Bộ Công Thương Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SHIGELLA GVHD: NHÓM: LỚP: DANH SÁCH NHÓM HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN MÃ SỐ SINH VIÊN NHIỆM VỤ MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU Tình hình nhiễm Shigella giới Việt Nam I a) Tình hình nhiễm Shigella giới b) Tình hình nhiễm Shigella Việt Nam II Tổng quan Shigella spp III Phương pháp phân tích a) Truyến thống: b) Hiện đại TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 LỜI NÓI ĐẦU Shigella trực khuẩn, hiếu khí kị khí tùy ý Cho thử nghiệm catalase (+) (trừ S dysentrirae), oxidase (+), lên men glucose không sinh hơi, hầu hết loài không lên men tạo acid từ lactose, dolcitol, không sinh H2S, enzyme lysine decarboxydase Shigella tác nhân gây nên bệnh shigellosis, bệnh nguy hiểm lây lan nhanh cộng đồng từ người sang người, qua đường thực phẩm nước uống Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm chủ yếu từ nguyên liệu, từ nước hay từ công nhân chế biến Các loại thực phẩm thường xuyên phân lập Shigella xà lách, thịt băm, thủy sản Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm Shigella thấp, mức 10 tế bào/g sản phẩm Do Shigella kiểm soát nghiêm ngặt thực phẩm, đòi hỏi phương pháp kiểm nghiệm phải nhạy, quy trình kiểm soát phải chặt chẽ Shigella phát cách nuôi cấy lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng không chọn lọc, sau chuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc Dịch khuẩn sau tăng sinh chọn cấy phân lập loại môi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác Khuẩn lạc nghi ngờ kiểm tra thử nghiệm sinh hóa kháng huyết I Tình hình nhiễm Shigella giới Việt Nam a) Tình hình nhiễm Shigella giới Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm giới có khoảng 165 triệu ca nhiễm Shigella Trong đó, nước phát triển, tỷ lệ nhiễm chiếm đến 99% (69% trẻ em tuổi) có 1,1 triệu ca tử vong nhiễm Shigella năm (60% số trẻ em tuổi) Người ta nhận thấy có thay đổi tuýphuyết loài thay đổi loài gây bệnh phổ biến giai đoạn Đầu tiên, S dysenteriae tuýp loài gây bệnh phổ biến, sau dần thay S flexneri, cuối chuyển dần sang S sonnei Có khác biệt loài Shigella thường gặp nước phát triển nước phát triển.Ở nước phát triển, loài Shigella gây bệnh thường gặp S sonnei (chiếm 77%) S flexneri (chiếm 16%).Trong đó, nước phát triển S flexneri thường gặp (chiếm 60% tổng số ca nhiễm), tiếp sau S sonnei (chiếm 15%) Ở loài S flexneri, tuýp 2a chiếm từ 32% - 58%, tuýp 1b gây 12% - 13%, tuýp 3a gây – 11% tổng số ca nhiễm nước phát triển S dysenteria thường tìm thấy vùng Nam Á châu Phi, tuýp phổ biến Ấn Độ, Nigeria Singapore, tuýp phổ biến Guatamala, Hungary Yemen S boydii Shigella phát Ấn Độ, không phổ biến lắm, chủ yếu gây bệnh vùng tiểu lục địa Ấn, S boydii tuýp S boydii gây bệnh phổ biến nước phát triển b) Tình hình nhiễm Shigella Việt Nam Ở Việt Nam, số ca nhiễm Shigella cao, hẳn bệnh gây Salmonella typhi Vibrio choleraeri.Việt Nam có khoảng 435.000 ca nhiễm Shigella (khoảng 39.500 ca nhiễm năm) Số ca nhiễm năm 100.000 dân cao vùng cao nguyên Trung Bộ (241,7 ca), vùng bờ biển Nam Trung Bộ (100,2 ca) thấp vùng đồng sông Hồng (hình 1.2) Nghiên cứu cho thấy lượng mưa nhiều tình trạng nghèo đói nguy quan trọng nhiễm Shigella Tỷ lệ nhiễm Shigella trung bình năm 100.000 dân Nhìn chung Việt Nam, loài Shigella gây bệnh phổ biến S flexneri S sonnei Vào đầu năm 90, thành phố Hồ Chí Minh, nhóm Shigella gây bệnh, S flexneri loài có tỷ lệ gây bệnh cao (72,58%), S sonnei (23,87%), tình hình nhiễm Shigella tương tự, với S flexneri loài gây bệnh phổ biến (69,59%), S sonnei (13,40%) Tuy nhiên, tình hình gây bệnh nhóm Shigella có thay đổi Từ năm 2000 đến năm 2002 Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, tỷ lệ mẫu phân lập cho kết S flexneri S sonnei tương đương (45,6%) Từ năm 2006 đến năm 2008, 113 mẫu Shigella phân lập từ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, S.sonnei chiếm đến 70,8%, S flexneri chiếm 27,4% (Hà Vinh cộng sự, số liệu chưa công bố) Số lượng S boydii (17%) phân lập từ năm 1991 đến năm 2001 dọc theo vùng sông Hồng cao nhiều so với thập kỷ trước (3%) Bên cạnh đó, tuýp huyết S flexneri gây bệnh phổ biến có thay đổi Những năm 1960, tuýp huyết phân lập gồm tuýp (66%), tuýp (16%), tuýp (10%) tuýp (5%), nay, tuýp phân lập gồm tuýp (17%), tuýp (13), tuýp (10), biến thể Y (9%), 40% mẫu S flexneri phân lập định tuýp huyết dựa vào kít thương mại Điều cho thấy Shigella dần xuất biến thể khác, chúng phát triển mạnh nhiều điều kiện môi trường tập quán ăn uống khác thời điểm khác Điều này, với ngày nhiều Shigella kháng kháng sinh, làm cho việc điều trị Shigella trở nên khó khăn hơn, khó sử dụng loại vắc-xin đặc hiệu cho tuýp huyết Shigella II Tổng quan Shigella spp Shigella spp trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, Shigella spp không sinh bào tử thường hay bị nhầm lẫn với Salmonella trình kiểm tra vi sinh Shigella spp không di động không sinh bào tử, có phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, lactose âm tính, H2S âm tính, vài chủng không sinh lên men đường glucose Giống Shigella gồm loài: Shigella dysenteriae (kháng huyết nhóm A), Shigella flexneri (kháng huyết nhóm B), Shigella boydii (kháng huyết nhóm C), Shigella sonei (kháng huyết nhóm D) III Phương pháp phân tích a) Truyến thống: Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo ISO 21567:2004 áp dụng phát Shigella tất loại thực phẩm Nguyên tắc Cấy lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng chọn lọc.Từ môi trường nuôi cấy phân lập lên môi trường rắn chọn lọc, sau thời gian ủ, khuẩn lạc nghỉ ngơi kiểm tra khẳng định thử nghiện sịnh hóa kháng huyết Môi trường hóa chất Môi trường hóa chất Shigella Borth Mục đích Tăng sinh chọn lọc MacConkey XLD Phân lập Hektoen Enteric Agar Nutrient Agar (NA) Phục hồi TSI Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Shigella Urea LDC HCl NAOH 10% Chỉnh pH Quy trình phân tích X g X ml mẫu thử + 9Xml canh thang Shigella chứa novobioxin 0.5µg/ml Đồng hóa chỉnh pH đến 7.0 cần ủ kỵ khí 41.5o C/16-20h MacConkey agar XLD agar Hektoen enteric agar ủ 37oC, 20-24h Chọn khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch dinh dưỡng / ủ 37oC, 20-24h Khẳng định sinh hóa Các bước tiến hành Bước Tăng sinh chọn lọc Cân lượng 25g mẫu rắn đong thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số cho phép ±5% phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng ( bình tam giác), bổ sung 225ml môi trường tăng sinh chọn lọc Shigella đồng mẫu máy dập mẫu (stomacher) 60 giây, ủ 37oC 18 ± 3h Bước Phân lập Dùng que quấy vòng phân lập từ thang tăng sinh chọn lọc Shigella lên đỉa thạch chứa môi trường chọn lọc MacConkey, XLD HE Sau cấy, lật ngược đĩa cho đáy hướng lên vào ủ 37oC ± 1oC 24 ± 3h Sau ủ 24 ± 3h, kiểm tra đĩa có mặt khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc không điển hình mà nghi ngờ Shigella Trên môi trường XLD khuẩn lạc Shigella điển hình có màu hồng suốt, có tâm màu đen Trên môi trường HE khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh lam, có tâm đen Trên môi trường MacConkey khuẩn lạc Shigella diển hình có màu đỏ nhạt (môi trường có màu đỏ cam, đục) Đánh giấu khuẩn lạc đáy đĩa Bước Phục hồi môi trường dinh dưỡng NA/TSA Đánh dấu khuẩn lạc điển hình nghi ngờ điển hình từ đĩa môi trường phân lập MacConkey, XLD HE Nếu đĩa có năm khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc nghi ngờ, lấy tất khuẩn lạc điển hình nghi ngờ cấy ria lên NA/TSA Ủ 37oC ± 1oC 24 ± 3h Trường hợp 1:từ đĩa thử khuẩn lạc đặc trưng, Nếu cho kết thử nghiện sinh hóa phù hợp kết luận phát Shigella mẫu Trường hợp 2: Nếu khuẩn lạc cho kết thử nghiệm sinh hóa không phù hợp tiến hành thử bốn khuẩn lạc lại đánh dấu, bốn khuẩn lạc có kết thử nghiệm sinh hóa phù hợp kết luận Shigella có mẫu ngược lại kết luận không phát Shigella mẫu Bước Khẳng định sinh hóa Từ khuẩn lạc cấy rỉa lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào môi trường sau: Thạch TSI, ủ 37oC 24h Shigella cho phản úng kiềm mặt nghiêng acid phần sâu, không sinh không sinh H2S môi trường Môi trường LDC, ủ 37oC 24h.Shigella cho phản ứng LDC âm tính Môi trường urea agar (urea lỏng), ủ 37oC 24h Shigella cho phản ứng urea âm tính Kết Phát (hay không phát hiện) Shigella 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng b) Hiện đại Phương pháp PCR Kary Mullis phát minh kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) vào năm 1985, tạo nên cách mạng lớn đời sống khoa học Chỉ sau năm (1993), K Mullis trao giải Nobel hoá học nhờ phát minh Bộ công cụ dùng xét nghiệm “bộ Kít PCR” với độ nhạy cao với vi khuẩn, 25g mẫu thực phẩm có vi khuẩn cần tìm PCR phát chúng Điều đặc biệt kít không gọi tên loại vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm mà chúng phát 12 loại vi khuẩn khác như: e.coli, e coli 0157:h7, salmonella spp, Shigella spp, nấm mốc Tùy thuộc vào loại thực phẩm số loại tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểm soát loại thực phẩm, quy trình Kit PCR cho phép xét nghiệm gọi tên tất vi khuẩn nêu vòng 24 (trừ Clostridium botulinum, cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài) Chúng thiết kế cho 50 phản ứng PCR với 50 ống phản ứng, chứa đầy đủ thành phần dung dịch đệm PCR, mồi, nước để giúp kiểm tra xác mức độ nhiễm vi sinh vật trầm trọng hay không Kỹ thuật PCR dùng phát Shigella tiến hành cặp mồi SHIG khuếch đại cho trình tự 320bp plasmid xâm nhiễm đặc hiệu cho Shigella cặp mồi 16S khuếch đại cho trình tự có kích thước 1007bp nằm vùng bảo tồn cùa 16S rRNA diện loài vi khuẩn So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp cho hiệu xác hay chỗ, phát nhiều vi khuẩn gây bệnh tốn thời gian.Riêng Shigella cho phép phát Shigella mức 10CFU/25g mẫu sau 12→14h tăng sinh,cho kết sau 24h Kỹ thuật LA (latex agglutination) Ngoài dựa kỹ thuật phân tích kháng thể dùng phát Shigella có Kit Wellcolex ,bộ kít Bactigen dựa kiểu phân tích LA Được sử dụng từ năm 1956, xét nghiệm LA phổ biến phòng thí nghiệm lâm sàng, áp dụng để phát 100 bệnh truyền nhiễm Thử nghiệm dựa ngưng kết hạt cao su với kháng thể huyết thanh.Chẩn đoán xác định Shigella từ mẫu lâm sàng 24h với độ đặc hiệu (>98%) độ nhạy (100%),hơn thao tác đơn giản dễ sử dụng Ví dụ: chế thử nghiệm LA: Các mẫu thực phẩm cần kiểm tra sau xử lý pha trộn với hạt cao su phủ kháng thể kháng nguyên cụ thể Nếu mẫu bị nghi ngờ có diện Shigella, hạt cao su cụm lại với (tựu lại) Sau thử nghiệm Nếu thử nghiệm âm tính, cao su mịn giữ lại màu sắc ban đầu Nếu thử nghiệm dương tính ,hạt cao su thay đổi màu sắc khác biệt so với hạt cao su xung quanh TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm, 2014 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2006 http://khotailieu.vn/tong-quan-ve-Shigella/ 10