4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.5 Kết quả phân tích bằng phản ứng Multiplex PCR với cả 4 cặp mồ
ver – 1 , omt – 1 , nor – 1 và apa – 2.
Với mẫu ADN của 50 chủng nấm A. flavusđược sử dụng làm khuơn cho các phản ứng Multiplex PCR sử dụng đồng thời cả 4 cặp mồi trên. Phản ứng Multiplex PCR được thiết lập với 35 chu kỳ như sau: biến tính 1 phút ở 940C ; gắn mồi 2 phút ở 600C và kéo dài sợi 2 phút ở 720C. Phản ứng được duy trì thêm 7 phút ở 720C để các phản ứng được hồn thành, sau đĩ được giữ ở 40C trước khi điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Thành phần phản ứng Multiplex PCR: Phản ứng 20µl gồm cĩ: 8µl H2O, 2µl buffer, 4µl dNTPs (2mM), 2µl Taq pol, 2µl ADN khuơn (50ng/µl), 2µl mồi (20pmol/µl). Thành phần phản ứng
được bổ sung betaine và dimethyl sulfoxide (DMSO) nhằm làm tăng hiệu quả
phản ứng PCR. Kết quả phản ứng Multiplex PCR với 50 chủng nấm A. flavus
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………54
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
Hình 4.12. Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu ðậu tương trên gel agarose 1%
M: marker; 1 – 4: A. flavus Hà Nội ; 4 – 8: A. flavus Thanh Hố; 9: đối chứng A. niger chuẩn flavus Thanh Hố; 9: đối chứng A. niger chuẩn
Hình 4.13. Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch
đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus
phân lập từ các mẫu Ngơ trên gel agarose 1%:
M: marker; 1 – 11: A. flavus Thanh Hố ; 12 – 15: A. flavus Hà Nội ; 16: đối chứng A. niger 15: A. flavus Hà Nội ; 16: đối chứng A. niger
chuẩn
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
Hình 4.14. Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Gạo trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 5: A. flavus Sơn La ; 6 – 11 : A. flavus Hà Nội ; 12: đối chứng A. niger chuẩn
Hình 4.15. Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch
đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus
phân lập từ các mẫu Lạc trên gel agarose 1%:
M: marker; 1 – 5: A. flavus Nghệ An ; 6 – 10: A. flavus Hà Nội ; 11 – 14: A. flavus Hải Dương; flavus Hà Nội ; 11 – 14: A. flavus Hải Dương; 16: đối chứng A. niger chuẩn
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………55
Bảng 4.7 Tổng hợp kết quả phản ứng Multiplex PCR với các mẫu nấm
Aspergillus flavus sử dụng cả 4 cặp mồi: Ver - 1 , Omt - 1, Nor – 1 và Apa - 2.
Chủng Apa - 2 Nor - 1 Ver - 1 Omt - 1 Chủng Apa - 2 Nor - 1 Ver - 1 Omt - 1
G1 + + + + G7 + + + - G2 + + + + G8 + + - - G3 + + + + G9 + + - + G4 + + + + G10 + + + + G5 + + + + G11 + + + + G6 + + - - G12 + + - - D1 + + + + D5 + + + + D2 + + + - D6 - + - - D3 + + - - D7 + + + + D4 - + - - D8 + + + + N1 + + + + N9 - + - - N2 + + + + N10 + + + + N3 + + - - N11 - + + + N4 + + + + N12 + + + + N5 + + + + N13 + + + + N6 + + + + N14 + + + + N7 + + + - N15 + + + - N8 + + + - N16 + + + + L1 + + - - L8 + + - - L2 + + + + L9 + + - + L3 + + + + L10 + + - - L4 + + + + L11 + + - - L5 + + - - L12 + + + - L6 + + + + L13 + + + - L7 + + - - L14 + + - +
Ghi chú: +: Chủng nấm cĩ lên băng; -: Chủng nấm khơng lên băng
Quan sát số liệu ở bảng 4.7 ta thấy trong phản ứng PCR đặc hiệu với từng mồi riêng rẽ thì tần số xuất hiện của gen nor – 1 là nhiều nhất trong số 4 gen , cĩ tới 50/50 chủng nấm lên băng với mồi nor – 1 (100%) . Tiếp theo đĩ tương ứng là gen apa – 2: 46/50 (92%) và gen ver – 1: 33/50 (66%) và tỉ lệ
thấp nhất thu nhận được là của gen omt – 1: 29/50(58%) (ở phản ứng PCR
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………56
xuất hiện của từng gen, chúng ta xem xét tần số bắt cặp của các gen trong phản ứng Multiplex PCR.
Bảng 4.8 Tần số bắt cặp của các cặp mồi trong phản ứng Multiplex PCR. apa-2 nor-1 ver-1 omt-1 Số chủng % % tổng số theo nhĩm
+ + + + 25 50 50 + + + - 7 14 + + - + 3 6 + - + + 0 0 - + + + 1 2 22 - - + + 0 0 - + + - 0 0 + + - - 11 22 + - - + 0 0 + - + - 0 0 - + - + 0 0 22 + - - - 0 0 - + - - 3 6 - - + - 0 0 - - - + 0 0 6 Tổng số 50 100 100 Từ kết quả của bảng 4.8 ta thấy: Tần số xuất hiện các tổ hợp gen được nhân lên trong phản ứng Multiplex PCR với cả 4 cặp mồi đặc hiệu apa-2, nor-1, ver-1 và omt-1 là 50%; tần số xuất hiện các tổ hợp gen với 3 cặp mồi
đặc hiệu (4 trường hợp) là 22% trong đĩ sự xuất hiện của 3 cặp gen (apa -2, nor -1, ver -1) là nhiều nhất chiếm 14%; với 2 cặp gen (6 trường hợp) cũng là 22% trong đĩ chỉ cĩ sự bắt cặp duy nhất của hai cặp gen (apa -2, nor -1); với từng gen riêng rẽ (4 trường hợp) là 6% nhưng chỉ cĩ duy nhất sự xuất hiện của gen nor -1 (hình 4.16).
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………57 50% 14% 6% 0%2% 22% 0% 0% 0% 0%0% 0% 6% 0% 0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% omt-1 ver-1 nor-1 apa-2 ver-1, omt-1 nor-1, omt-1 nor-1, ver-1 apa-2, omt-1 apa-2, ver-1 apa-2, nor-1 nor-1, ver-1, omt-1 apa-2, ver-1, omt-1 apa-2, nor-1, omt-1 apa-2, nor-1, ver-1 apa-2, nor-1, ver-1, omt-1
Hình 4.16 Tần số xuất hiện các tổ hợp gen được nhân lên trong phản ứng Multiplex PCR với cả 4 cặp mồi nor-1, ver-1, omt-1 và apa-2.
Từ bảng 4.7 và hình 4.16 ta thấy, số chủng A. flavus cho kết quả dương tính đồng thời với cả 4 cặp mồi đặc hiệu là chiếm tỉ lệ cao (50%). Nếu tính cả
các chủng cho kết quả dương tính với 3 cặp mồi đặc hiệu nĩi trên trở lên thì tỉ
lệđĩ là 72%. ðây là các mẫu đặc biệt được chú ý, vì với sự xuất hiện đồng thời của 3 đến 4 gen đặc hiệu omt - 1, nor-1, ver-1 và apa -2 thì khả năng sinh độc tố của các chủng đĩ là rất lớn. ðặc biệt chú ý là khi thực hiện phản ứng Multiplex PCR với 50 mẫu nĩi trên, kết quả khuếch đại 4 gen trên là tốt hơn so với việc thực hiện riêng rẽ với từng mồi (phản ứng Multiplex kết quả khuyếch
đại 4 gen chiếm 50%, trong khi đĩ phản ứng PCR đặc hiệu là 42%). ðiều đĩ cho thấy, việc áp dụng phản ứng Multiplex PCR cho việc nhân nhanh và phát hiện sự cĩ mặt của 4 gen nĩi trên và các gen khác nĩi chung trong con đường sinh tổng hợp độc tố Aflatoxin là thuận tiện, nhanh chĩng và cho kết quả tốt.
So sánh giữa kết quả thực hiện phản ứng PCR với từng mồi đặc hiệu riêng rẽ và kết quả phản ứng Multiplex PCR cho thấy, sự lặp lại kết quả nhân lên của các đoạn gen đặc hiệu nĩi trên ở mức độ tương đối cao. Trong 50 mẫu
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………58
4 gen (trùng lặp 100%) là đạt 19 mẫu, chiếm 38%; tỉ lệ trùng lặp 3 băng trở
lên là 30/50 mẫu, chiếm 60%.
Một lần nữa, chúng tơi khẳng định việc tối ưu thành cơng phản ứng Multiplex PCR sử dụng 4 cặp mồi đặc hiệu nor-1, ver-1, omt-1 và apa-2
trong việc phát hiện nhanh và chính xác sự cĩ mặt của 4 gen nĩi trên, đồng thời dựđốn khả năng sinh độc tố Aflatoxin của các chủng nấm A. flavus phân lập từ
các loại nơng sản tại các địa điểm khác nhau.