NGHIÊN cứu PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN nấm BỆNH aspergillus flavus SINH độc tố AFLATOXIN BẰNG KỸ THUẬT PCR

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------      ---------- LÊ THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẨN ðOÁN NẤM BỆNH Aspergillus flavus SINH ðỘC TỐ AFLATOXIN BẰNG KỸ THUẬT PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số: 60.62.10 Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM XUÂN HỘI HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Lê Thị Thu Hằng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Xuân Hội, người ñã tận tình dạy bảo, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng như thực hiện nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và các cán bộ trong Bộ môn Bệnh Cây ñã tận tình dạy dỗ và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Bộ môn. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô trong Khoa Nông học, Viện ñào tạo Sau ñại học – Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã dạy dỗ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Bộ môn trong thời gian vừa qua. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã nhiệt tình ñộng viên giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2009 Lê Thị Thu Hằng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình viii 1. MỞ ðẦU 1 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp. và ñộc tố Aflatoxin trên lương thực, thực phẩm 3 2.2 Sơ lược về các loài nấm Aspergillus spp. 8 2.3 Những ñặc tính của ñộc tố Aflatoxin 13 2.4 Các biện pháp chẩn ñoán nấm A. flavus sinh ñộc tố Aflatoxin 21 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Vật liệu nghiên cứu 29 3.2 Phương pháp nghiên cứu 30 3.3 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 37 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Kết quả thu thập và phân lập nấm bệnh Aspergillus flavus từ một số nông sản ở Việt Nam 38 4.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến tốc ñộ phát triển của nấm bệnh Aspergillus flavus ñược phân lập từ một số nông sản của Việt Nam. 42 4.3 Kết quả tách chiết ADN tổng số 46 4.4 Kết quả phân tích bằng phản ứng PCR ñặc hiệu với 4 cặp mồi ver-1, omt-1, nor – 1 và apa-2 49 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 4.5 Kết quả phân tích bằng phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi ñặc hiệu ver – 1 , omt – 1 , nor – 1 và apa – 2. 53 4.6 Các phương pháp khác dùng ñể chẩn ñoán nấm Aspergillus flavus sinh ñộc tố Aflatoxin. 58 4.6.1 Dùng môi trường CAM (Coconut agar medium) 58 4.6.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng ((Thin layer chromatography) - TLC 61 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 5.1 Kết luận 65 5.2 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A. candidus Aspergillus candidus A. glacus Aspergillus glacus A. flavus Aspergillus flavus A. paraciticus Aspergillus paraciticus A. nomius Aspergillus nomius A. fumigatus Aspergillus fumigatus A. ochraceus Aspergillus ochraceus A. oryzae Aspergillus oryzae cDNA Complementary DNA CTAB Cetyltrimethylammonium bromide CS Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates ðC ðối chứng EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid HPLC High – performance liquid chromatography HPTLC High performance thin layer chromatography KAc Kalipotassium acetate PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp SDS Sodium lauryl sulfate TLC Thin – layer chromatography TE Tris- EDTA Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Sự có mặt của A. flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc (từ 1967-1983 ở Philippin) 5 2.2 Tính chất lý hóa của các Aflatoxin 16 2.3 Mối quan hệ giữa tỷ lệ ung thư gan với sự hấp thu Aflatoxin vào cơ thể 18 2.4 Những quy ñịnh tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam 20 2.5 Hàm lượng cho phép tối ña của Aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi 21 3.1 Các chủng nấm A. flavus thuần ñược phần lập trên các nông sản và ñịa phương khác nhau 29 4.1 Số lượng các chủng nấm A. flavus thuần thu ñược trên các nông sản tại các vùng khác nhau 42 4.2 So sánh tốc ñộ phát triển (cm) của các chủng nấm A. flavus tại các nông sản khác nhau ở nhiệt ñộ 20 0 C, 28 0 C và 30 0 C 42 4.3 Tốc ñộ phát triển (cm) của các chủng nấm A. flavus trên các mẫu nông sản ñược nuôi cấy trên môi trường PDA, ở nhiệt ñộ 28 0 C 45 4.4 Kết quả kiểm tra chất lượng ADN tổng số sử dụng phương pháp ño quang phổ hấp thu (OD 260/280 ) 48 4.5 Kết quả phản ứng PCR ñặc hiệu với các mẫu nấm A. flavus 51 4.6 Tần số bắt cặp của các cặp mồi trong phản ứng PCR ñặc hiệu 52 4.7 Tổng hợp kết quả phản ứng Multiplex PCR với các mẫu nấm Aspergillus flavus sử dụng cả 4 cặp mồi: Ver - 1 , Omt - 1, Nor – 1 và Apa - 2 55 4.8 Tần số bắt cặp của các cặp mồi trong phản ứng Multiplex PCR 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii 4.9 So sánh kết quả phương pháp Multiplex PCR và phương pháp dựa vào màu sắc chủng nấm trên môi trường CAM ñể phát hiện chủng nấm A. flavus sinh ñộc tố Aflatoxin 59 4.10 So sánh kết quả phương pháp Multiplex PCR và phương pháp sắc ký lớp mỏng ñể phát hiện chủng nấm A. flavus sinh ñộc tố Aflatoxin 63 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Chu kỳ của nấm A. flavus trên ngô vàng 9 2.2 Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link – Cơ quan sinh sản gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi) 11 2.3 Mối quan hệ di truyền của một số loài nấm Aspergillus spp. 12 2.4 Hình thái cuống sinh bào tử của nấm A. flavus và nấm A. oryzae 12 2.5 Màu sắc khuẩn lạc của các loài nấm Aspergillus spp. trên môi trường nuôi cấy (PDA) 12 2.6 Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977) 14 2.7 Tỷ lệ ung thư gan trên 100.000 dân, (2002) 19 2.8 Sơ ñồ minh hoạ con ñường sinh tổng hợp ñộc tố Aflatoxin B 1 ở nấm A. flavus 27 4.1A Thu nhận mẫu nấm A. flavus từ các mẫu A: Lạc; B: Gạo trên môi trường PDA ñặc 39 4.1B Thu nhận mẫu nấm A. flavus từ các mẫu, A: Ngô; B: ðậu tương trên môi trường PDA ñặc 39 4.2 Hình ảnh thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A. flavus quan sát dưới kính hiển vi (×1600) 39 4.3 Hình ảnh nấm A. flavus ñược phân lập từ các mẫu gạo tại Hà Nội phát triển trên môi trường PDA (trái) và môi trường Czapek (phải) 41 4.4 Các chủng nấm ñược bảo quản trong dung dịch glycerol 50%, 4 0 C 41 4.5 Tốc ñộ phát triển của nấm A. flavus tại các ngưỡng nhiệt ñộ 20 0 C, 28 0 C, 30 0 C trên các nông sản sau, A: 4 ngày; B: 6 ngày nuôi cấy 43 4.6 Hình ảnh phát triển của nấm A. flavus ñược phân lập từ các mẫu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix Ngô tại Thanh Hóa; A: sau 2 ngày ; B: sau 4 ngày nuôi cấy; C: sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 43 4.7 Nuôi cấy nấm A. flavus trong môi trường PDA lỏng 47 4.8 Sợi nấm A. flavus ñã làm khô dùng làm nguyên liệu cho quá trình tách chiết ADN tổng số 47 4.9 Hình ảnh ñiện di ADN tổng số trên gel Agarose 1% của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu nông sản A: ðậu tương; B: Gạo 47 4.10 Sản phẩm PCR ñược nhân lên từ ADN tổng số các chủng A. flavus ñược phân lập từ các mẫu Gạo, phân tích trên gel Agarose 1% với các cặp mồi: A: mồi ver-1; B: mồi omt-1; C: mồi nor-1; D: mồi apa-2 nhân các ñoạn gen 50 4.11 Mật ñộ xuất hiện của ba, hai và một gen trong phản ứng PCR ñặc hiệu với các cặp mồi riêng rẽ, sử dụng khuôn là các mẫu ADN nấm A. flavus 53 4.12 Hình ảnh ñiện di sản phẩm khuyếch ñại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu ðậu tương trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 4: A. flavus Hà Nội ; 4 – 8: A. flavus Thanh Hoá; 9: ñối chứng A. niger chuẩn 54 4.13 Hình ảnh ñiện di sản phẩm khuyếch ñại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Ngô trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 11: A. flavus Thanh Hoá ; 12 – 15: A. flavus Hà Nội ; 16: ñối chứng A. niger chuẩn 54 4.14 Hình ảnh ñiện di sản phẩm khuyếch ñại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Gạo trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 5: A. flavus Sơn La ; 6 – 11 : A. flavus Hà Nội ; 12: ñối chứng A. niger chuẩn 54