QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG số VI SINH vật HIẾU KHÍ

Bước 1: đồng nhất mẫu Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H20 vô trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng nhất bằng máy stomacher 30” thu được nồng độ 10-1 Bước 2 : pha loãng mẫu Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng lấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm .Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ nhất . Tiến hành rung lắc ống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10-2 .Làm tương tự với các nồng độ kế tiếp Lưu ý khi pha loãng mẫu: -Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thực phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm nghiệm…. -Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiện tượng sai số -Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều

Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa: Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều kiện có oxy phân tử 2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí: Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hư hỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chất lượng : 10 6 tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=10 6 tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 10 5 tế bào/g(ml) sữa bị chua: 10 6 -10 7 tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;10 8 tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm có mùi hôi không chấp nhận được;10 9 -10 10 tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổi cấu trúc 3.Quy trình kiểm tra: Trang 1 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1ml(10 -1 )+ 9ml nước 1ml(10 -1 )+ 9ml nước nước vô trùng nước vô trùng Stomacher .10gr thực phẩm 10 -2 10 -3 + 90ml NaCl 0.85% (10 -1 ) Bước 1: đồng nhất mẫu Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H 2 0 vô trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng nhất bằng máy stomacher 30” thu được nồng độ 10 -1 Bước 2 : pha loãng mẫu Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng lấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm .Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml từ nồng độ 10 -1 đưa vào ống nghiệm thứ nhất . Tiến hành rung lắc ống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10 -2 .Làm tương tự với các nồng độ kế tiếp Lưu ý khi pha loãng mẫu: Trang 2 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C -Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thực phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm nghiệm…. -Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiện tượng sai số -Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2 đĩa/nồng độ Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng,để nguội 45 0 C,đổ môi trường vào các đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu .Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đều dịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môi trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.A hoặc N.A Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặc Sabouraund Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-37 0 C.Thời gian ủ men,mốc 72h/30-37 0 C Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa) Kết quả thí nghiệm Nồng độ 10 -1 10 -2 10 -3 Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 1 Đĩa 2 Số khuẩn lạc 48 130 113 125 105 120 Bước 5: tính kết quả theo công thức Trang 3 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C n = c/(n1+0.1n2)*d n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml)) c : tổng số khuẩn lạc đếm được n1 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư nhất n2 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư hai d : nồng độ pha loãng thứ nhất được đếm =>n= )2.1,02( 100).120105125113( + +++ =21045 ≈ 21000 cfu/g(ml) 4.Môi trường sử dụng 4.1.Môi trường Nutrient Agar Peptone :5.0g Meat extract :3.0g Agar :12.0g Nước cất :1000ml pH sau thanh trùng : 7.0 ± 0.2 Hấp thanh trùng ở 121 0 C/15 phút 4.2.Môi trường Plate Count agar Peptone :5.0g Meat extract :2.5g D(+) glucose :1.0g Agar :14.0g Nước cất vừa đủ :1000ml pH sau thanh trùng : 7.0 ± 0.2 Hấp thanh trùng ở 121 0 C/15 phút 4.3.Môi trường Sabouraund Peptone :20g Glucose :40g Trang 4 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Agar :20g Nước :1000ml Hấp thanh trùng ở 121 0 C/15 phút BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SỐ COLIFORM 1.Những kiến thức chung về COLIFORM Coliform là nhóm trực khuẩn gram- , không bào tử , hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng lên men đường lactose, sinh hơi ở 37 o C /24 – 48h. Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm vi sinh vật dùng để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhóm coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý, gram - , không bào tử , hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường lỏng, dựa vào nhiệt dộ tăng trưởng, nhóm này được chia thành 2 nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ phân các loài động vật. Trên thực tế kiểm nghiệm coliform phân được quan tâm nhiều hơn coliform. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống escherichia, kebsiella, enterobater. Khi coliform phân hiện diện ở một số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân.Chỉ tiêu tổng coliform không thích hợp để làm chỉ tiêu chỉ thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước bởi phân. Tuy nhiên việc xác định số lượng Feacal coliform có thể sai lệch do có một số vi sinh vật (không có nguồn gốc từ phân) có thể phát triển ở nhiệt độ 44 o C. Do đó số lượng E. coli được coi là một chỉ tiêu thích hợp nhất cho việc quản lý nguồn nước. Trong các thành viên nhóm coliform phân thì E.coli là loài được quan tâm nhiều về vệ sinh an toàn thực phẩm. Loài vi sinh vật này phân bố ở mọi nơi, có trong ruột người và các động vật máu nóng. Trang 5 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C *một số hình ảnh về coliform: Fecal Coliform 375 x 294 Chromocult® Coliform Agar ES 297 x 300 2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu Trang 6 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị. Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chỉ thị cho khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Số lượng coliforms cao thì khả năng hiện diện của vi sinh vật gây bệnh khác cao. Colifrorm chịu nhiệt( coliform phân): • Là thành phần trong hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động vật máu nóng. • Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản , vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chỉ thị sự ô nhiễm phân trong môi trường. • Lên men đường lactose trong môi trường E.C ở 44.5 o C. • Có khả năng sinh indol 24h/44.5 o C. • Kết quả sinh hóa nghiệm pháp imvic là + + - - 3.Quy trình kiểm tra Phương pháp MPN : Nguyên tắc: Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân , 2 nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống. Theo dõi sự sinh hơi trong từng ống nghiệm. Xác định ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu Sơ đồ quy trình kiểm tra : Trang 7 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1ml(10 -1 )+ 9ml nước 1ml(10 -2 )+ 9ml nước vô trùng nước vô trùng Stomacher 10gr thực phẩm 10 -2 10 -3 + 90ml NaCl 0.85%( 10 -1 ) hình 1.1 Bước 1: 10gr thực phẩm + 90ml NaCl 0.85% hoặc là nước vô trùng, stomacher thu được nồng độ 10 -1 . mục đích đồng nhất là để phân bố đều vi sinh vật. Trang 8 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Bước 2: Pha loãng mẫu để giảm số lượng vi sinh vật có trong mẫu ban dầu. Lấy 1ml mẫu ở nồng độ 10 -1 cho vào ống nghiệm thứ nhất, sau đó cho 9ml nước vô trùng. Ta được ống nghiệm có nồng độ 10 -2 . Sau đó lấy 1ml mẫu ở nồng 10 -2 cho vào ống nghiệm thứ hai + 9ml nước vô trùng thu được ống nghiệm có nồng độ 10 -3 . tương tự như trên ta thu được các ống nghiệm có nồng độ 10 -4 , 10 -5 … Bước 3: Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ở 3 nồng độ liên tiếp(10 -1 ,10 -2 ,10 -3 ) như sau : Mỗi nồng độ lấy 3 ống nghiệm. Cho vào mỗi ống nghiệm 1 ống durham, cho môi trường LT vào 9 ống nghiệm sao cho ngập ống durham. Ghi 3 nồng độ liên tiếp bên ngoài ống nghiệm(mỗi nồng độ 3 ống nghiệm). Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu ở nồng độ 10 -1 vào 3 ống nghiệm có ghi nồng độ 10 -1 (chứa môi trường LT),tương tự cho các ống nghiệm ở những nồng độ tiếp theo. (hình 1.1) ủ ở 37 o C/24h Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): -Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. - Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Laury Trytose. - Không lắc những ống có ống durham Bước 4: Đọc kết quả các ống Laury Tryptose . Có 3 trường hợp xảy ra: + ống durham không thay đổi + ống durham nổi lên trên + ống durham sinh hơi. Trang 9 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Đọc kết quả các ống LT dương tính, sau đó cấy chuyền các ống LT dương tính này vào các ống môi trường BGBL 2% bằng cách lấy que cấy vòng nhúng vào môi trường LT dương tính ở trên,rồi cho vào ống có môi trường BGBL. Ghi nồng độ trên sản phẩm. Ủ 37 o C /24h. Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoặc có bọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông =1/10 thể tích ống chuông). Ống LT - : không có hiện tượng gì xảy ra Bước 5: Đọc kết quả ống BGBL dương tính. Lập tỷ lệ các ống BGBL dương tính ở 3 nồng độ liên tiếp. Tra bảng Mac Crady tìm số MPN tương ứng + ống BGBL dương tính: môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoặc có bọt khí trong ống chuông( thể tích bọt khí =1/10 thể tích ống chuông). + ống BGBL âm tính: không có hiện tượng gì xảy ra. Bước 6: Tính kết quả: Tổng số coliform (cfu/g hoặc cfu/ml)= số MPN × 10 n n là số nguyên dương của nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy. Bước 7: Từ kết quả tính được, so sánh với tiêu chuẩn về an toàn vệ sinh thực phẩm. 4. Môi trường sử dụng: Môi trường BGBL 2% : là môi trường dùng để phát hiện và đếm coliforms, coliforms phân, E.coli trong sữa, thực phẩm, nước. Nguyên tắc: Trang 10 [...]... không có màu vàng MỤC LỤC Trang BÀI 1 :QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT 1 HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa 1 2.Ý nghĩa của vi c kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí 1 3 .Quy trình kiểm tra 1 4.Môi trường sử dụng 4 BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SỐ COLIFORM 5 1.Những kiến thức chung về COLIFORM 5 2.Ý nghĩa của vi c kiểm tra chỉ tiêu 7 3 .Quy trình kiểm tra 7 Trang 29 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 4... BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI 12 1.Mục đích thí nghiệm 12 2 Nguyên tắc 12 3.Dụng cụ và hóa chất 4.Tiến hành thí nghiệm 12 13 BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS 18 1 Đặc điểm của Stapylococcus aureus 18 2 Ý nghĩa của vi c kiểm tra vi khuẩn 21 3 Quy trình kiểm tra 21 4 Mở Rộng 24 BÀI 5: KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERA,VIBRIO 26 PARAHAEMOLYTICUS 1.Giới thiệu chung 26 2 .Quy trình kiểm tra 27... 20 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C trên da ở người và động vật do Staphylococcus gây ra dùng dung dịch gentiant violet 2% Một số hình ảnh về Staphylococcus aureus 2 Ý nghĩa của vi c kiểm tra vi khuẩn: Sự hiện diện với mật độ cao của Sta Aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến 3 Quy trình kiểm tra: 3.1 Quy trình kiểm tra định tính... quả Số lượng Staphylococci coagulase dương tính: cs=(f1*nt*ht)+(f2*na*ha) trong đó cs :số lượng Staphylococci coagulase dương tính f: nồng độ pha loãng của mẫu nt :tổng số khuẩn lạc điển hình trên các đĩa Trang 22 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C na :tổng số khuẩn lạc không điển hình trên các đĩa ht =số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm cho kết quả +/ số khuẩn lạc điển hình được thử nghiệm ha =số. .. _ 10-2 Trang 11 Thực tập vi sinh đại cương _ Nhóm 3_Lớp 071160C _ _ 10-3 Tỷ lệ của BGBL dương tính ở 3 nồng độ (10-1:10-2:10-3) = (0,2,0) Tra bảng Mac Crady ta được số MPN =6.2N/g ∑coliform = 6.2 × 101=62 (cfu/ml) BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI Escherichia coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển được ở 44ºC, sinh indol (phản ứng ind+), sinh acid (phản ứng MR+), không sinh aceton... nghiệm pháp imvic với vi khuẩn đã cấy ở bước 5 I : indol M :methyl red V : V.P Trang 17 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C C : simon citrat Phản ứng sinh hóa kiểm tra sự có mặt của trực khuẩn đường ruột Gr– có khả năng sử dụng simon citrat Kết quả : + + - - : E.coli type I - + - - : E.coli type II BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1 Đặc điểm của Stapylococcus aureus: 1.1 lịch sử:... 12 h sau khi ăn một lượmg lớn vi sinh vật sống (105 tế bào/g).Cá triệu chứng trên tương tự như triệu chứng do Salmonella gây ra nhưng trầm trọng hơn.Salmonella tác dụng lên vùng bụng trong khi V.parahaemolyticus tác dụng lên dạ dày người bệnh 2 .Quy trình kiểm tra Bước 1: Tăng sinh 25 g thực phẩm ( mắm tôm) + 225ml peptone kiềm, stomacher Ủ 370C/24h Rất khó phát hiện Vibrio trong mẫu,vì vậy ta sử dụng... nên phải tạo điều thuận lợi để Vibrio sinh trưởng bằng cách tăng sinh trong môi trường pepton kiềm Bước 2 : Phân lập từ phần váng của dịch tăng sinh lên môi trường TCBS agar.Ủ370C/24h Bước 3 : nhận diện khuẩn lạc điển hình Vi sinh vật Vibrio cholera Đặc điểm Vàng,chuyển màu môi trường từ xanh sang Vibrio parahaemolyticus vàng,dẹp,2-3mm Không màu,tâm xanh lá cây đậm hơn màu Vibrio alginolyticus môi trường,3-4mm... citrate làm nguồn cacbon (phản ứng cit-).Là trực khuẩn gram-, có khả năng gây bệnh tiêu chảy và sinh nội độc tố.Được coi là vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân và chất lượng vệ sinh thực phẩm Các chủng E.coli có khả năng gây bệnh ở người : - Các chủng truyền thống gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em - Các chủng yếm khí không bắt buộc gây tiêu chảy không thường xuyên có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh. .. Kiểm tra sức khoẻ công nhân • Không lấy sữa từ động vật bị vi m vú • Trử lạnh thực phẩm < 8oC, ngăn ngừa khả năng sinh độc tố • Hạ pH của thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển • toC = 60oC/ 0.5h phá huỷ các tế bào, một số bị phân huỷ ở to= 80 oC / 0.5h • Hoá chất: fenol 1%, fenol 2%/15’, hgcl 0.5%/1h, formaldehyt 10%/10’, gentiant violet1:25.000/5 – 10’, xử lý nhiễm vết thương Trang 20 Thực tập vi . Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C BÀI 1 :QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa: Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng. phân tử 2.Ý nghĩa của vi c kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí: Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm,đánh