4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả thu thập và phân lập nấm bệnh Aspergillus flavus từ một số nông sản ở Việt Nam
số nông sản ở Việt Nam
Tiến hành thu thập mẫu hạt của các loại nông sản: ngô, lạc, ñậu tương, gạo thu thập trong nhà dân, trên ñồng ruộng và trong kho bảo quản tại các tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Nội, Hải Dương và Sơn La.
Phương pháp thu nhận nấm: ñặt 5 – 6 hạt/ñĩa lên môi trường PDA hoặc môi trường Czapek ñặc (có bổ sung 100µg/ml tetracycline), chúng tôi ñã thu nhận ñược các chủng nấm A. flavus có các ñặc ñiểm màu sắc bào tử, vết loang của khuẩn lạc trên môi trường ñiển hình ñặc trưng cho loài, và hình ảnh quan sát bào tử, thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A. flavus dưới kính hiển vi [12,56].
Cụ thể, trên các mầm của hạt hoặc trên lớp vỏ hạt sau 3 – 5 ngày ñặt trên môi trường có xuất hiện lớp bào tử nấm có màu vàng lục hay màu xanh lục (hình 4.1A&4.1B). Khi quan sát hình ảnh ñặc trưng của chủng nấm A. flavus dưới kính hiển vi ở ñộ phóng ñại 1600 lần chúng tôi thấy phần ñầu sợi nấm có dạng bọng nhỏ, phía trên là nhiều cuống sinh bào tử dạng thể bình, xếp sát nhau, tỏa ñều như bông hoa cúc. Cuống sinh bào tử của chủng nấm A. flavus: thường không màu, chiều dài xấp xỉ 800 µm và chiều rộng khoảng 15 – 20 µm. Bào tử của chủng nấm A. flavus có dạng hình cầu hoặc hình ovan,
ñường kính bào tử 2 – 4 µm, bề mặt nhẵn (hình 4.2),
Sau khi xác ñịnh ñược ñúng các chủng A. flavus dựa vào các ñặc ñiểm trên, sẽ chọn lọc và cấy chuyển sang môi trường PDA/Czapek ñặc (có bổ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………39
A B
Hình 4.1A. Thu nhận mẫu nấm A. flavus từ các mẫu , A: Lạc; B: Gạo trên môi
trường PDA ñặc .
A B
Hình 4.1B. Thu nhận mẫu nấm A. flavus từ các mẫu, A: Ngô; B: ðậu tương trên môi trường PDA ñặc.
Hình 4.2: Hình ảnh thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A. flavus quan sát dưới kính hiển vi (×1600).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………40
Khi phân lập các sợi nấm A. flavus trên môi trường PDA và Czapek
ñặc, chúng tôi thấy có sự khác nhau cả về màu sắc và tốc ñộ phát triển khuẩn lạc. Cụ thể, trên môi trường PDA khuẩn lạc của nấm A. flavus phát triển tròn
ñều, có mầu xanh ñặc trưng, phần rìa ngoài của khuẩn lạc có mầu trắng biểu hiện mầu sắc của sợi nấm khi còn non, mặt sau có màu trắng xanh. Trên môi trường Czapek, khuẩn lạc của loài nấm này có mầu sắc từ xanh ñến vàng, mặt sau có màu sắc từ vàng ñến ñỏ nâu (hình 4.3). Sau khi quan sát tốc ñộ phát triển của nấm A. flavus trên cả hai loại môi trường này ta thấy: trên môi trường PDA tốc ñộ phát triển của nấm A. flavus nhanh hơn. Trên môi trường PDA, sau 6 – 7 ngày nuôi cấy ñường kính khuẩn lạc nấm có thểñạt 6 – 7 cm, trong khi ñó trên môi trường Czapek chỉ ñạt 3 – 4 cm và ñạt ñường kính 6 – 7 cm sau khoảng 9 – 10 ngày nuôi cấy. Vì vậy, khi sử dụng môi trường PDA
ñặc ñể phân lập nấm A. flavus có thể rút ngắn thời gian phân lập và cấy chuyển. Ngoài ra, môi trường PDA dễ chuẩn bị và chi phí thấp hơn, nên chúng tôi sử dụng môi trường PDA ñặc cho quá trình phân lập, làm thuần sợi nấm và môi trưởng PDA lỏng ñể nuôi sinh khối nấm phục vụ cho thí nghiệm tách chiết ADN tổng số ở phần sau. Kết quả, từ các mẫu nông sản ở các ñịa phương khác nhau chúng tôi ñã phân lập và làm thuần ñược 50 chủng nấm A. flavus (Bảng 4.1). Các chủng nấm thuần này ñược bảo quản trong dung dịch glycerol 50% ñã khử trùng (có bổ sung 100µg/ml tetracycline), ở 40C ñể phục vụ các thí nghiệm tiếp theo (Hình 4.4).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………41
Hình 4.3: Hình ảnh nấm A. flavusñược phân lập từ các mẫu gạo tại Hà Nội phát triển trên môi trường PDA (trái) và môi trường Czapek (phải).
Hình 4.4: Các chủng nấm ñược bảo quản trong dung dịch glycerol 50%, 40C.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………42
Bảng 4.1 Số lượng các chủng nấm A. flavus thuần thu ñược trên các nông sản tại các vùng khác nhau.