Quy trình định lượng clostridium perfringens

Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Clostridia Bộ (ordo) Clostridiales Họ (familia) Clostridiaceae Chi (genus) Clostridium Loài (species) C. perfringens Toxin α gây hoại tử sinh hơi Toxin

QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM

PERFRINGENS

II II IVI

Giới thiệu về

clostridium

perfringens

Quy trình phân tích

Kết quả

Thiết bị, Dụng cụ

và môi trường

Giới thiệu về clostridium perfringens

 Giới (regnum) Bacteria

 Ngành (phylum) Firmicutes

 Lớp (class) Clostridia

 Bộ (ordo) Clostridiales

 Họ (familia) Clostridiaceae

 Chi (genus) Clostridium

 Loài (species) C perfringens

 Phân loại khoa học

Tạo các khuẩn lạc màu đen

trong môi trường phân lập quy

Giới thiệu về clostridium perfrigens

 Hình thái vi khuẩn Clostridium perfrigens

Tác hại clostridium perfrigens

Tạo ra độc tố gây ra một số bệnh như

 Toxin α gây hoại tử sinh hơi

 Toxin gây viêm ruột hoại tử

 Độc tố ruột gây nhiễm độc thức ăn

 

Bùn đất, nước cống rãnhPhân người, phân động

vật

Trong thực phẩm nhất

là thực phẩm đồ hộp

 Nơi sống của Clostridium perfrigens

Giới thiệu về clostridium perfringens

Thiết bị và dụng cụ

Bể điều nhiệt Que cấy thẳng và que cấy vòng

Nồi tiệt trùng Phiến kính và lam kính

Thiết bị nuôi cấy kị khí Pipet

 Môi trường Iron - Milk cải tiến

Sữa tươi toàn phần

Quy trình phân tích

10g mẫu + 90ml dung dịch đệm 10-1Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10-2, 10-3,10-4…

10g mẫu + 90ml dung dịch đệm 10-1Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10-2, 10-3,10-4…

Lấy mỗi nồng độ pha loãng 1ml mẫu vào đĩa (mỗi nồng độ 2 mẫu), rót khoảng 15-20ml môi trường TSC

ở 450C, xoay đều, đợi đông

Lấy mỗi nồng độ pha loãng 1ml mẫu vào đĩa (mỗi nồng độ 2 mẫu), rót khoảng 15-20ml môi trường TSC

ở 450C, xoay đều, đợi đông

Đếm tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ là Clostridium perfringens

Đếm tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ là Clostridium perfringens

Phủ thêm lên bề mặt đĩa 10ml môi trường TSC, ủ 370C ± 20C, 20-24h trong bình kỵ khí

sáng không bắt màu thuốc nhuộm

Thử nghiệm khả năng đông tụ sữa trên môi trường Iron - Milk, thử nghiệm tính di động, thử nghiệm

khả năng khử nitrate, lên men lactose, sinh acid, khí, khả năng hóa lỏng gelatin

Thử nghiệm khả năng đông tụ sữa trên môi trường Iron - Milk, thử nghiệm tính di động, thử nghiệm

khả năng khử nitrate, lên men lactose, sinh acid, khí, khả năng hóa lỏng gelatin

Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc màu đen ở môi trường TSC, không di động, trực khuẩn ngắn, gram (+), có khả năng sinh bào tử, làm đông tụ canh trường Iron-Milk, khử nitrate thành nitrite,

sinh acid và khí từ lactose, hóa lỏng gelatin được coi là Clostridium perfringers

Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc màu đen ở môi trường TSC, không di động, trực khuẩn ngắn, gram (+), có khả năng sinh bào tử, làm đông tụ canh trường Iron-Milk, khử nitrate thành nitrite,

sinh acid và khí từ lactose, hóa lỏng gelatin được coi là Clostridium perfringers

Thử nghiệm sinh hóa các khuẩn lạc điển hình

Quy trình phân tích

 Thử sinh hóa các khuẩn lạc điển hình

Quy trình phân tích

 Thử sinh hóa các khuẩn lạc điển hình

 Thử nghiệm tính di động

Cấy đâm sâu từng khuẩn lạc chọn lọc sang môi trường nitrat để thử tính di động

Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37°C trong 24 h

Kiểm tra ống môi trường để xem dạng sinh trưởng dọc theo đường cấy sâu

Nếu nó mọc dọc theo đường cấy đâm sâu mà không phát triển lan rộng vào môi trường cách

xa đường cấy đâm sâu => không di động

Quy trình phân tích

 Thử sinh hóa các khuẩn lạc điển hình

 Thử nghiệm khả năng khử nitrate thành nitrite

Lấy từ 0,2 ml đến 0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrite

Cho vào mỗi ống môi trường nitrate di động (tiến hành trong tủ HOP)

Sự hình thành màu đỏ khẳng định sự khử nitrate thành nitrite Nếu màu đỏ không hình thành trong 15 phút, thì thêm một lượng nhỏ bụi kẽm và để yên 10 phút Nếu màu đỏ hình

thành sau khi thêm bụi kẽm thì không xảy ra sự khử nitrate thành nitrite

Quy trình phân tích

 Thử nghiệm sinh hóa các khuẩn lạc điển hình

 Xác định khả năng hóa lỏng gelatinCấy các khuẩn lạc đã phân lập vào ống nghiệm chứa môi trường gelatin – lactose

Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37°C trong 24h

Nếu có sinh khí và có xuất hiện màu vàng (do hình thành axit) cho thấy sự lên men lactoza

Làm lạnh 1h ở 5oC và kiểm tra sự hóa lỏng gelatin Nếu môi trường đã đông đặc thì ủ lại thêm 24h để

kiểm tra lại sự hóa lỏng gelatin

Kết quả

 Nếu nhiều hơn hoặc bằng 80% số khuẩn lạc điển hình đếm được xác định là clostridium perfringens thì toàn bộ số khuẩn lạc đếm được được coi là clostridium perfringens

 Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc màu đen ở môi trường TSC, không di động, trực khuẩn ngắn, gram (+) có khả năng sinh bào tử, Làm đông tụ canh trường Iron-Milk, khử nitrate thành nitrite, sinh acid và khí từ lactose, hóa lỏng gelatin được coi là Clostridium perfringers

Kết quả

Số khuẩn lạc Clostridium perfringens trên 1g mẫu:

Trong đó:

• a: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa thạch 1 ở cùng nồng độ

• b: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa thạch 2 ở cùng nồng độ

• n: số lượng đĩa đếm

• f: độ pha loãng tương ứng

• V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa

• R: tỉ lệ xác nhận = tỉ lệ gữa số khuẩn lạc nghi ngờ cho thử nghiệm dương tính so với số khuẩn lạc nghi ngờ

Kết quả

Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa thạch

- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 1 có: 32 khuẩn lạc

- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 2 có: 38 khuẩn lạc

 

=> Như vậy: Trong 1 gam thực phẩm có 31,5 10 4 vi khuẩn C.perfringens

• Tính số tế bào Clostridium perfringens trên 1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc đếm được ở 10-4 là 70 và có

9 trong 10 khuẩn lạc được chọn được xác nhận là Clostridium perfringens khi kiểm tra bằng phản ứng sinh hoá => R =

 Ví dụ

Tài liệu tham khảo

-25023

/