3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.4 Phương pháp tách chiết ADNt ổng số.
Các mẫu nấm sau khi phân lập và làm thuần, tiếp tục nuôi cấy trong môi trường PDA lỏng từ 5 -7 ngày, ở 280C ñể thu sinh khối. Dùng giấy lọc khử trùng và máy hút ñể làm khô sợi nấm. Rửa sợi nấm 2 – 3 lần bằng nước sạch khử trùng ñể loại bỏ môi trường tồn dư. Các mẫu nấm ñược giữ trong tủ
lạnh sâu -800C làm nguyên liệu tách chiết ADN tổng số.
Sau khi khảo sát một số quy trình tách chiết ADN tổng sốở nấm men, nấm sợi cũng như các loại nấm Aspergillusñược công bố [59], chúng tôi chọn phương pháp tách chiết dựa theo quy trình của Aga et al (2003).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………32
Quy trình tách chiết của Aga et al. (2003) gồm các bước sau:
- Bước 1: Lấy khoảng 300mg mẫu nấm (ñã nghiền với nitơ lỏng thành dạng bột mịn) cho vào ống eppendorf 2ml.
- Bước 2: Thêm 750µl extraction buffer (0,1M Tris-Cl, pH=8; 50mM EDTA; 500mM NaCl; chuẩn pH tới 7,5) và 100µl 10% SDS.
- Bước 3: Ủ 20 phút ở 65oC, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho ñều.
- Bước 4: Thêm 250 µl 5M KAC, lắc ñều lên. Sau ñó ủ trong ñá ít nhất 30 phút. Ly tâm với tốc ñộ 14000 vòng/phút trong 15 phút.
- Bước 5: Thu lấy phần dịch nổi phía trên cho vào ống eppendorf mới thêm vào ñó một thể tích isopropanol bằng thể tích dịch phía trên, lắc nhẹ.
- Bước 6: Ly tâm với tốc ñộ 14000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bước 7: Bỏ pha lỏng phía trên, thêm vào 250 µl TE ñể hoà tan kết tủa ADN. - Bước 8: Thêm vào 250 µl dung dịch ñệm CTAB (0,2M Tris , pH=7,5; 0,05M EDTA; 2M NaCl; 2% CTAB).
- Bước 9: Ủở 65oC trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ.
- Bước 10: Thêm một lượng chloroform/isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) bằng lượng dịch có trong eppendorf.
- Bước 11: Ly tâm với tốc ñộ 14000 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch trên sang ống mới. Sau ñó lại lập lại thêm một lượng chloroform/isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) bằng lượng dịch có trong eppendorf, ly tâm với tốc ñộ
14000 vòng/phút trong 5 phút, hút phần dịch trên sang ống mới.
- Bước 12: Thêm một lượng isopropanol bằng thể tích dịch hút ra. - Bước 13: Ly tâm với tốc ñộ 14000 vòng/phút trong 15 phút. - Bước 14: Thu tủa và ñể khô tủa ADN.
- Bước 15: Hoà tan ADN trong 100 µl nước hoặc TE, thêm 2,5 µl RNAse 1mg/ml 30 phút trong tủ 370
ñể khử ARN.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………33
phương pháp ñiện di trên gel agarose 1% và ño quang phổ hấp thụ
(OD260/280nm) ñể kiểm tra hàm lượng và chất lượng ADN tổng số thu ñược. Các mẫu ADN tổng số sau ñó ñược chúng tôi pha loãng về nồng ñộ 50 ng/µl
ñể làm khuôn cho các phản ứng PCR ñặc hiệu.