Quy trình định lượng clostridium perfringens

C.perfringenes được tìm thấy trong đất, trong phân người.Chúng thường hiện diện trong các thực phẩm nguội lạnh của cửa hàng ăn uống.Triệu chứng: đau thắt vùng bụng, tiêu chảy.Thời gian ủ bệnh: 12 – 24 giờ.Nguồn thực phẩm dễ lây nhiễm: Thịt gia cầm, nhất là gia cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM Quy trình định lượng Clostridium perfringenes GVHD: Phan Thị Kim Liên Nhóm • • • • • Các thành viên nhóm Đinh Hồng Ngọc Phạm Thị Tú Oanh Vy Thị Minh Đào Thị Thảo Uyên Nguyễn Định lượng C.perfringens bằng phương pháp đếm khuẩn lạc I Tổng quan về C perfringenes II Nguyên tắc III Thiết bị, dụng cụ và môi trường IV Các bước tiến hành V Kết qua • Trực khuẩn kỵ khí gram (+), sinh bào tử, nhiệt độ tối ưu từ 37 – 450C • • Gặp phổ biến đường tiêu hóa người nên thường dùng làm vi sinh vật thị khả nhiễm phân Bào tử có khả cạnh tranh cao, nên tế bào sinh dưỡng bị chết đi, bào tử sống sót sinh trưởng NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO C PERFRINGENS  C.perfringenes tìm thấy đất, phân người Chúng thường diện các thực phẩm nguội lạnh cửa hàng ăn uống  Triệu chứng: đau thắt vùng bụng, tiêu chảy  Thời gian ủ bệnh: 12 – 24  Nguồn thực phẩm dễ lây nhiễm: Thịt gia cầm, nhất gia cầm đông lạnh sâu, thịt các hầm chứa các loại thực phẩm khác  Biện pháp: đun sôi nấu kĩ NGUYÊN TẮC Định Nghĩa:  Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình (kết tủa đen, khử sunfit thành sunfua, làm cho màu khuẩn lạc bị đen) môi trường chọn lọc cho các phản ứng khẳng định dương tính thử hai kỹ thuật qui định tiêu chuẩn Nguyên tắc: - Phương pháp hộp đổ o Ủ điều kiện kỵ khí 37 C 24 Định lượng các khuẩn lạc điển hình Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình tính số lượng C.perfringens có gam mililit mẫu Thiết bị, dụng cụ và môi trường 1.Thiết bị và dụng cụ - Cân Bể điều nhiệt Nồi tiệt trùng Tủ ấm Thiết bị ni cấy kỵ khí Tủ cấy - Dao lấy mẫu, pH kế, Erlen - Que cấy thẳng que cấy vòng - Phiến kính lam kính - Ống nghiệm - Pipet - Hộp Petri  Kỹ thuật 2: - Vi khuẩn sinh khuẩn lạc màu đen mt TSC không di động, trực khuẩn ngắn, gram (+), sinh bào tử, khử nitrat thành nitrit, sinh acid khí từ lactose, hóa lỏng gelatin coi C Perfringenes  Thử nghiệm tính di động Tiến hành: Làm môi trường thạch đứng Manitol Mobility Nitrate Cấy sâu khuẩn lạc đã phân lập vào môi trường Ni dưỡng điều kiện ́m khí 370C 10C, 18-24h  Xác định hình thể tính chất bắt mầu a) Chuẩn bị canh trùng thuần nhất: • Chọn khuẩn lạc điển hình với đặc điểm: tròn, lồi, bờ đều, nhẵn, đen đĩa thạch TSC cấy vào ống môi trường canh thang thioglycolat canh thang gan cục canh thang nha bào • Ủ ấm 37oC/18 - 24 Thu canh trùng thuần nhất b) Hình thể và tính chất bắt mầu - Từ canh trùng thuần nhất, nhuộm Gram để xem hình thể và tính chất bắt mầu C perfringens là trực khuẩn ngắn, bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr ( +) - Phát khả sinh nha bào: nhuộm Gram từ canh thang nha bào thấy: trực khuẩn ngắn, tròn đầu, có khoảng trắng sáng khơng bất mầu thuốc nhuộm Thử tính chất sinh vật hố học a) Thử nghiệm Iron – Milk Môi trường Iron – Milk: Sữa tươi toàn phần Sắt sunfat.7H2O Nước cất 1lit 1g 50ml - Lấy 1ml canh trùng thuần nhất cho vào ống nghiệm môi trường Iron – Milk - Đun cách thuỷ 46oC/2giờ - C.perfringen làm đông sữa nhanh ở đáy ống nghiệm và tạo lớp nhũ tương ở b) Thử tính chất lên men đường hố lỏng gelatin - Từ canh trùng cấy vào môi trường lactoza gelatin Sau 24 giờ 37oC, nhận định khả lên men đường Lactoza, khả khí chuyển màu vàng (sinh acid) Làm lạnh vào 0C/1 giờ - Đọc kết sơ khả hóa lỏng gelatin - Nếu mơi trường dạng đặc, ủ thêm 24 giờ/ 370C c) Khả chuyển hoá nitrat thành nitrit: - Từ canh trùng cấy vi khuẩn vào ống nitrat, ủ 35oC/24 giờ Nhỏ 0,2 - 0,5ml thuốc thử vào mỗi ống - Quan sát mầu môi trường chuyển sang màu đỏ (+)/10 phút - Nếu 15 phút mà màu đỏ không hình thành thì thêm lượng nhỏ bột kẽm  Phương pháp nuôi cấy ống thạch Môi trường thuốc thử: Thạch Wilson Blair (hoặc Thạch Perfringens selective) 30 ml/ống Dung dịch Natri sunfit 20% Dung dịch ferrous amon sunfat (phèn sắt) 5% b) Tiến hành: - Chuẩn bị mẫu dung dịch mẫu thử trên, pha lỗng đến đậm độ dùng ni cấy - Đun chảy thạch Wilson Blair (hoặc thạch Perfringens selective), để nguội khoảng 500C, cho vào thạch 10ml dung dịch mẫu thử Mỗi nồng độ cấy ống Mỗi ống cho thêm 2ml dung dịch Na2SO3 20% giọt phèn sắt 5% Lắc trộn - Đun cách thủy 750C/15phút Làm đông nhanh thạch - Để 370C/18-24h Tiêu chuẩn để xác định C perfringen Trực khuẩn ngắn: • Gr (+) • Có nha bào • Kh̉n lạc mầu đen TSC • Nitrit: (+) • Lactoza: (+) • Hơi: (+) • Iron-milk: (+) • Làm lỏng Gelatin: (+) C perfringenes 1g/1ml mẫu (X) tính theo cơng thức: X = x R (CFU/g hay CFU/ml) C: Tổng số khuẩn lạc C Perfringenes đếm đĩa hai độ pha lỗng liên tiếp V: Thể tích dịch cấy cấy đĩa (ml) : Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ nhất Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ hai d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất R: tỉ lệ khẳng định dương tính  Ví dụ: •  Độ pha lỗng 10-2 : - Đĩa thạch ống nghiệm có: 10 khuẩn lạc - Đĩa thạch ống nghiệm có: 14 khuẩn lạc - Số khuẩn lạc có 1g thực phẩm tính: X = x 100 = 120 Như vậy: Trong gam thực phẩm có 1,2 x 10 vi khuẩn C.perfringens -2 Độ pha loãng Số khuẩn lạc 10 -1 120 130 10-2 70 60 X= xR Cách tính R: 10 khuẩn lạc chọn xác nhân là C Perfringens kiểm tra bằng phản ứng sinh hoá ... ứng khẳng định dương tính thử hai kỹ thuật qui định tiêu chuẩn 2 Nguyên tắc: - Phương pháp hộp đổ o Ủ điều kiện kỵ khí 37 C 24 Định lượng các khuẩn lạc điển hình Khẳng định số lượng các... Định lượng các khuẩn lạc điển hình Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình tính số lượng C .perfringens có gam mililit mẫu Thiết bị, dụng cụ và môi trường 1.Thiết bị và dụng... (LS) Pepton từ casein 15g Cao nấm men 10g Lactoza 10g Gelatin 120g Phenol đỏ 0,05g Nước lít QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Cân 10g (10ml) mẫu + 90 ml SPW Đồng mẫu Dịch mẫu [ 10-1 ] Dịch mẫu [ 10-2 ] 0,1ml