để tiện lợi hoá việc phát hiện nấm Aspergillus spp. sinh ựộc tố Aflatoxin, gần ựây phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR ựang ựược nghiên cứu áp dụng rộng rãi [40]. Ngoài tắnh tiện lợi và dễ sử dụng, phương pháp này còn có ưu
ựiểm là phát hiện nhanh, nhạy, chắnh xác nấm Aspergillus spp. sinh ựộc tố
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ26
quả nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus ssp. sinh ựộc tố Aflatoxin và con
ựường sinh tổng hợp Aflatoxin [15, 28]. Các nghiên cứu cho thấy, ắt nhất có 20 gen tham gia vào con ựường sinh tổng hợp Aflatoxin, trong ựó có 4 gen quan trọng là ver-1, omt-1, nor-1 và apa-2 ựã ựược công bố trình tự
nucleotide và chức năng gen. Trình tự nucleotide của các gen này là cơ sở ựể
sinh tổng hợp các cặp mồi ựặc hiệu cho phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là ADN tổng số tách chiết từ sợi nấm hoặc các mẫu xét nghiệm.
Chất ựầu tiên tham gia vào con ựường sinh tổng hợp Aflatoxin có nguồn gốc từ một polyketide, ngưng tụ các chất acetate ựể tạo thành axit norsoloric, tiếp ựó là sự biến ựổi norsolorinic axit (NOR)→ averantin (AVN)→ averufanin → averufin (AVF) → hydroxyversicolorone →
versiconal hemiacetal acetate → versicolorin B → versicolorin A (VA)→
sterigmatocystin (ST) → O Ờ methylsterigmatocystin (OMST) → Aflatoxin B1. Trong mắt xắch cuối của con ựường sinh tổng hợp enzym O Ờ methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyển hoá (ST) → (OMST) có liên quan tới sự sản sinh Aflatoxin. Gần ựây, chỉ mới một vài enzym trong con
ựường sinh tổng hợp này ựược phân lập [33, 53]. Cụ thể, ba gen cấu trúc trong con ựường sinh tổng hợp Aflatoxin của nấm A. paraciticus có liên quan
ựến sự biến ựổi của NOR và VA (nor-1 và ver-1), enzym O Ờ methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyển hoá (ST) → (OMST) (omt -1) ;
và một gen ựiều hoà của nấm A. flavus (afl-2) ựã ựược nhân dòng. Các gen này ựược chọn làm gen ựắch cho phản ứng PCR. Gen afl -2 ựược biết ựến như
một như một enzym bảo tồn hoạt ựộng của các enzym khác trong con ựường sinh tổng hợp Aflatoxin. Trong một số nghiên cứu cũng ựưa ra, gen apa-2 của chủng nấm A. parasiticus trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin, có mức ựộ
tương ựồng về ADN rất lớn với gen afl-2 của nấm A. flavus [33, 34].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ27
trưởng và phát triển của nấm Aspergillus. điều này dẫn ựến hàm lượng và tỷ
lệ nhiễm Aflatoxin trên nông sản Việt Nam là ở mức cao trong khu vực và
ựây là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn ựến giá trị nông sản xuất khẩu của Việt nam rất thấp. Thực tế thì ựã có nhiều lô hàng nông sản xuất khẩu của nước ta như: lạc, ựậu tương... ựã bị trả lại do phát hiện ựộ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các phương pháp chẩn ựoán sớm nấm Aspergillus sinh ựộc tố Aflatoxin có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu tác hại của nấm. Hiện tại, ở Việt nam chúng ta vẫn ựang sử dụng phương pháp truyền thống ựể chẩn ựoán nấm Aspergillus sinh ựộc tố Aflatoxin nên mới chỉ phát hiện ựược chủng nấm A. flavus.
Hình 2.8. Sơựồ minh hoạ con ựường sinh tổng hợp ựộc tốAflatoxin B1 ở nấm A. flavus
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ28
Việc phát hiện mầm bệnh nấm A. flavus sinh ựộc tố Aflatoxin bằng kỹ
thuật PCR chưa ựược nghiên cứu ở Việt nam. Từ năm 2007, Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp ựã tiến hành thu thập và phân lập chủng nấm bệnh A. flavus trên một số nông sản (ngô, lạc, ựậu tương, gạo), nuôi cấy thu sinh khối và tối ưu hóa quy trình tách chiết ADN tổng số
của nấm A. flavus. đã xác ựịnh ựược các ựiều kiện cho phản ứng PCR ựặc hiệu sử dụng các cặp mồi riêng rẽnor-1, omt-1, ver -1, apa -2 (do gen afl Ờ 2
của nấm A. flavus có mức ựộ tương ựồng rất lớn với gen apa - 2 của nấm A. parasiticus), và phản ứng Multiplex PCR (dùng cả 4 cặp mồi), có thể nhận ra
ựược chủng nấm có mang gen mã hóa trong quá trình tổng hợp ựộc tố
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ29