 10% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua phân trong quá trình hồi phục và 1- 4% trở thành người mang vi khuẩn lâu dài do vi khuẩn vẫn tồn tại trong túi mật Tình trạng này có thể kéo dài đến nhiều năm và họ trở thành nguồn mang bệnh rất nguy hiểm

1.3.5.2 Cơ chế gây nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn

Bênh thường xảy ra do ăn phải thức ăn bị nhiễm Salmonella, nhưng cũng có thể lây truyền trực tiếp Căn nguyên thường do vi khuẩn S.enteritidis và S.typhimurium

Vi khuẩn xâm nhập qua ruột non nhờ các tế bào M của mảng Peyer Trên bộ gen của Salmonella có các tác nhân gâyức chế các chất kháng khuẩn có trong lysosome, biến đổi tế bào chủ đảm bảo cho sự tồn tại của vi khuẩn, làm cản trở hoạt động nội bào như giảm lượng NADH oxidase rất cần thiết cho việc sản xuất các hợpchất kháng khuẩn

Sự hủy hoại của đại thực bào và các tế bào biểu mô lân cận, sự chết của vi khuẩn giải phóng nội độc tố đã gây nên tổn thương cho cơ thể vật chủ và gây ra các triệu chứng

Thời gian ủ bệnh trung bình từ 10 – 48 giờ Sau thời gian ủ bệnh, người nhiễm thường có biểu hiện như sốt, nôn, đau bụng và tiêu chảy Mức độ sốt khác nhau tùy vào thể trạng từng người, tiêu chảy phân thường không có máu Ở người lớn thường chỉ dẫn đến tình trạng rối loạn đường tiêu hóa, nhưng ở trẻ sơ sinh thường gây ra nhiễm trùng rất nặng, có thể dẫn đến tình trạng nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não và viêm xương Ở những người khỏe mạnh, nhiễm trùng do nhiễm độc thức ăn thường tự khỏi sau 2-5 ngày rồi tự khỏi

1.3.6 Nguồn gốc lây nhiễm

Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn Tất cả các thức ăn tươi sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn này sống tự do trong ruột động vật và có trên lông Gia cầm có nhiều Salmonella nhất, tiếp theo là các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch, chim mông biển, loài gặm nhấm, rắn) Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuất các chất từ động vật như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng, loài gặm nhấm, chim hoặc các sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm

Ngoài ra có thể bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này Thực phẩm

có nguồn gốc thực vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt

vi khuẩn lactic nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ như bột nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang nhiều Salmonella, nên trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xuyên qua vỏ trứng và sinh sản trong lòng đỏ trứng

Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất béo sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết bị đều có thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi choSalmonella, và từ đó gây nhiễm độc cho sản phẩm sữa Nếu tiến hành axit hóa chậm thì vi khuẩn dễ dàng sinh sản trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5 Những sản phẩm có sữa phải được giám sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu cóSalmonella trong sữa

bột thì chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khô hạn

và lây nhiễm sang các sản phẩm khác

1.3.7 Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới

1.3.7.1 Trên thế giới

Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990 trở lại đây, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện, sự sai lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể gấp 10 lần như thế Ở Mỹ, tình trạng có khá hơn, ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do kiểm soát tốt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa, trứng, nước trái cây, sản phẩm tươi sống, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt Một đợt dịch gần đây ở

Mỹ gây ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phộng đã gây ảnh hưởng đến hơn 700 người trên khắp nước Mỹ

Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện ở Mỹ đã tăng lên 184 người, thuộc 38 bang khác nhau Cơ quan y tế của nước này vẫn chưa xác định nguyên nhân chính xác khiến số ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanh như vậy Tuy nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguồn lây lan vi khuẩn Salmonella từ các sản phẩm xúc xích.Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi hơn

560 tấn xúc xích do nghi bịnhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả số lượng này đều do Công

ty Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ông Jason Maloni, phát ngôn viên của công

ty này khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản phẩm xúc xích của chúng tôi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella” Sự bùng nổ của số ca nhiễm khuẩn Salmonella

ở khu vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan điều tra nghi ngờ rằng nguồn gây bệnh cho ổ dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau khi họ phát hiện rất nhiều người

ăn xúc xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bị nhiễm khuẩn Salmonella Các nhân viên điều tra tại bangWashington cũng cho biết 14 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella

ở bang này, đã từng ăn xúc xích của hãng Daniele Ngoài ra, các chuyên gia y tế khẳng định họ đã kiểm tra và phát hiện khuẩn Salmonella có trong các mẫu xúc xích của công

ty này Hiện tại, các nhân viên điều tra liên bang Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra nguyên nhân chính xác gây ra dịch nhiễm khuẩn Salmonella ở nước này Vì thế, họ vẫn chưa thể kết luận sản phẩm xúc xích của Công ty Daniele có phải là nguồn lây bệnh chính hay không Vì thế, những sản phẩm xúc xích của công ty này bị thu hồi là do kiểm tra bịnhiễm khuẩn Salmonella

1.3.7.2 Trong nước

Theo ông Nguyễn Công Khẩn, Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện nay, mạng lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nước nhưng thực tế năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địa phương vẫn rất hạn chế Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dư thuốc bảo vệ thực vật cao, nhất là ở táo đỏ, quýt và lê Đặc biệt, trong số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt đã phát hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các bệnh về đường tiêu hóa Hơn nữa, khu vực TP Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những địa phương có tỷ lệ mẫu thực phẩm nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84- 95% mẫu được giám sát

1.3.8 Các chỉ tiêu về Salmonella trong thực phẩm

Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm nhất định Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại thực phẩm Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT của Bộ Y

tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào

Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệm huyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả.Hiện nay đã có nhiều

nỗ lực để rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử nghiệm ELISA, và thử nghiệm DNA Việc khẳng định kết quả âm tính trong vòng 48 giờ

đã là chuyện bình thường Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần tiến hành các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella

Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella

Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo Thông

tư 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN

SALMONELLA

2.1 Phương pháp truyền thống :

Phát hiện Salmonella bằng phương pháp nuôi cấy: Đây là phương pháp định tính

và kết quả được báo cáo là có hay không phát hiện Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm Do quy định không cho phép có mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện, cho nên mẫu lấy tối thiểu phải 25g và quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng sinh để đạt hiệu quả cao Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng qua quá trình bảo quản chế biến và sự tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella

Để phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp

2.1.1 Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment)

Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm Người ta thường sử dụng môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiện diện trong mẫu

đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm

Ví dụ: nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi trường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae; riêng FDA của Mỹ thì thường sử dụng Lactose broth cho một số nhóm thực phẩm

Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh phù hợp Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi

2.1.2 Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment)

Giai đoạn này làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng cách

ức chế hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập

Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng là Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT), Selenite Cystein Broth (SC) …Thông thường môi trường TT được dùng để phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại thực phẩm khác

Một vài nghiên cứu gần đây của AOAC (Association of Official Analytical Communities - Hiệp hội các nhà phân tích của Mỹ) cho rằng mặc dù môi trường Selenite Cystein Broth có chứa selenite ức chế mạnh các vi khuẩn khác ngoại trừ Salmonella nhưng muối sodium biselenite có thể gây ưng thư khi tiếp xúc với cơ thể người nên hạn chế sử dụng và thấy rằng môi trường RV có thể thay thế cho các loại môi trường trên để phân tích mẫu Canh RV có tác dụng ức chế vi khuẩn khác nhờ vào MgCl2 bằng cách tác động lên thành tế bào vi khuẩn và nhờ vào màu xanh malachite ức chế các vi khuẩn Gram dương

Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi trường tối ưu chung cho tất cả các dòng Salmonella Mỗi loại môi trường tăng sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi