3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
5'-TAT CTC CCC CCG GGC ATC TCC CGG-3'
5'-CCG TCA GAC AGC CAC TGG ACA CGG-3' ~1400 bp
Tên và trình tự của các cặp mồi sử dụng
3.2.7.2 Phản ứng PCR ñặc hiệu
Nguyên tắc của PCR là sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt (Taq DNA polymerase) ñể tổng hợp các ñoạn ADN mới từ mạch khuôn trong môi trường có dNTPs và cặp mồi ñặc hiệu. Các ñoạn ADN mới ñược tạo thành lại ñược sử dụng làm khuôn. Sau nhiều chu kỳ, số lượng ñoạn ADN khuôn lại tăng lên hàng nhiều triệu bản.
Từ các mẫu ADN tổng số, thu ñược từ loài A. flavus chúng tôi tiến hành tối ưu hóa ñiều kiện phản ứng PCR với từng cặp mồi riêng rẽ (Ver-1, Omt-1, Nor-1, và Apa-2). Phản ứng PCR ñặc hiệu bằng máy nhân gen Applied Biosystems 9700 trong 35 chu kỳ với chương trình nhiệt ñược thiết lập:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………35 - Mồi Ver – 1 và Nor – 1: 94oC – 1 phút 94oC – 5 phút 55oC – 1 phút x 35 chu kỳ 72oC – 7 phút 4oC – ∞ 72oC – 1 phút - Mồi Omt – 1: 94oC – 1 phút 94oC – 5 phút 56oC – 1 phút x 35 chu kỳ 72oC – 7 phút 4oC – ∞ 72oC – 1 phút - Mồi Apa – 2: 94oC – 1 phút 94oC – 5 phút 58oC – 1 phút x 35 chu kỳ 72oC – 7 phút 4oC – ∞ 72oC – 1 phút Phản ứng PCR ñặc hiệu ñược thực hiện với tổng thể tích 20µl bao gồm các thành phần tỷ lệ như sau: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) ddH2O 8,5 50ng/ µl ADN khuôn 1 10x Taq buffer 2 5u/ µl Taq polymerase 1 2mM dNTPs 1,5
MgCl2 2
Primer F (10pmol) 2 Primer R(10pmol) 2
Tổng thể tích 20 µl
Các phân ñoạn sản phẩm PCR ñược ñiện di kiểm tra gel agarose 1% và ghi nhận hình ảnh bằng máy ảnh Canon EOS 40D.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………36
3.2.7.3 Phản ứng Multiplex PCR
Nguyên tắc phản ứng: Phản ứng Multiplex PCR là một dạng thay ñổi của phản ứng PCR thông thường, ở ñó hai hoặc hơn hai locus ñược nhân lên
ñồng thời trong cùng một phản ứng. Việc kết hợp nhiều mồi trong các hỗn hợp phản ứng khác nhau và nhân lên ñồng thời nhiều locus ñòi hỏi sự thay
ñổi, tối ưu các thông số của phản ứng.
Phản ứng Multiplex PCR bằng máy nhân gen Applied Biosystems 9700 trong 35 chu kỳ với chương trình nhiệt ñược thiết lập:
94oC – 1 phút
94oC – 5 phút 60oC – 2 phút x 35 chu kỳ 72oC – 7 phút 4oC – ∞
72oC – 2 phút
Phản ứng Multiplex PCR ñược thực hiện với tổng thể tích 20µl bao gồm các thành phần tỷ lệ như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
ddH2O 8
50ng/ µl ADN khuôn 2 10x Taq buffer 2 5u/ µl Taq polymerase 2
2mM dNTPs 4
Primer (10pmol) 2
Tổng thể tích 20 µl