4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.6.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng ((Thin layer chromatography) – TLC
Ngoài ra, chúng tôi còn sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) nhằm phát hiện ñộc tố Aflatoxin và ñánh giá khả năng sinh ñộc tố của 50 chủng nấm A. flavus ñược phân lập ở trên.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………62
theo phương pháp sau: bổ sung 1 lần thể tích chloroform vào ñĩa nấm (hoặc bình môi trường lỏng nuôi nấm) sau ñó hút chuyển sang ống falcol 50ml. Lắc
ở nhiệt ñộ phòng trong 8 giờ. Ly tâm, hút phần chloroform sang ống mới, sau
ñó ñể khô (chú ý ñể trong box sử dụng cho các chất ñộc hại, có thể dùng phương pháp hút chân không cho kết quả nhanh hơn). Phần tủa thu ñược sau
ñó ñược hòa tan trong 10 – 20 µl chloroform, sau ñó ñược chấm lên bản sắc ký lớp mỏng (TLC). ðể bản sắc ký khoảng 10 phút ở ñiều kiện bình thường cho khô mẫu, sau ñó ñược cho vào bình kín có nút nhám (ñựng pha ñộng). Pha ñộng trong thí nghiệm chạy sắc ký TLC nhằm phát hiện ñộc tố Aflatoxin bao gồm toluel: ethylacetate: aceticacid pha theo tỉ lệ tương ứng 50:30:4 theo thể tích. Bản sắc ký ñược lấy ra và ñể khô, sau ñó quan sát dưới ñèn UV (bước sóng 365-366 nm).
Những mẫu nào có phát hiện ñộc tố Aflatoxin sẽ thể hiện ở dạng vệt mầu xanh lơ. Chúng tôi sử dụng Aflatoxin tổng số làm ñối chứng dương ñể so sánh và phát hiện sự có mặt của ñộc tố Aflatoxin (hình 4.19)
Hình 4.19: Hình ảnh quan sát ñộc tố Aflatoxin trên bản sắc ký lớp mỏng TLC dưới
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………63
Bảng 4.10: So sánh kết quả phương pháp Multiplex PCR và phương pháp sắc ký lớp mỏng ñể phát hiện chủng nấm A. flavus sinh ñộc tố
Aflatoxin Chủng Sắc ký lớp mỏng Multiple PCR Chủng Sắc ký lớp mỏng Multiplex PCR G1 + A G7 + - G2 ++ A G8 + - G3 + A G9 + - G4 ++ A G10 ++ A G5 + A G11 + A G6 __ - G12 + - D1 + A D5 ++ A D2 + - D6 __ - D3 + - D7 ++ A D4 __ - D8 ++ A N1 ++ A N9 __ - N2 ++ A N10 ++ A N3 __ - N11 + - N4 ++ A N12 ++ A N5 ++ A N13 ++ A N6 ++ A N14 ++ A N7 + - N15 + - N8 + - N16 ++ A L1 + - L8 __ - L2 + A L9 + - L3 ++ A L10 __ - L4 + A L11 __ - L5 + - L12 + - L6 + A L13 + - L7 __ - L14 + -
Chú thích: TLC: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography).
++: chủng sinh nhiều ñộc tố; +: chủng sinh ñộc tố ít hoặc ở dạng vết; __: chủng không sinh ñộc tố. A: những chủng trong phản ứng Multiplex PCR lên cả 4 băng; -: những chủng không lên ñủ 4 băng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………64
Theo bảng 4.10 sau khi tiến hành phân tích ñộc tố Aflatoxin của 50 chủng nấm sinh ra trên bản mỏng sắc ký, chúng tôi thu ñược kết quả với 3 mức ñộ khác nhau: sinh nhiều ñộc tố (++) có 17 chủng (34%); sinh ñộc tố ít hoặc ở dạng vết (+) có 24 chủng (48%); và 9 chủng không sinh ñộc tố (-) (18%). So sánh với bảng 4.7 và 4.8 về kết quả phản ứng Multiplex PCR, chúng tôi nhận thấy khi phân tích 25 chủng có kết quả khuyếch ñại với cả 4 gen (apa-2, nor-1, ver-1 và omt-1) trong phản ứng: có 17 chủng phát hiện dấu vết ñộc tố Aflatoxin nhiều (++), 8 chủng có dạng vết (+). Như vậy, có tới 25/25 chủng nấm có dấu vết sinh ñộc tố Aflatoxin và có kết quả dương tính với phản ứng Multiplex PCR ñồng thời với 4 cặp mồi (chiếm 100%), không có bất kỳ trường hợp ở phản ứng Multiplex PCR không khuyếch ñại ñủ cả 4 gen nhưng phát hiện có dấu vết sinh nhiều ñộc tố Aflatoxin (++), mà chỉ có một vài trường hợp là có sinh ñộc tố Aflatoxin (+).
Từ kết quả bảng 4.7 và 4.8, nhận thấy với 11 chủng cho kết quả dương tính với 3 cặp mồi ñặc hiệu trong phản ứng Multiplex PCR (D2, N7, N8, G7, G9, N11, N15, L9, L12, L13, L14), cả 11 chủng ñó ñều phát hiện ñược dấu vết ñộc tố Aflatoxin trong thí nghiệm chạy sắc ký lớp mỏng (+), ñồng thời các chủng ñó ñều có mầu vàng nhạt khi nuôi trên môi trường nước dừa. Tuy vậy, vẫn có 5 chủng chỉ xuất hiện một hoặc hai băng ñặc hiệu trong phản ứng Multiplex PCR nhưng vẫn phát hiện ñược dấu vết ñộc tố Aflatoxin. Kết quả ñó cho phép chúng tôi khẳng ñịnh với các chủng A. flavus mà cho kết quả
dương tính với cả 4 mồi omt-1, nor-1, ver-1 và apa-2 trong phản ứng Multiplex PCR thì khả năng rất lớn là sẽ sinh ñộc tố Aflatoxin.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………65