Định tính Shigella trong thực phẩm

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Shigella tác nhân gây nên bệnh shigellosis, bệnh nguy hiểm lây lan nhanh cộng đồng từ người sang người, qua đường thực phẩm đường nước uống Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm chủ yếu từ nguyên liệu, từ nước,…Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm Shigella thấp, đạt mức 10 tế bào/g sản phẩm, shigella kiểm sốt nghiêm ngặt thực phẩm, đòi hỏi phương pháp kiểm nghiệm phải nhạy, quy trình kiểm soát chặt chẽ Các loại thực phẩm thường xuyên phân lập Shigella xà lách, thịt băm, thủy sản,…Vậy quy trình định tính phân lập Shigella xin mời cô bạn tìm hiểu với nhóm thơng qua đề tài : “ Định tính Shigella thực phẩm” CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ SHIGELLA PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Hình ảnh: Shigella có dạng hình que thẳng dài - 3, khơng có lơng, không di động Shigella tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn Đây bệnh hay gặp nước ta, rải rác thường xuyên gây thành vụ dịch địa phương Shigella Chantemesse mô tả từ năm 1888 Shiga phân lập lần năm 1898 (vi khuẩn sau mang tên Shigella shiga) Năm 1900, Flexner Strong phân lập tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn có tính chất khác với vi khuẩn Shiga phân lập Đặc điểm sinh học 1.1 Hình thái Shigella trực khuẩn mảnh, bắt màu Gram (-), dài từ 1-3 µm, ni cấy có dạng cầu trực khuẩn Shigella khơng có lơng, khơng có vỏ khơng sinh nha bào 1.2 Tính chất ni cấy Như vi khuẩn đường ruột khác, Shigella vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện phát triển tốt điều kiện hiếu khí Trên mơi trường đặc, chúng tạo thành khuẩn lạc tròn, lồi, bờ đều, có đường kính khoảng 2mm sau 24h Trên mơi trường phân lập có lactose, khuẩn lạc khơng màu PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 1.3 Tính chất sinh hóa - Tất Shigella lên men đường glucose, hầu hết không sinh hơi, - số trường hợp có sinh yếu Các Shigella không lên men lactose, trừ S sonnei có khả lên men - lactose chậm sau từ ngày đến tuần Các Shigella flexneri, Shigella boydii Shigella sonnei có khả lên men - monnitol; S dysenteriae khơng có khả Shigella không sinh H2S, không sử dụng citrat môi trường Simmons, không sinh indol 1.4 Độc tố Các Shigella có nội độc tố số Shigella có ngoại độc tố - Nội độc tố: Nội độc tố có tính độc mạnh, cấu tạo kháng ngun thân, loại kháng nguyên yếu Tác dụng chủ yếu gây phản ứng ruột - Ngoại độc tố: Độc tố độc, mạnh độc tố trực khuẩn uốn ván, có tác dụng đặc hiệu vào hệ thần kinh 1.5 Cấu trúc kháng nguyên Tất Shigella có kháng nguyên thân O, số có kháng ngun K tất khơng có kháng nguyên H 1.6 Phân loại 1.6.1 Phân loại khoa học: Về phân loại khoa học Shigella xếp vào: - Giới : Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gramma Proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Giống: Shigella Castellani & Chalmers 1919 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ - Lồi (có lồi): S boydii, S dysenteriae, S flexneri, S sonnei 1.6.2 Phân loại theo kháng nguyên: Dựa tính đặc hiệu kháng nguyên thân O số tính chất sinh vật hóa học, người ta chia Shigella thành nhóm: Nhóm A (S dysenteriae), nhóm B (S.flexneri), nhóm C (S boydii) nhóm D (S sonnei) S dysenteriae Khơng lên men mannitol, có 10 typ huyết thanh, typ huyết khơng có quan hệ kháng ngun với nhóm khác khơng có quan hệ kháng ngun với Typ (S dysenteriae) có tên trực khuẩn Shiga S.shiga ngồi độc tố sinh ngoại độc tố mạnh S flexneri Có khả lên men mannitol trừ vài ngoại lệ Có typ huyết thanh, typ huyết có thành phần kháng nguyên đặc hiệu typ thành phần kháng nguyên chung cho typ S boydii Có khả lên men mannitol trừ vài ngoại lệ Được chia thành 15 typ huyết S sonnei Có khả lên men mannitol, nhóm có khả lên men lactose chậm, có 1typ huyết Khả chế gây bệnh Shigella tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn Chỉ có người khỉ mắc bệnh Trực khuẩn lỵ theo thức ăn nước uống vào đường tiêu hóa, có trường hợp tay bẩn, thường gặp trẻ em Chỉ cần số lượng từ 10 đến 100 tế bào vi khuẩn gây bệnh Tại đường tiêu hóa, Shigella gây tổn thương đại tràng Trực khuẩn lỵ gây bệnh nhờ khả xâm nhập nội độc tố, S shiga S smitzii có thêm ngoại độc tố Vi khuẩn bám xâm nhập vào niêm mạc đại tràng Chúng nhân lên nhanh chóng lớp niêm mạc Vi khuẩn PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ chết giải phóng nội độc tố gây xung huyết, xuất tiết, tạo ổ loét mảng hoại tử Nội độc tố tác động lên thần kinh giao cảm gây co thắt tăng nhu động ruột Những tác động làm bệnh nhân đau bụng quặn, buồn ngồi ngồi nhiều lần, phân có nhầy lẫn máu Ngoại độc tố S.shiga S.smitzii có độc tính với thần kinh trung ương, gây viêm màng não hôn mê Tuy nhiên, vi khuẩn sinh ngoại độc tố sau xâm nhập vào niêm mạc đại tràng Bệnh lỵ trực khuẩn thường thể cấp tính Một tỷ lệ nhỏ trở thành mãn tính, bệnh nhân lại bị ỉa chảy thường xuyên thải vi khuẩn theo phân Ở nước ta, đa số trường hợp bị lỵ trực khuẩn S dysenteriae S flexneri, có tỷ lệ nhỏ S boydii S sonnei Miễn dịch Sau có q trình nhiễm khuẩn Shigella (mắc bệnh lỵ trực khuẩn nhiễm trùng thể ẩn) máu xuất kháng thể đặc hiệu Tuy nhiên hiệu lực bảo vệ kháng thể Vai trò bảo vệ chủ yếu nhờ IgA tiết ruột Nghiên cứu miễn dịch tiết bệnh lỵ trực khuẩn tiến hành sớm, thuộc vào nghiên cứu lịch sử nghiên cứu miễn dịch nói chung PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH SHIGELLA 1.Dụng cụ thiết bị: Dụng cụ: Ống nghiệm Đĩa petri ( 100mm) Cốc thủy tinh (100ml, 250ml) Đầu tip Pipetman (1000, 5000l) Que trang, que cấy vòng Kẹp inox Đèn cồn Pipette 1ml, 10ml Thiết bị: Tủ cấy vô trùng Nồi hấp Tủ ấm Pipetman(1000, 5000l) Máy dập mẫu (Stomacher) Máy trộn mẫu (Vortex mixer) Cân phân tích Lò viba PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 2.Mơi trường hóa chất : Mơi trường Dung dịch Trypton Soya (TSB) Canh Gram Negative (GN) Tergitol-7 Agar (T7A) Thạch XyloseLysine Desoxycholate (XLD) Môi trường Heltoen Entric Agar (HE) Deoxycholate Citrat Agar (DCA) Thạch Mac Conkey (MAC) Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) Môi trường Lysine Decacboxylase Broth (LDC) Mơi trường KIA TSI RSU Hóa chất Cồn 900 700 Dung dịch creatine 0.5% Dung dịch –naphtol 5% KOH 40% HCl 10% NaOH 10% Thuốc thử catalase Que thử oxydase Các bước tiến hành phân tích: Tăng sinh: Đồng 25g mẫu 225ml TSB, ủ 370C, 16-24 Tăng sinh chọn lọc: Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang 10ml môi trường chọn lọc GN, ủ 370C, 1624 Phân lập nhận diện: Phân lập khuẩn lạc đơn mơi trường chọn lọc phân biệt (T7A, MAC, XLD, HE, DC, ), ủ 370C, 24-48 Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy lên môi trường TSA, ủ 370C, 2024 Thử phản ứng sinh hóa: Thử nghiệm sàng lọc TSI/KIA Thử nghiệm sinh hóa khẳng định: Thử nghiệm LCD Thử nghiệm urea PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Thử nghiệm VP Kết luận: Với quy trình kiểm nghiệm cho phép kết luận có hay khơng có Shigella 25 g mẫu 4.Thuyết minh quy trình phân tích: 4.1.Tăng sinh: Chuẩn bị mẫu đồng mẫu Nuôi cấy môi trường không chọn lọc Trypton Soya (TSB), môi trường cung cấp chất dinh dưỡng giúp vi sinh vật phát triển Chuẩn bị cho bước tăng sinh chọn lọc 4.2.Tăng sinh chọn lọc: Lấy 0,1ml dịch tăng sinh chuyển sang canh tăng sinh Gram Negative (GN), ủ 370C, 16-24 Mục đích vừa xác định vi khuẩn gram âm môi trường GN bị nhuộm thành màu đỏ, vừa tiếp tục nuôi cấy vi sinh vật 4.3.Phân lập: • Dùng que cấy vòng cấy ria canh trường từ môi trường tăng sinh chọn lọc lên • đĩa petri chứa mơi trường phân lập Cần cấy thưa để tạo khuẩn lạc riêng biệt Ủ 370C, 24-48 Nên sử dụng mơi trường phân lập khác nhau, để định tính xác q trình phân tích + Trên mơi trường XLD, Shigella tạo khuẩn lạc đỏ, suốt PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ + Trên mơi trường HE, Shigella tạo khuẩn lạc có màu xanh nhạt, suốt: + Trên môi trường MAC, Shigella tạo khuẩn lạc điển hình có màu đỏ nhạt, mơi trường có màu đỏ cam, đục: + Trên mơi trường T7A, Shigella tạo khuẩn lạc điển hình có màu xanh nhạt, mơi trường đục sữa, có màu vàng nhạt PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM • GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy lên TSA Ủ 37 0C, 20-24 Mục đích: mơi trường TSA cung cấp chất dinh dưỡng giúp khuẩn lạc nghi ngờ phát triển, để cấy sang môi trường test sinh hóa 4.4.Thử phản ứng sinh hóa:  Thử nghiệm sàng lọc TSI/KIA Mục đích: Phát khả sử dụng nguồn cacbonhydrate, sinh H2S, tạo (gas) Cơ sở sinh hóa cho thử nghiệm TSI/KIA: - Sử dụng lactose: Lactose + -Galactosidase Glucose + Glactose - Sử dụng glucose điều kiện hiếu khí (mặt nghiêng): Glucose hay Glactose theo chu trình Krebs (hiếu khí) sinh CO + H2O + - lượng Sử dụng glucose điều kiện kỵ khí (phần đáy): Glucose hay Galactose theo đường Embden-Meyerhof (kỵ khí), sinh axit hữu + aldehyde + loại rượu + CO + H2 + - - lượng Không lên men lactose glucose: Vi sinh vật sử dụng peptone mơi trường hiếu khí kỵ khí sinh NH3 tạo mơi trường kiềm Sinh hydrogen sulfide (H2S): Vi khuẩn + Sodium thiosulfate H2S H2S + ion sắt sắt sunfide (không tan tạo tủa màu đen) 4.4.1.Thử nghiệm KIA 10 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Thử nghiệm KIA  Nguyên tắc: - Môi trường thạch Kligler Iron Agar sử dụng để nuôi cấy trực tiếp cho trực khuẩn gram âm lên men đường glucose, đặc điểm phân loại bước đầu trực khuẩn gram âm Mơi trường đồng thời thử tính lên men đường lactose, sinh trình lên men carbohydrat sinh H2S Tất đặc điểm sử dụng cho trực khuẩn gram âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột - Môi trường KIA gồm glucose lactose (có thể lên men carbohydrat), phenol red (chỉ thị pH), pepton (nguồn carbon/nitrogen), muối sắt thiosulfate natri Có hình thái lên men carbohydrat xảy là: • Acid (màu vàng) phần gốc kiềm (màu đỏ) phần nghiêng môi trường, cho thấy vi sinh vật lên men đường glucose khơng lên men • đường lactose Acid (màu vàng) phần gốc acid (màu vàng) phần nghiêng mơi trường, cho thấy vi sinh vật lên men đường glucose đường • lactose Kiềm (màu đỏ) phần gốc kiềm (màu đỏ) phần nghiêng môi trường, cho thấy vi sinh vật khơng thể lên men đường glucose đường lactose Các sản phẩm sinh sản phẩm acid 11 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Nếu sinh hơi, có phần gốc ống môi trường, môi trường bị chia cắt đẩy môi trường lên khỏi đáy ống Nếu thấy màu đen phần gốc ống, vi sinh vật sinh H2S từ thiosulfid Chú ý: Phản ứng đọc sau nuôi cấy từ 18 – 24 giờ, môi trường đọc sớm, vi sinh vật lên men đường glucose Nếu đọc muộn, chất gây men lactose dùng hết lactose bắt đầu dị hố pepton, phần nghiêng mơi trường trở lại màu đỏ  Cách tiến hành: - Cấy đâm sâu phần cột thạch cấy ria lên phần thạch nghiêng vi khuẩn từ khuẩn lạc điển hình (nghi ngờ) lên ống thạch nghiêng chứa môi  trường KIA - Ủ 370C, 24 Giải thích biến đổi môi trường: - Mẫu 1: mẫu đối chứng, khơng có vi sinh vật - Mẫu 2: lên men glucose lactose tốt, tạo môi trường axit, làm chất chị - thị phenol red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng Mẫu 3: lên men glucose lactose có sinh khí nên mơi trường bị đẩy lên - chất thị chuyển từ màu đỏ sang vàng Mẫu 4: lên men glucose, tạo môi trường axit cột thạch nên chất thị chuyển sang màu vàng, không lên men lactose nên bề mặt thạch khơng - đổi màu, có màu đỏ Mẫu 5: tạo H2S, kết tủa màu đen đáy 4.4.2.Thử nghiệm TSI: 12 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Thử nghiệm TSI Nguyên tắc, cách tiến hành giống thử nghiệm KIA, khác mơi trường TSI có chứa thêm đường Sucrose Giải thích biến đổi môi trường: - Mẫu A: mẫu đối chứng, khơng có vi sinh vật Mẫu B: sinh khí H2S, tạo kết tủa màu đen Mẫu C: lên men glucose, khơng lên men sucrose lactose, có sinh Nên mơi trường đáy có màu vàng, thạch nghiêng có màu - đỏ phenol red, cột thạch bị đẩy lên Mẫu D: không lên men loại đường glucose, sucrose lactose Mẫu E: lên men tốt loại đường glucose, sucrose lactose, đồng thời có sinh khí 4.5.Thử nghiệm sinh hóa khẳng định: 4.5.1 Thử nghiệm LDC (Lysine Decacboxylase): 13 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Phản ứng âm tính GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Phản ứng dương tính  - Mục đích: Xác định khả tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm  - carboxyl số acid amin Cơ sở sinh hóa: Các vi khuẩn sinh ezyme decarboxylase, enzyme tương tác với amino acid có gốc carboxyl (-COOH) cuối, tạo thành amine hay diamine carbon dioxide (CO2) R-CH-CH2-COOH R-CH2-NH2 (amin) H2N-R-NH2 (diamin) + CO2 - Các sản phẩm tạo thành làm tăng pH môi trường làm đổi màu chất  - thị Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường : Decarboxylase Basal medium + chất thị pH - Bromocresol purple, điều chỉnh pH=6.0 Lấy que cấy đầy khuẩn lạc môi trường TSA cấy bề mặt - môi trường lỏng LCD Ủ 370 C, 24  - Kết quả: Kiểm tra dương tính: màu tím đục tới màu tím nhạt (sinh cadaverine - diamin) 14 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM - GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Kiểm tra âm tính: màu vàng (chỉ glucose lên men) Sau thời gian nuôi cấy, môi trường LCD, Shigella phát triển làm đục môi trường chuyển màu môi trường sang màu vàng, phản ứng LCD âm tính 4.5.2 Thử nghiệm Urea: Christensen Urea (MT thạch nghiêng)  Urea Broth (Rustigian – Stuart) Mục đích: Phát vi sinh vật có mang enzym urease hay khơng  Cơ sở sinh hóa: Khả phân cắt urea thành ammonia hoạt tính urease từ vi sinh vật làm mơi trường bị kiềm hóa NH3 tạo (NH2)2CO + H2O 2NH3 + CO2  Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường RSU + thị phenol red Lấy đầy que cấy vòng từ khuẩn lạc mơi trường TSA vào ống chứa 3-5ml môi trường RSU vô trùng Lắc nhẹ ống để trộn vi khuẩn Ủ 370C 48  Kết quả: Dương tính: mơi trường có màu hồng Âm tính: mơi trường khơng đổi màu (vàng cam) 15 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Shigella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường, phản ứng âm tính, khơng đổi màu mơi trường 4.5.3 Thử nghiệm MR (Methyl Red):  Mục đích: Xác định vi sinh vật sản xuất trì acid bền trình lên men glucose  Cơ sở sinh hóa: Glucose + H2O Lactic acid + acetic acid + ethanol + CO2 + 2H2 Acid + methyl red mơi trường có màu đỏ  Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth) Chất thị pH: methyl red Lấy đầy que cấy vòng từ khuẩn lạc mơi trường TSA vào ống chứa 3-5ml môi trường Glucose Phosphate vô trùng Lắc nhẹ ống để trộn vi khuẩn Thời gian ủ – ngày 37oC  Kết quả: –Dương tính: môi trường chuyển màu đỏ (pH=4.4), kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường acid 16 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ – Âm tính: mơi trường khơng đổi màu (pH=6.0), kéo dài thời gian ni cấy, chất có tính acid bị chuyển hóa – mơi trường dần trung tính , môi trường chuyển sang màu vàng 4.5.4 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer):  Mục đích: Phát vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trình lên men glucose  Cở sở sinh hóa: Acetoin tạo điều kiện yếm khí hồn tồn pyruvate acetoin + CO2 17 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Phức màu hồng  - Cách tiến hành: Chuần bị môi trường MR-VP Broth Naphtol (chất tăng cường màu) KOH 40% (chất oxi hóa) Hòa vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc môi trường TSA vào ống - môi trường MR-VP ủ 370C 24 Sau thời gian ủ, lấy 0.2ml dịch cấy vào ống nghiệm, thêm giọt creatin + giọt dung dịch 1-naphtol cồn, sau thêm giọt KOH 40%, xuất màu hồng đến màu đỏ tươi 15 phút phản ứng dương tính  Kết quả: 18 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Shigella cho phản ứng âm tính với thí nghiệm VP, không đổi màu bề mặt môi trường 4.6.Kết luận: Các đặc trưng sinh hóa Shigella tóm tắt theo bảng: Thử nghiệm sinh hóa Simmon citrate Aarginine decarboxylase Lysine decarboxylase Urea Maloonate MR VP Kết - Thử nghiệm sinh hóa saciline Xylose Kết - + - Cellobiose adonitol Dulcitol Inositol - Với quy trình kiểm nghiệm cho phép kết luận có hay khơng có Shigella phát 25g mẫu CHƯƠNG 3: ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CỤ THỂ XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG CEFTRIAXONE Ở VI KHUẨN SHIGELLA SONNEI PHÂN LẬP TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TÁC GIẢ: NGUYỄN THỊ KHÁNH NHƯ Sơ đồ định danh Shigella sonnei Mẫu bệnh phẩm (mẫu phân) 19 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Cấy tăng sinh môi trường SB Cấy môi trường chọn lọc MC XLD Chọn khuẩn lạc trong, không màu (không lên men lactose) Thử nghiệm phản ứng sinh hóa Shigelle spp Định danh kit API20E shigella sonnei shigella spp Phân lập định danh S sonnei : Ngày 1: mẫu phân lập lấy trực tiếp từ bệnh nhân, giữ lọ vô trùng Dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm lên môi trường chọn lọc MC, XLD, cho khoảng 2g phân tươi vào môi trường tăng sinh SB Ủ vi khuẩn 37 0C 18 đến 24 Ngày 2: chọn khuẩn lạc trong, không màu (do không lên men laclose) môi trường MC, XLD để tiến hành phản ứng sinh hóa định danh Shigella Song song đó, khuẩn lạc cấy lên mơi trường 20 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NA để kiểm tra độ Trong đó, bệnh phẩm sau tăng sinh môi trường SB dược cấy mơi trường MC, XLD để tìm Shigella spp - Thử nghiệm KIA (Kliger’s iron agar): môi trường thạch nghiêng có chứa dextrose lactose, chất thị dùng phenol đỏ Vi khuẩn cấy thẳng xuống gần đáy ống thạch, cấy ria bề mặt thạch nghiêng, ủ 37 0C 18 đến 24 Kết thể sau: • Vi khuẩn không lên men: vi khuẩn mọc bề mặt thạch nghiêng nhờ phân hủy thành phần protein mơi trường thành sản phẩm • kiềm Bề mặt phần đáy thạch nghiêng có màu đỏ Vi khuẩn lên men dextrose không lên len lactose: vòng 12 sau ủ, vi khuẩn lên men dextrose tạo sản phẩm có tính acid, làm mơi trường mặt thạch có màu vàng Tuy nhiên, sau 12 giờ, dextrose sử dụng hết, vi khuẩn bề mặt thạch tiếp tục tăng trưởng phân hủy thành phần protein môi trường Khoảng từ 18 đến 24 sau, • sản phẩm kiềm tạo làm môi trường bề mặt thạch lại trở nên đỏ Vi khuẩn lên men dextrose lactose: bề mặt thạch nghiêng phần • đáy mơi trường có màu vàng Mơi trường KIA chứa Natri thiosulfate (Na 2S2O3) sắt sulfate (FeSO4) làm chất thị cho việc tạo H2S Kết dương tính xung quanh môi trường xuất tủa màu đen - Thử nghiệm Urease: xác định khả phân giải Urea vi sinh vật tác dụng enzyme urease: (NH2)2CO+ H2O urease CO2+ H2O + NH3 (NH4)2CO3 - Thử nghiệm citrate: nhằm xác định khả sử dụng citrate muối ammonium nguồn carbon Nito vi khuẩn Vi khuẩn biến dưỡng citrate dùng muối ammonium tạo ammonia làm kiềm hóa mơi trường Chất thị sử dụng thử nghiệm bromthymol blue (trung tính: màu xanh cây, pH > 7,6: màu xanh thẫm) 21 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ - Thử nghiệm indole: nhằm xác định khả thủy giải tryptophan nhờ emzyme tryptophanase thành indole vi sinh vật Indole tạo thành phát phản ứng với dung dịch Kovac (para-dimethylaminobenzaldehyde cồn) tạo thành phức chất dạng quinine màu đỏ tía -Thử nghiệm đỏ methyl: thử nghiệm định tính khả vi khuẩn lên men glucose thành sản phẩm có tính acid cao hay thành sản phẩm tính acid ethanol hay butanediol Thử nghiệm dùng đỏ methyl làm chất thị pH (có màu đỏ độ pH mơi trường thấp 4,4) Ngày 3: đọc kết phản ứng sinh hóa Vi khuẩn xác định Shigella spp có kết sinh hóa sau: phân giải glucose khơng phân giải lactose, không sinh hơi, không sinh H 2S, không di động, không sinh indole, không phân giải urea, không phân gải nitrate, có phản ứng đỏ methyl dương tính Thực phản ứng ngưng kết kháng nguyên để xác định typ thuyết cho loại vi khuẩn Trong trường hợp kết thử nghiệm số phản ứng sinh hóa kết phản ứng huyết không rõ ràng, vi khuẩn định danh Kít API20E Bộ kít hệ thống định danh chuẩn hóa nhóm Enterobacteriaceae sử dụng 21phản ứng sinh hóa phân tích kết dựa phần mềm vi tính Các bước tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất kết thu nhận tra với sở liệu để định danh vi khuẩn Tuy nhiên kít định danh xác Shigella sonnei, Shigella khác ghi nhận với kết Shigella spp Vì có kết API20E Shigella spp.,thử nghiệm lại phản ứng huyết để định danh loài khác thuộc họ Shigella 22 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Qua báo cáo trên, chúng em mong giới thiệu rõ đặc tính vi khuẩn Shigella nhằm xác định xác loại vi khuẩn Qua đó, thơng qua việc nghiên cứu đặc tính vi sinh vật góp phần đáng kể thực tiễn, góp phần đẩy mạnh việc sản xuất nhiều sản phẩm sinh học có giá trị như: chất kháng sinh, vitamin, enzyme, acid amin Bài báo cáo khơng tránh khỏi thiếu sót, mong cô hướng dẫn thêm Chúng em chân thành cảm ơn 23 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ TÀI LIỆU THAM KHẢO http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp? area=58&cat=1101&ID=2761 http://www.nihe.org.vn/new-vn/dao-tao-ngan-han tap-huan412312272/511/Dac-tinh-mot-so-moi-truong-phan-lap-va-chan-doan-vi- khuan-gay-benh.vhtm http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/cac-phan-ung-sinh-hoa-1-kiem-tra-kha-nang- len-men-carbohydrate-1-1-nguyen-tac-xac-dinh-kha-nang-l.1400665.html Bài giảng “Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm”- Nguyễn Thúy Hương 24 ... Tuy nhiên kít định danh xác Shigella sonnei, Shigella khác ghi nhận với kết Shigella spp Vì có kết API20E Shigella spp.,thử nghiệm lại phản ứng huyết để định danh loài khác thuộc họ Shigella 22... sinh hóa khẳng định: 4.5.1 Thử nghiệm LDC (Lysine Decacboxylase): 13 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Phản ứng âm tính GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Phản ứng dương tính  - Mục đích: Xác định khả tạo enzyme... dương tính  Kết quả: 18 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ Shigella cho phản ứng âm tính với thí nghiệm VP, khơng đổi màu bề mặt môi trường 4.6.Kết luận: Các đặc trưng sinh hóa Shigella