3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phương pháp thu nhận và phân lập nấm A.flavus từ một số nông sản
Sử dụng phương pháp thu nhận nấm: ñặt 5 – 6 hạt/ñĩa lên môi trường PDA hoặc môi trường Czapek (có bổ sung 100µg/ml kháng sinh tetracycline). Sau 3 – 5 ngày ñặt mẫu, chúng tôi bắt ñầu quan sát ñược nấm A. flavus mọc trên hạt và vỏ hạt. Dựa vào các ñặc ñiểm nhận dạng sợi nấm, vết loang ñể lại trên môi trường quan sát trên ñĩa petri và kết hợp quan sát hình dạng bào tử, cuống sinh bào tử, thể bình... trên kính hiển vi ởñộ phóng ñại 1600 lần, chúng tôi chọn lọc và cấy chuyển các mẫu nấm sang môi trường PDA/Czapek ñặc (có bổ sung 100µg/ml kháng sinh tetracycline), sau ñó tiến hành làm thuần sợi nấm.
Một số môi trường sử dụng trong nuôi cấy và phân lập nấm:
- Môi trường PDA (potato dextro agar) ñặc: thành phần cho 1 lít môi trường: 200g khoai tây, 30g ñường, 10g agar, pH 5.8 – 6.0.
- Môi trường PDA lỏng: thành phần như trên, không có agar.
- Môi trường Czapek ñặc : thành phần cho 1 lít môi trường : NaNO3: 3,0g ; K2HPO4: 1,0g ; MgSO4.7H20: 0,5g ; KCl: 0,5g ; FeSO4.7H20: 0,01g ;
ðường: 30g ; Agar: 10g ; pH 5.8 – 6.0.
3.2.2 Phương pháp làm thuần sợi nấm A. flavus
Chúng tôi sử dụng phương pháp ñơn giản ñể phân lập ñơn bào tử nấm trong nuôi cấy nấm thuần (phương pháp Single Spore) [48].
Cách thực hiện như sau: sau khi cấy nấm lên môi trường khoảng 2 – 4 ngày, dùng pipet lấy 1 µl dung dịch bào tử, pha trong nước muối sinh lý hoặc nước cất khử trùng (bào tử ñược pha loãng ñến nồng ñộ 10 bào tử/1µl), nhỏ
lên ñĩa Petri có môi trường PDA /Czapek ñặc. ðĩa Petri ñó ñược ñánh dấu bằng các ñường tròn ở mặt sau có ñường kính 0,5 cm, trung bình từ 50 – 100
ñường tròn/1 ñĩa, mỗi 1 µl dung dịch bào tử nhỏ vào một ñường tròn. Sau khi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………31
ñường tròn ñược ñếm (quan sát qua kính hiển vi). Từng bào tử trong mỗi
ñường tròn khi nảy mầm ñược cấy truyền sang môi trường mới và sẽ thu ñược nấm thuần. ðây là một trong những phương pháp dễ thực hiện ñể phân tách từng bào tử nấm riêng biệt trong việc nuôi cấy nấm thuần. Hơn nữa phương pháp này ñòi hỏi thời gian thực hiện cũng như thời gian ủ ngắn hơn các phương pháp khác.
Quá trình phân lập và phát triển ñược tiến hành cho ñến khi ñạt tới ñộ ñồng ñều về màu sắc và tốc ñộ phát triển của khuẩn lạc.