Hiện nay, các phòng thí nghiệm ñang sử dụng các phương pháp sắc ký
ñể phát hiện nấm Aspergillus sinh ñộc tố Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) [43]. Ưu ñiểm của phương pháp này là có thể ñịnh lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm. Tuy nhiên, phương pháp này lại có nhược ñiểm là cần phòng thí nghiệm ñược trang bị các máy chuyên dụng ñắt tiền.
* Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography-TLC)
Phương pháp sắc ký lớp mỏng ñược sử dụng rộng rãi ñể xác ñịnh, ñịnh lượng Aflatoxin lần ñầu tiên vào những năm 1960 (Coomes et al, 1964, 1965). Thủ tục phân tích sử dụng các bản ñược tráng bởi Silica gel. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là Chloroform: methanol và Chloroform: axeton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả
năng hòa tan Aflatoxin. Hệ dung môi gồm: nước: axeton: chloroform (1,5: 12: 88) ñược ñánh giá là có khả năng hòa tan Aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng ñã
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………23
ñược chảy qua các dung môi chạy, ñược ñưa vào chiếu bởi ñèn tử ngoại (UV) 365nm. Các vết mẫu phân tích có màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây và có ñộ dài Rtñược so sánh với các vết của Aflatoxin tiêu chuẩn. Nhược
ñiểm của phương pháp này là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của ñộc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả tới 20 – 30% [1, 43].
* Phương pháp ño mật ñộ huỳnh quang trên máy fluorodensitometer
Fluorodensitometer có nhiều tiến bộ hơn, chính xác hơn so với nhìn bằng mắt thường (Dons, 1968). Tuy nhiên, ở nhiều phòng thí nghiệm hiện ñại vẫn sử dụng phương pháp nhìn ñể so sánh trực tiếp các vết trên bản mỏng vì dễ
hơn nhiều khi phải qua máy densitometer [1]. Khẳng ñịnh sự có mặt của Aflatoxin của phương pháp này: một số chất ñược tách ra từ mẫu ñôi khi dễ
nhẫm lẫn với Aflatoxin, dẫn ñến sự khẳng ñịnh sai lệch. Phương pháp khẳng
ñịnh sự có mặt của Aflatoxin trực tiếp thực hiện trên các bản sắc ký. Dựa vào sự biến ñổi của Aflatoxin thành các ñồng phân có mầu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban ñầu, cả Aflatoxin chuẩn và Aflatoxin có trong mẫu phân tích ñều chuyển sang có cùng một ñồng phân. Thử nghiệm khẳng ñịnh sự có mặt của Aflatoxin trong mẫu phân tích ñược phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) và ñược hội phân tích hóa học Hoa Kỳ (A.O.A.C) công nhận. Aflatoxin B1 ñược axit hóa ñể trở thành ñồng phân Aflatoxin B2.
ðồng phân này có màu huỳnh quang màu xanh và có ñộ dài Rf thấp hơn so với ñộ dài của Rf của Aflatoxin B1. Theo phương pháp của Przybylski, Aflatoxin B1 ñược chuyển thành Aflatoxin B2a nhờ axit trifloaxetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng. Axit sulfuric 50% cũng ñược sử dụng ñể
phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trong các dung môi chạy. Axit sulfuric làm thay ñổi màu huỳnh quang xanh da trời của Aflatoxin B1 thành màu vàng. Thử nghiệm này nhằm khẳng ñịnh sự không có mặt của Aflatoxin
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………24
nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng [1].
* Sắc ký lớp mỏng hiệu suât cao (High performance thin layer chromatography – HPTLC)
Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc ký lớp mỏng ñơn thuần
ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: ðưa mẫu lên bản mỏng một cách tựñộng; cải thiện sựñồng nhất cả lớp hấp thụ; chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát.
Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp ñịnh lượng Aflatoxin có hiệu quả nhất.
* Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography – HPLC)
Hệ thống phân tích Aflatoxin tự ñộng HPLC là hệ thống phân tích ñắt tiền, chọn lọc, dùng xác ñịnh ñịnh lượng Aflatoxin. Phương pháp HPLC sử
dụng cả hai pha: pha bình thường và pha phản. Hệ thống này dựa trên sự hấp thu tia tím (UV) và xác ñịnh cường ñộ huỳnh quang. Trong pha bình thường, pha tĩnh là rắn, phân cực hơn pha ñộng. Trong pha phản, pha bình thường là pha phản pha, pha tĩnh là lỏng và ít phân cực hơn pha ñộng. Trong HPLC, pha phản ñược sử dụng ñể tách Aflatoxin nhiều hơn pha bình thường.