qui trình định lượng tổng coliform

1 Nguyên tắc.• Số lượng Coliforms được xác định bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường rắn chọn lọc thích hợp thạch Violet Red Bile có chứa lactose và chất chỉ thị pH.. Các

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TP HCM

Nội dung

Tình hình ngộ độc Tổng quan về

Coliforms

Các phương pháp định lượng

1 Tình hình ngộ độc thực phẩm:

• Theo thống kê của Bộ Y tế, chỉ trong 4 tháng đầu năm 2016, cả nước đã xảy ra gần

30 vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, làm trên 1.386 người bị ngộ độc, trong đó

có 2 trường hợp tử vong Riêng trong tháng 4.2016 đã xảy ra 9 vụ ngộ độc thực phẩm, làm 375 người bị ngộ độc.

•  Hầu hết các bệnh nhân bị ngộ độc do ăn phải thức ăn bị nhiễm vi sinh vật bởi thời tiết nóng bức gây ra, cùng với đó là một số trường hợp bị ngộ độc do hấp thụ phải hóa chất tồn dư trong thực phẩm.

2  Tổng quan về Coliforms:

• Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức độ an toàn về vi sinh trong thực phẩm

• Sự hiện diện một lượng lớn Coliforms trong thực phẩm là điều

không mong muốn, tuy nhiên rõ ràng không thể loại bỏ chúng hoàn toàn khỏi nhiều thực phẩm đông lạnh và tươi sống

•  Vấn đề ở chỗ số lượng chúng đến mức nào, có thể coi là không an toàn trong thực phẩm

• Thuộc nhóm trực khuẩn gram (-).

• Không sinh bào tử

• Hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện

• Có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong 24-48h

• to : -2o-50oC

• pH: 4,4-9,0

2  Tổng quan về Coliforms:

• Thường sống ở ruột và phân người hoặc các động vật máu nóng.

• Nguồn nhiễm: nhiễm từ nước hoặc phân chứa VSV gây bệnh

• Triệu chứng:

• Bệnh phát đột ngột, gây đau bụng dữ dội, ít nôn mửa, đi phân lỏng, sốt nhẹ

• Có trường hợp sốt cao, chân co

• Thời gian ủ bệnh 2h-20h

• Khỏi sau 2-3 ngày

2  Tổng quan về Coliforms:

PP đếm khuẩn lạc

PP MPN

3 Các phương pháp định lượng

Phương pháp ĐẾM KHUẨN LẠC.

3.1 1 Nguyên tắc.

• Số lượng Coliforms được xác định bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường

rắn chọn lọc thích hợp( thạch Violet Red Bile) có chứa lactose và chất chỉ thị pH Đếm

khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ ở 37oC trong thời gian 24h Đếm khuẩn lạc điển hình và khẳng định lại trong môi trường canh Brilliant Green Bile Salt Lactose ( BGBL),

Coliforms sẽ sinh khí trong môi trường này ở 37oC trong 24h Kết quả được biểu thị bằng

số Coliforms trên 1g mẫu chưa pha loãng.

Saline Pepton Water (SPW).

Trypton Soya Agar (TSA).

Violet Red Bile Agar (VRB).

Môi trường canh Brilliant Green Bile Salt Lactose ( BGBL).

3.1.4 Qui trình phân tích

10(25g) đối với mẫu rắn hoặc 10(25ml) đối với mẫu lỏng + 90(225ml)SPW

( Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60s)

+ 5ml môi trường TSA, xoay đều, để yên trong 1-2h Cấy 5 khuẩn lạc nghi ngờ vào các

ống nghiệm chứa BGBL, ủ ở 37oC

trong 24h

Tính và biểu thị kết quả

Pha loãng

1ml dịch 1ml dịch

+ 10/15ml môi trường thạch VRB Xoay nhẹ trộn đều mãu, để ở nhiệt độ phòng, chờ chô hỗn hợp đông, lật ngược đĩa và ủ ở 37oC

trong 24h

3.1.5 Các bước tiến hành.

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

 Cân chính xác 10g(25g) đối với mẫu rắn hoặc đong 10ml(25ml) đối với mẫu lỏng cho vào bình tam giác

 Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml(225ml) vô trùng vào bình tam giác chứa mẫu

 Đồng nhất mẫu + SPW trong máy dập mẫu 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác 2 – 3 phút

mẫu

SPW

3.1.5 Các bước tiến hành

LƯU Ý:

• Nhiệt độ của SPW trong suốt quá trình thao tác luôn giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng → VSV không bị tổn thương.

• Để pipet nằm ngang (không để đứng) do các bào tử lắng xuống nhanh.

3.1.5 Các bước tiến hành

Bước 2: Pha loãng mẫu

 Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml SPW vô trùng

 Trộn kỹ bằng máy vortex 5 – 10 giây → dd pha loãng (đối với mẫu nguyên chất thì dd pha loãng là )

 Lặp lại thao tác trên để có được dd pha loãng ,… cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp

•  

9ml SPW

9ml SPW

3.1.5 Các bước tiến hành

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu đã pha loãng vào đĩa petri Sử dụng 2 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri

Bổ sung thêm 5ml môi trường TSA, xoay đều đĩa để trộn đều mẫu, để yên trong 1-2h

10-1

10-2

1.1

2.2 2.1

3.1.5 Các bước tiến hành

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

Tiếp tục bổ sung thêm khoảng 15ml môi trường VRB Xoay tròn đĩa theo cùng và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần

Sau khi môi trường đông hoàn toàn rót thêm 4ml môi

trường VRB tráng kín bề mặt đĩa và để đông đặc như trên

Lật úp đĩa và ủ ở 377̊C trong 24h

1.1

2.2 2.1

1.2

VRB

3.1.5 Các bước tiến hành

Bước 4: Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

 Đếm các đĩa có số khuẩn lạc <150 sau 24h nuôi cấy

 Khuẩn lạc Coliforms đặc trưng trên môi trường VRB màu đỏ tía và được bao quanh bởi 1

vùng hơi đỏ

 Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để quy về số coliforms trong 1g mẫu

 Cấy 5 khuẩn lạc nghi ngờ của mỗi loại vào các ống nghiệm chứa môi trường lỏng BGBL,

ủ ở 377̊C trong 24h

3.1.6 Công thức tính.

Tổng số coliforms trong 1g mẫu:

X = (CFU/g hay CFU/ml)

• R: tỉ lệ khẳng định dương tính

• C: tổng số khuẩn lạc coliforms đếm được trên 4 đĩa

• V: thể tích dịch đã cấy trên mỗi đĩa (ml)

• d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất

• : số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất

• : số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai

•  

Phương pháp MPN

3.2.1 Nguyên tắc.

• Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi

khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN ( Most Possible Number) Phương pháp này dựa vào

nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân( hai nồng độ kế tiếp nhau 1/10, 1/100, 1/1000 ), các mẫu sau khi pha loãng sẽ được ủ trong ống nghiệp chứa môi trường thích hợp có ống bãy khí Durham Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống nghiệm Ghi nhận số ống dương tính ở mỗi nồng độ và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng VSV tương ứng hiện diện trong 1g( 1ml) mẫu ban đầu

3.2.2 Môi trường và hóa chất.

DD pha loãng SPW.

Môi trường canh BGBL.

Môi trường Lauryl Sulphate Broth(LSB).

3.2.3 Qui trình định lượng

Pha loãng mẫu để có nồng độ pha loãng 10-1,10-2,10-3,…

Chuyển 1ml dd 10-1.10-2,10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống, ủ ở 37oC, trong 48h.

Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng.

Cấy vào ống canh BGBL, ủ ở 37oC trong 48h

Ghi nhận các ống (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng Tra bảng Mac Crady.

3.2.4 Các bước tiến hành.

Bước 1: Chuẩn bị và pha loãng mẫu

 Chuẩn bị dịch đồng nhất mẫu hoặc pha loãng mẫu như phương pháp đếm khuẩn lạc định lượng coliforms để có độ pha loãng … Việc định lượng này được lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3x3=9 ống nghiệm

•  

1.1 1.2 1.3

3.3 3.2

3.1

2.3 2.2

2.1

1.2 LSB

1.3 LSB

2.3 LSB

2.2 LSB

2.1 LSB

3.3 LSB

3.2 LSB

3.1 LSB

Bước 2: Cấy và ủ mẫu

 Chuyển 1ml dd vào ống 10ml canh LSB Ủ ở 37oC trong 48h.

 Ghi nhận các ống LSB (+) ( sinh hơi ) ở mỗi nồng độ pha loãng.

•  

1ml

1ml

1ml

3.2.4 Các bước tiến hành

1.1

LSB

1.2 LSB

1.3 LSB

2.3 LSB

2.2 LSB

2.1

LSB

3.3 LSB

3.2 LSB

3.1

LSB

Bước 2: Cấy và ủ mẫu

Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 37oC trong 48h

1.1 BGBL

3.1 BGBL

2.2 BGBL

2.1 BGBL

1.3 BGBL 1.2

BGBL

3.2.4 Các bước tiến hành.

1.1 1.2 1.3

2.2 2.1

3.2.5 Cách đọc kết quả

 Lập 1 chỉ số gồm các ống nghiệm (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu

 Tra chỉ số trên theo bảng MPN của Mac Crady (3x3=9 ống nghiệm) để tính ra mật độ VSV trong mẫu (xác định số có xác suất lớn nhất của lượng VSV trong 1 đơn vị thể tích)

 Biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng

Cảm ơn cô và các bạn đã

lắng nghe