Quy trình định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí

I.Tình hình ngộ độc thực phẩm hiện nay:Trên thế giới:Các bệnh do thực phẩm gây ra hàng năm tới 600 triệu vụ và 42.000 ca tử vong trên thế giới. Nguyên nhân lớn nhất gây ra bệnh từ thực phẩm là: Norovirus, Campylobacter, Salmonella và E.coli. Ở miền Bắc của Đức, chủng E.coli gây ra bùng nổ nghiêm trọng bệnh từ thực phẩm từ tháng 562011. Bệnh được phát hiện bởi triệu chứng tiêu chảy ra máu ở tần suất cao và biến chứng nghiêm trọng. Hoa quả tươi là nguồn bị nhiễm chủng này mang gen sinh độc tố Shiga. Tổng cộng có 3.950 người bị ảnh hưởng, 53 người chết, 51 người ở Đức. 800 người bị ure huyết tán huyết có thể dẫn đến suy thận. Một số ít các trường hợp ở các quốc gia: Thụy Sĩ, Ba Lan, Canada, Hoa Kỳ….chủ yếu là Đức và Pháp.Việt Nam:Theo thống kê, hàng năm Việt Nam có khoảng 250500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.00010.000 nạn nhân và 100200 ca tử vong. Cụ thể gần đây nhất là ngày 75 tại Đà Nẵng có 230 người bị ngộ độc thực phẩm tại xã Hòa Phong, Hòa Khương, Hòa Nhơn, Hòa Tiến và Hòa Phú (Đà Nẵng).

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM  HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Đề tài: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HIẾU KHÍ Thành viên nhóm 01: Mai Trần Ngọc Diễm Đặng Võ Trúc Xuân Kiều Mai Thanh Tuyền Phan Thị Mỹ Liên Lê Thị Thúy Hậu 2005170955 2005170636 2005170207 2005170078 2005170360 GVHD: Hoàng Xuân Thế TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2020 PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC STT HỌ VÀ TÊN Đặng Võ Trúc Xuân MSSV 2005170636 Lê Thị Thúy Hậu 2005170360 Phan Thị Mỹ Liên 2005170078 Mai Trần Ngọc Diễm 2005170955 Kiều Mai Thanh Tuyền 2005170207 SVTH: NHĨM 01 CƠNG VIỆC Tình hình ngộ độc thực phẩm Đặc điểm tổng vi sinh vật hiếu khí + tổng hợp word Định nghĩa nguyên tắc + tổng hợp word Dụng cụ, thiết bị, mơi trường, hóa chất + tổng hợp powerpoint Quy trình phân tích GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH iii DANH MỤC BẢNG iv I Tình hình ngộ độc thực phẩm nay: II Đặc điểm tổng số vi sinh vật hiếu khí: III Định nghĩa nguyên tắc: .4 3.1 Chuẩn bị mẫu: 3.2 Pha loãng mẫu: 3.3 Cấy ủ mẫu: 3.4 Đếm khuẩn lạc: IV Dụng cụ, thiết bị, mơi trường, hóa chất: V Quy trình phân tích: .10 TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 SVTH: NHĨM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Các bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Đà Nẵng Hình 2: Công nhân điều trị bệnh viện .3 Hình 3: Tủ ấm vi sinh 15 SVTH: NHÓM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Dụng cụ, thiết bị, mơi trường, hóa chất Bảng 2: Kết thí nghiệm: 13 SVTH: NHĨM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM I Tình hình ngộ độc thực phẩm nay:  Trên giới: Các bệnh thực phẩm gây hàng năm tới 600 triệu vụ 42.000 ca tử vong giới Nguyên nhân lớn gây bệnh từ thực phẩm là: Norovirus, Campylobacter, Salmonella E.coli Ở miền Bắc Đức, chủng E.coli gây bùng nổ nghiêm trọng bệnh từ thực phẩm từ tháng 5-6/2011 Bệnh phát triệu chứng tiêu chảy máu tần suất cao biến chứng nghiêm trọng Hoa tươi nguồn bị nhiễm chủng mang gen sinh độc tố Shiga Tổng cộng có 3.950 người bị ảnh hưởng, 53 người chết, 51 người Đức 800 người bị ure huyết tán huyết dẫn đến suy thận Một số trường hợp quốc gia: Thụy Sĩ, Ba Lan, Canada, Hoa Kỳ….chủ yếu Đức Pháp  Việt Nam: SVTH: NHĨM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Theo thống kê, hàng năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân 100-200 ca tử vong Cụ thể gần ngày 7/5 Đà Nẵng có 230 người bị ngộ độc thực phẩm xã Hòa Phong, Hòa Khương, Hòa Nhơn, Hòa Tiến Hòa Phú (Đà Nẵng) Hình 1: Các bệnh nhân điều trị Bệnh viện Đa khoa Đà Nẵng Thời gian xảy lúc 15h với triệu chứng sốt, đau đầu, buồn nôn, nôn mửa, đau bụng tiêu chảy Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm người dân ăn phải ăn bị nhiễm vi sinh vật vượt mức cho phép Các ăn chay người dân sử dụng hơm gồm nem chay, mỳ căn, đậu khn chiên, cá kho chay, sườn xá xíu, chả chay kho, mì xào thịt bò, chả phù chúc, nui xào Các vi sinh vật có thức ăn vượt mức cho phép gây ngộ độc Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococus aureus SVTH: NHĨM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Sau bửa ăn tối ngày 14/10/2014 công ty TNHH MTA DHA huyện Lương Tài tỉnh Bắc Ninh cơng nhân có dấu hiệu ngộ độc thực phẩm đưa cấp cứu Tính đến ngày 16/10 có 371 cơng nhân xác định bị ngộ độc thực phẩm với triệu chứng: chóng mặt, đau bụng quằn quại, tiêu chảy cấp nhiều lần buồn nơn Hình 2: Cơng nhân điều trị bệnh viện Chi cục VSATTP tỉnh Bắc Ninh lấy mẫu bệnh phẩm mẫu thức ăn đưa kiểm tra làm rõ Theo trình phân tích ngun nhân gây ngộ độc cá mối khơ chiên có chứa độc tố E.coli Shigella II Đặc điểm tổng số vi sinh vật hiếu khí: Vi sinh vật đĩa thạch cịn gọi tổng số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa Vi sinh vật hiếu khí vi sinh vật tăng trưởng hình thành khuẩn lạc điều kiện có diện oxy phân tử Nhưng lại yêu cầu lượng phần trăm oxy mơi trường sống khí thơng thường (>21% O khơng tồn được, thường sống khoảng 2-10% O 2) Tổng số vi sinh vật hiếu khí diện mẫu phản ánh vệ sinh chế biến, độ tươi hay nguy cơ hỏng thực phẩm Tổng số vi sinh vật hiếu khí cịn thị chất lượng vệ sinh sinh thực phẩm Các nghiên cứu rõ tổng số vi sinh vật hiếu khí có tác dụng việc đánh giá chất lượng vệ sinh loại thực phẩm không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển thực phẩm khô hay thực phẩm đơng lạnh Với loại thực phẩm SVTH: NHĨM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM này, tổng số vi sinh vật hiếu kí sử dụng để đánh giá vệ sinh trình sản xuất, vận chuyển bảo quản thực phẩm Đối với thực phẩm tươi sống, giá trị trên, tổng số vi sinh vật hiếu khí tồn vi sinh vật gây bệnh thực phẩm tươi sống Số lượng vi sinh vật hiếu khí thấp thường khơng đơi với thực phẩm an toàn Các thực phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí nhiễm vi khuẩn gây bệnh khác Do đó, tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh độ an toàn thực phẩm Một nghiên cứu sản xuất trứng đông lạnh thương phẩm cho thấy trứng bị nhiễm Salmonella, Coliform cho dù có tiêu vi khuẩn hiếu khí an toàn  Chỉ số xác định phương pháp đếm khuẩn lạc mọc môi trường thạch dinh dưỡng, từ lượng mẫu xác định sở xem khuẩn lạc sinh khối phát triển từ tế bào diện mẫu biểu diễn dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit, CFU) đơn vị khối lượng hay thể tích thực phẩm có số tên gọi     khác như: Số vi sinh vật hiếu khí( Aerobic Count_ APC) Tổng số đếm đĩa (Total Plate Count_ TPC) Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count_ TVC) Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count_ SPC) Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí dùng để đánh giá chất lượng mẫu vi sinh vật, nguy hư hỏng, thời gian bảo quản sản phẩm, mức độ vệ sinh trình chế biến, quản sản phẩm Tổng số vi khuẩn hiếu khí cho phép có mặt sản phẩm thay đổi, cao 5.104 khuẩn lạc/g sản phẩm III Định nghĩa nguyên tắc: 3.1 Chuẩn bị mẫu: Định nghĩa: Huyền phù, dung dịch nhũ tương thu được, sau cân đong lượng sản phẩm xác định cần kiểm tra (hoặc mẫu thử chuẩn bị từ sản phẩm) trộn với lượng dung dịch pha loãng thường gấp lần để đồng mẫu SVTH: NHÓM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Nguyên tắc: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6507-1:2005 (ISO 6887-1 : 1999) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật Cân lượng m g với sai số cho phép ±5% đong thể tích V ml với sai số cho phép ±5% (tối thiểu 10 g 10 ml, trừ có qui định khác), phần mẫu thử đại diện cho vào chén đựng vô trùng túi bằn chất dẻo vô trùng Để vi sinh vật không bị tổn thương thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ dịch pha lỗng suốt q trình thao tác mơ tả phải giữ xấp xỉ nhiệt độ phòng, trừ trường hợp sản phẩm cụ thể (xem tiêu chuẩn riêng) Đồng hóa hỗn hợp theo khuyến cáo TCVN 6404 (ISO 7218) Để hạt to lắng xuống 15 phút, cần Có thể sử dụng hệ thống lọc để có kết tương đương 3.2 Pha loãng mẫu: Định nghĩa: Pha loãng mẫu làm giảm số lượng vi sinh vật có đơn vị thể tích Nguyên tắc: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833-2: 2013) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng vi sinh vật đĩa thạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 30℃ Bộ Khoa học Công nghệ ban hành Dùng pipet vô trùng lấy ml huyền phù ban đầu với sai số đo ±5% cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha lỗng vơ trùng nhiệt độ thích hợp Chú thích: Nếu cần thể tích lớn hơn, thêm thể tích xác định (lớn 1ml) huyền phù ban đầu với sai số đo ±5%, vào ống nghiệm chứa thể tích dịch pha lỗng vơ trùng gấp chín lần Để có độ xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu cm SVTH: NHĨM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Khơng để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha lỗng vơ trùng Trộn kỹ, tốt dùng máy khuấy để trộn giây đến 10 giây để thu dung dịch pha loãng 10-2 Nếu cần, lặp lại thao tác sử dụng dung dịch pha loãng dung dịch pha lỗng tiếp theo, dùng pipet vơ trùng độ pha lỗng để thu dung dịch pha loãng 10-3, 10-4,…cho đến thu số lượng vi sinh vật thích hợp Chú ý: Thời gian kể từ chuẩn bị huyền phù ban đầu đến bắt đầu chuẩn bị dung dịch pha lỗng thập phân khơng vượt 30 phút, trừ có qui định khác tiêu chuẩn riêng 3.3 Cấy ủ mẫu: Định nghĩa: Cấy thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường sống sang môi trường thuận lợi cho phát triển chúng Nguyên tắc: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833-2: 2013) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng vi sinh vật đĩa thạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 30℃ Bộ Khoa học Công nghệ ban hành SVTH: NHĨM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Lấy hai đĩa Petri vô trùng Dùng pipet vô trùng cho vào đĩa ml mẫu thử sản phẩm chất lỏng ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác (độ pha lỗng ) Lấy hai đĩa Petri vơ trùng khác Dùng pipet vô trùng cho vào đĩa ml dịch pha loãng (nếu sản phẩm chất lỏng) ml dung dịch pha loãng (nếu sản phẩm dạng khác) Lặp lại trình tự với dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vơ trùng dung dịch pha lỗng thập phân, cần Nếu thích hợp có thể, chọn bước pha lỗng tới hạn (ít hai dung dịch pha loãng thập phân liên tiếp) để cấy đĩa Petri cho thu số đếm từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc đĩa Petri Rót vào đĩa Petri khoảng 12 ml đến 15 ml môi trường thạch đếm đĩa 44℃ đến 47℃ Thời gian từ chuẩn bị xong huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng sản phẩm chất lỏng) đến rót mơi trường vào đĩa không vượt 45 phút Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường cách xoay đĩa Petri hỗn hợp đông đặc lại cách đặt đĩa Petri bề mặt nằm ngang, mát Sau đơng đặc hồn tồn nghi ngờ sản phẩm cần kiểm tra có chứa vi sinh vật mà khuẩn lạc chúng mọc lan khắp bề mặt mơi trường, rót khoảng ml mơi trường phủ 44℃ đến 47 ℃ lên bề mặt môi trường cấy mẫu Để cho đông đặc mô tả Lật ngược đĩa cấy mẫu đặt vào tủ ấm 30 ℃ ± ℃ 72 h ±3 h Không xếp chồng cao sáu đĩa Các chồng đĩa cần tách khỏi cách xa thành tủ 3.4 Đếm khuẩn lạc: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833 -2: 2013) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng vi sinh vật đĩa thạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 30℃ Bộ Khoa học Công nghệ ban hành SVTH: NHĨM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Sau giai đoạn ủ qui định, đếm khuẩn lạc đĩa sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc, cần Kiểm tra đĩa ánh sáng dịu Điều quan trọng khuẩn lạc phải đếm tránh đếm nhầm với hạt khơng hịa tan chất kết tủa đĩa Kiểm tra cẩn thận khuẩn lạc nghi ngờ, cần nên dùng kính lúp có độ khuếch đại lớn để phân biệt khuẩn lạc với tạp chất lạ Các khuẩn lạc mọc lan rộng coi khuẩn lạc đơn lẻ Nếu phần tư đĩa mọc dày lan rộng, đếm khuẩn lạc phần đĩa cịn lại tính số tương ứng cho đĩa Nếu phần tư đĩa bị mọc dày lan rộng loại bỏ đĩa không đếm IV Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất: Bảng 1: Dụng cụ, thiết bị, mơi trường, hóa chất Mơi trường, hóa chất Tên mơi trường, hóa chất Quy cách Saline Pepton Water ( SPW) Plate count agar ( PCA) Cồn 900 700 HCL 10% NaOH 10% Dụng cụ ( sử dụng cho mẫu phân tích) Ống nghiệm Φ18mm Đĩa petri Φ100mm Cốc thủy tinh 100ml Cốc thủy tinh 250ml Bình tam giác bao nylong vô 250ml bao loại trùng kg Ống đong 100ml Đầu tip Pipetman 1000μl Đèn cồn Ống hút nhỏ giọt Bút lông dầu Bông thấm nước Thiết bị Tủ cấy vô trùng Nồi hấp Tủ ấm 300C Máy dập mẫu (Stomacher) SVTH: NHÓM 01 Số lượng/đơn vị tính 1,2 – 1,4g 45ml – 75ml đến ống đĩa cái cái đến cái cái 0,5kg cái cái GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Máy trộn mẫu (vortex mixer) Cân phân tích pH kế Bể ổn nhệt Pipetman Lò viba 1000μl 100μl cái cái Mỗi loại cái Môi trường PCA - Principle And Interpretation Plate Count Agar is formulated as described by Buchbinder et al (2) which is recommended by APHA (1,6,7) and FDA (3) Tryptone provides nitrogenous and carbonaceous compounds, long chain amino acids, and other essential nutrients Yeast extract supplies Vitamin B complex APHA recommends the use of pour plate technique The samples are diluted and appropriate dilutions are added in Petri plates Sterile molten agar is added to these plates and plates are rotated gently to ensure uniform mixing of the sample with agar The poured plate count method is preferred to the surface inoculation method, since it gives higher results Plate Count Agar is also suitable for enumerating bacterial count of sterile rooms - Nguyên tắc giải thích ( theo HIMEDIA) Plate Count Agar bào chế theo mô tả Buchbinder đồng đội (2) APHA (1,6,7) FDA (3) khuyến nghị Tryptone cung cấp hợp chất nitơ carbonat, axit amin chuỗi dài chất dinh dưỡng cần thiết khác Men chiết xuất cung cấp Vitamin B phức tạp APHA khuyến nghị sử dụng kỹ thuật hộp đổ Các mẫu pha loãng pha lỗng thích hợp thêm vào đĩa Petri Agar nóng chảy vơ trùng thêm vào đĩa đĩa xoay nhẹ nhàng để đảm bảo trộn mẫu với thạch Phương pháp đếm hộp đổ ưa thích bề mặt cấy phương pháp, cho kết cao Plate Count Agar thích hợp để liệt kê số lượng vi khuẩn phịng vơ trùng SVTH: NHĨM 01 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM V Quy trình phân tích: 10g/25g mẫu rắn 10ml/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water Đồng mẫu Stomacher 60 giây Dịch mẫu 10-1 Pha loãng Dịch mẫu 10-2 15 ml 15 ml PCA 02 đĩa 02 đĩa (PCA đung chảy làm nguội đến 470C) Xoay nhẹ trộn mẫu, nhiệt độ phịng, chờ hỗn hợp đơng đặc, lật ngược đĩa ủ tủ ấm 300C 72 ± Đọc kết qủa chọn đĩa mọc lớn 15 nhỏ 300 khuẩn lạc độ pha loãng liên tiếp Tính biểu thị kết SVTH: NHĨM 01 10 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM  CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Ví dụ để giải thích quy trình Quy trình định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí thực phẩm tóm tắt: Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Chọn nồng độ pha lỗng thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vơ trùng (mỗi nồng độ cấy đĩa) Rót vào đĩa 10 – 15ml môi trường PCA làm nguội đến 450C, lắc cho mẫu phân tán vào môi trường, ủ 300C 72 Chọn đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa để đếm Tính kết quả: tổng vi sinh vật hiếu khí mẫu (CFU/g CFU/ml) Bước 1: Đồng pha loãng mẫu Mẫu thực phẩm cắt nhỏ xay nhuyễn máy điều kiện vô trùng thể đồng Cân xác 10g thực phẩm chuẩn bị (hoặc SVTH: NHĨM 01 11 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình tam giác có chứa 90 ml đệm pepton, lắc 2-3 phút thu dung dịch mẫu thử 10-1 Hút xác 1ml dung dịch mẫu thử 10 -1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml đệm pepton, 2-3 phút thu dung dịch mẫu thử 10-2 Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng Bước 2: Cấy ủ mẫu Dùng pipet vô trùng hút mẫu thử cho vào đĩa petri vô khuẩn, đĩa 1ml mẫu thử chất lỏng 1ml huyền phù mẫu thử dạng khác Lặp lại trình dịch pha loãng Đổ vào đĩa 12-15ml môi trường thạch để đếm đĩa 44-470C Trộn dịch nuôi cấy với môi trường thạch cách xoay nhẹ đĩa petri theo hai chiều trái, phải Để đĩa mặt phẳng cho thạch đông đặc lại Nếu dự đốn sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan mặt thạch sau mơi trường đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên bề mặt Để thạch đông, lật ngược đĩa ủ ấm 300C ±1oC thời gian 72 ± Thời gian bắt đầu pha loãng đến rót mơi trường vào đĩa khơng q 30 phút Bước 3: Đếm khuẩn lạc Sau 48 tính kết sơ cách đếm khuẩn lạc mọc đĩa ni cấy, sau 72 tính kết thức, đếm tồn số khuẩn lạc mọc ghi nhận kết thức Sự phân bố khuẩn lạc đĩa petri phải hợp lý Độ pha lỗng cao số khuẩn lạc Nếu kết khơng hợp lý phải tiến hành lại bước nuôi cấy Sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (nếu cần) Kiểm tra đĩa ánh sáng dịu, điều quan trọng khuẩn lạc phải đếm tránh đếm nhầm với hạt khơng hịa tan chất kết tủa đĩa Kiểm tra cẩn thận khuẩn lạc nghi ngờ, cần nên dùng kính lúp có độ khuếch đại lớn để phân biệt khuẩn lạc với tạp chất lạ SVTH: NHĨM 01 12 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Các khuẩn lạc mọc lan rộng coi khuẩn lạc đơn lẻ Nếu ¼ đĩa mọc dày lan rộng, đếm khuẩn lạc đĩa phần cịn lại tính số tương ứng cho đĩa Nếu ¼ đĩa bị mọc dày lan rộng loại bỏ đĩa khơng đếm  Cách tính kết Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn đĩa có số đếm từ 25 đến 250 để tính kết Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí 1g hay 1ml mẫu tính sau: N = (CFU/g hay CFU/ml) Trong đó: N: Số khuẩn lạc 1ml (1g) mẫu ⅀C: Tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa giữ lại từ độ pha loãng liên tiếp đĩa chứa tối thiểu 15 khuẩn lạc V: Thể tích dịch cấy cấy đĩa, tính mililit N1: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ N2: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ D: Độ pha loãng huyền phù ban đầu độ pha loãng thứ cấy giữ lại (d=1 sản phẩm dạng lỏng) Ví dụ cụ thể: SVTH: NHĨM 01 13 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Bước 1: Đồng mẫu Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng (hoặc H 2O vô trùng ) vào bao PE vô trùng Tiến hành đồng máy stomacher 30” thu nồng độ 10-1 Bước : Pha loãng mẫu Chuẩn bị ống nghiệm pipet vô trùng Dùng pipet 10ml vô trùng lấy ml NaCl vô trùng vào ống nghiệm Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ Tiến hành rung lắc ống nghiệm máy rung ống nghiệm votex, thu nồng độ 10-2 Làm tương tự với nồng độ Lưu ý pha loãng mẫu: - Nồng độ pha lỗng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh thực phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm nghiệm… - Tiến hành thao tác bên lửa đèn cồn Các ống nghiệm, pipet phải vô trùng Sử dụng micropipet 1ml/1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh tượng sai số - Mỗi lần lấy mẫu phải lắc SVTH: NHÓM 01 14 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Bước 3: Ni cấy dịch mẫu  Ni cấy nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp  Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa, đĩa/nồng độ  Chuẩn bị môi trường tiệt trùng, để nguội 45 0C, đổ môi trường vào đĩa chứa 1ml dịch mẫu Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn dịch mẫu với môi trường để thu khuẩn lạc tách rời Khi môi trường đông lại, lật ngược đĩa, ủ trong tủ ổn nhiệt XB 058 France Etuves  Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng mơi trường P.C.A N.A  Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A Sabouraund  Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-37 0C Thời gian ủ men, mốc 72h/30370C Hình 3: Tủ ấm vi sinh SVTH: NHÓM 01 15 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Bước 4: Đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ (25-250 khuẩn lạc/đĩa) Nồng độ Số khuẩn lạc Bảng 2: Kết thí nghiệm: 10-3 10-4 Đĩa Đĩa Đĩa Đĩa 168 173 15 19 Bước 5: Tính kết theo công thức : N = (CFU/g hay CFU/ml) Trong đó: N: Số khuẩn lạc 1ml (1g) mẫu ⅀C: Tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa giữ lại từ độ pha lỗng liên tiếp đĩa chứa tối thiểu 15 khuẩn lạc V: Thể tích dịch cấy cấy đĩa, tính mililit N1: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ N2: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ D: Độ pha loãng huyền phù ban đầu độ pha loãng thứ cấy giữ lại (d=1 sản phẩm dạng lỏng)  N = = 170454 Làm tròn kết 1,7 × CFU/g (hoặc CFU/ml) SVTH: NHĨM 01 16 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM SVTH: NHĨM 01 17 GVHD: HỒNG XN THẾ PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình phân tích vi sinh thực phẩm- Trường ĐH Cơng nghiệp thực phẩm TP HCM Giáo trình phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, TRẦN LINH THƯỚC [vanbanphapluat.c o] tcvn4884-2-2015.pdf TCVN 4883-2: 2015 (ISO 4833-2:2013) [vanbanphapluat.c o] tcvn6507-1-2005.pdf TCVN 6507-1:2005 PCA.pdf PCA theo HIMEDIA SVTH: NHĨM 01 18 GVHD: HỒNG XN THẾ ... q trình phân tích ngun nhân gây ngộ độc cá mối khơ chiên có chứa độc tố E.coli Shigella II Đặc điểm tổng số vi sinh vật hiếu khí: Vi sinh vật đĩa thạch gọi tổng số vi sinh vật hiếu khí, tổng số. .. hiếu khí tồn vi sinh vật gây bệnh thực phẩm tươi sống Số lượng vi sinh vật hiếu khí thấp thường khơng đơi với thực phẩm an tồn Các thực phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí. .. thường sống khoảng 2-10% O 2) Tổng số vi sinh vật hiếu khí diện mẫu phản ánh vệ sinh chế biến, độ tươi hay nguy cơ hỏng thực phẩm Tổng số vi sinh vật hiếu khí cịn thị chất lượng vệ sinh sinh thực