Sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện vi khuẩn vibrio anguillarum trên một loài thủy sản nuôi của việt nam

Luận văn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Tất cả các số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng ñược công bố trên bất kỳ các công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan các thông tin, số liệu trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc và ñược sự ñồng ý của các tác giả. Học viên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii 1 LỜI CẢM ƠN Trong suốt hai năm học tập khoá Cao học 7 ngành nuôi trồng thuỷ sản, tôi ñã thu nhận ñược nhiều kiến thức bổ ích cả về lý thuyết và thực hành từ các Thầy cô giáo. Nhân sự kiện ñánh dấu kết quả học tập của mình bằng quyển Luận văn này, tôi xin gửi tới các Thầy cô lời cảm ơn và lời chúc tốt ñẹp nhất. ðể hoàn thành ñề tài tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ của các Thầy cô, nhà khoa học và ủng hộ của ñồng nghiệp và bạn bè. Với lòng biết ơn chân thành nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Tiến sĩ Nguyễn Chí Thuận, người Thầy ñã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp này. Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Uyên và tập thể nhà khoa học Phòng Công nghệ Enzym-Viện Công nghệ sinh học ñã tạo ñiều kiện, giúp ñỡ tôi hoàn thành ñợt thực tập tốt nghiệp. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn ñến Ban Lãnh ñạo Vụ Khoa học Công nghệ- Bộ Thuỷ sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1, ðại học Nông nghiệp I, Dự án FIBOZOPA ñã ủng hộ và tạo ñiều kiện cho tôi tham gia khóa ñào tạo Cao học. Nhân ñây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ñến cán bộ phòng Hợp tác quốc tế- ðào tạo, ñồng nghiệp, gia ñình và bạn bè ñã giúp ñở, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Nguyễn ðức Cường Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii 2 BẢNG KÝ HIỆU CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic APW Alkaline Pepton Water ATCC American Type Culture Colletion A, T, G, C Adenin, Thyamine, Guanine, Cytoxine bp base pair EDTA Disodium ethylenediamine tetraacetae EmpA kb Metalloprotease kilo base kDa kilo Dalton PCR Polymerase chain reaction TAE Tris acid EDTA TCBS Thiosulfate citrate bile salt sucrose VAM Vibrio anguillarum Medium V.anguillarum Vibrio anguillarum V.harveyi Vibrio harveyi Ncbi National Center of Biotechnology Information Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 3 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1-1 Tần số bắt gặp V. anguillarum trên ốc hương, sò huyết .8 Bảng 1-2 Kết quả xác ñịnh gen Va-toxR ở nhiều loài vi khuẩn Vibrio, E. coli và các loài khác phân lập từ cá gây bệnh [48] 18 Bảng 1-3 Thành phần phản ứng PCR .24 Hình 1-4 Các bước thực hiện phản ứng PCR một chu kỳ .25 Bảng 3-1 Danh mục vi khuẩn, nguồn và ñịa ñiểm thu nhận .38 Bảng 3-2 Kết quả phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS ,VAM .40 Bảng 3-3: Thành phần phản ứng PCR 43 Bảng 3-4 Kết quả ñịnh danh bằng phương pháp PCR 52 Bảng 3-5 Kết quả kiểm tra API 20E Vibrio sp 54 Bảng 3-6 Kết quả so sánh phương pháp PCR và API 20E xác ñịnh V.anguillarum .54 Bảng 3-7 Thành phần phản ứng PCR (25 µ µµ µl.) .56 Bảng 3-8 Hoạt tính enzym của các chủng V. anguillarum, V. harveyi…… 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1-1. Hình thái của V. anguillarum chụp qua kính hiển vi ñiện tử .12 Hình1-2 Bản ñồ Gen homolysin của V.anguillarum và V. cholerae .19 Hình 1-3- Phản ứng khuếch ñại PCR 24 Hình 1-4- Các bước thực hiện phản ứng PCR một chu kỳ………………… 25 Hình 3-1 Bệnh phẩm một số loài hải sản thu ñược .39 Hình 3-2: Khuẩn lạc V.anguillarum trên môi trường TCBS 41 Hình 3-3 Khuẩn lạc của HW 72 trên môi trường VAM .41 Hình 3-4 Khuẩn lạc của chủng (Va5) trên môi trường VAM .41 Hình 3-5 : Khuẩn lạc V.anguillarum trên VAM 41 Hình 3-6: Khuẩn lạc của chủng V.anguillarum trên TCBS .41 Hình 3-7: Khuẩn lạc của chủng (Va7) trên môi trường VAM 41 Hình 3-8: ADN tổng số của các chủng chuẩn .43 Hình 3-9 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng chuẩn .45 Hình 3-10 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng phân lập từ mẫu tôm .46 Hình 3-11 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng phân lập từ mẫu cá .46 Hình 3-12 Sản phẩm PCR gen empA làm sạch .47 Hình 3-13 Sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi chuẩn .50 Hình 3-14 Sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi .51 Hình 3-15 Sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi 51 Hình 3-16 Kết quả kiểm tra API 20E chủng Va3 (2), HW72 (3) và VIB 395(1) .53 Hình 3-17 Sản phẩm khuếch ñại trên gel agarose 1,5% trong ñệm TAE 1X.57 Hình 3-18 Hoạt hoạt tính enzym của V.anguillarum…………………………58 Hình 3-19 Hoạt hoạt tính enzym của V.harveyi……….………………………59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii BẢNG KÝ HIỆU CÁC TỪ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v MỤC LỤC 1 MỞ ðẦU .3 1. CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 6 1.1.1. Trong nước .6 1.1.2. Ngoài nước .9 1.2. Tổng quan chung về Vibrionaceae 10 1.3. Tổng quan Vibrio anguillarum 11 1.3.1. Bệnh lý ở tôm, cá do V.anguillarum gây ra 11 1.3.2. ðặc ñiểm, hình thái, phân loại 12 1.3.3. ðặc ñiểm sinh lí, sinh hoá, sinh trưởng .13 1.3.4. Hoạt tính enzym và ñộc tố 14 1.3.5. Gen mã hoá protein của Vibrio anguillarum .16 1.4. Phương pháp phát hiện Vibrio anguillarum .20 1.4.1. Phương pháp vi sinh vật học .20 1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử 21 1.5. Kỹ thuật PCR khuếch ñại gen và ứng dụng .23 1.5.1. Nguyên lý và kỹ thuật PCR 23 1.5.2. Ý nghĩa và ứng dụng của phương pháp PCR 26 1.5.3. Phương pháp xác ñịnh trình tự nucleotit: 27 2. CHƯƠNG II ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1 ðối tượng, thời gian và ñịa ñiểm tiến hành nghiên cứu .28 2.1.1 ðịa ñiểm nghiên cứu: .28 2.1.2 ðối tượng nghiên cứu .28 2.1.3 Thời gian nghiên cứu: 28 2.2 Vật liệu nghiên cứu 28 2.2.1 Chủng giống vi khuẩn dùng trong nghiên cứu 28 2.2.2 Môi trường nuôi cấy .29 2.2.3 Môi trường xác ñịnh hoạt tính enzym .30 2.2.4 Hoá chất phân tích 31 2.2.5 Thiết bị sử dụng: 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 31 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 2.3.1 Phương pháp phân lập V.anguillarum trên môi trường ñặc trưng 31 2.3.2 Phương pháp ñịnh danh Vibrio anguillarum bằng bộ kit API 20E (bioMérieus) 32 2.3.3 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính enzym của vi khuẩn .32 2.3.4 Phương pháp tách chiết ADN tổng số .33 2.3.5 Phương pháp PCR khuếch ñại gen 34 2.3.6 Phương pháp ñiện di ADN trên gel agrose .34 2.3.7 Phương pháp xác ñịnh trình tự nucleotit .35 2.3.8 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu .35 3. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .37 3.1 Kết quả thu mẫu, phân lập Vibrio anguillarum trên một số loại hải sản nuôi 37 3.1.1 Kết quả thu mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn 37 3.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn trên môi trường ñặc trưng .40 3.2 Kết quả nghiên cứu xác ñịnh V.anguillarum bằng phương pháp sinh học phân tử .42 3.2.1 Kết quả nghiên cứu khuếch ñại ñoạn gen empA của Vibrio anguillarum 42 3.2.2 Kết quả nghiên cứu giải trình tự và phân tích gen empA của V. anguillarum 46 3.2.3 Kết quả PCR khuếch ñại gen luxA 49 3.2.4 Kết quả so sánh phương pháp PCR và kit API-20E xác ñịnh V.anguillarum và V. harveyi .53 3.2.5 Quy trình xác ñịnh vi khuẩn V anguillarum bằng kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) .55 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính enzym của các chủng Vibrio.sp. .57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 3 4 MỞ ðẦU Trong những năm gần ñây, hoạt ñộng nuôi trồng thuỷ sản ngày càng phát triển mạnh mẽ tạo công ăn việc làm và thu ñược ngoại tệ cao cho ñất nước. Kim ngạch xuất khẩu năm 2006 ñạt 3,31 tỷ USD, trong ñó các mặt hàng thuỷ sản nuôi nước lợ và nước mặn chiếm > 55% (Báo cáo tổng kết năm 2005 và 2006 của Bộ Thuỷ sản). Nuôi thuỷ sản nước mặn, lợ và các vấn ñề về bệnh của chúng ñược nhiều người quan tâm và ñây cũng là một trong những nội dung hàng ñầu trong chiến lược phát triển của ngành thuỷ sản. ði cùng với sự phát triển của nghề nuôi trồng thuỷ sản, dịch bệnh trên các ñối tượng nuôi và ñặc biệt là các ñối tượng nuôi lợ, mặn ñã và ñang gây ra những thiệt hại nghiêm trọng. Trên các ñối tượng nuôi thủy sản nước lợ và nước mặn, bệnh do vi khuẩn chủ yếu gây ra bởi nhóm vi khuẩn Vibrio. Trong ñó, vi khuẩn Vibrio anguillarum là tác nhân gây nên các bệnh nguy hiểm: nhiễm khuẩn máu ở cá biển, bệnh trên ấu trùng nhuyễn thể, ăn mòn vỏ ở giáp xác, Ở Việt Nam ñã phát hiện ñược V.anguillarum trên nhiều ñối tượng nuôi trồng thủy sản như tôm sú, ốc hương, cá song, cá giò và một số loài cá biển khác [6], [7], [3], [13]. Do vậy cần có các phương pháp chẩn ñoán có thể phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ñể có biện pháp khắc phục kịp thời nhằm hạn chế thấp nhất thiệt hại cho thuỷ sản do dịch bệnh gây ra. Các phương pháp chẩn ñoán truyền thống như quan sát dấu hiệu bệnh lý, phân lập vi sinh kinh ñiển, mô bệnh học, soi kính hiển vi và thường cho kết quả ở giai ñoạn ñã phát bệnh nên ít có hiệu quả ñể phòng bệnh. Trong lĩnh vực chẩn ñoán bệnh các nhà nghiên cứu thường hướng tới việc xác ñịnh các gen ñặc hiệu (gen ñộc tố, gen mã hóa protein cấu trúc ) ñể thiết kế mẫu dò (gen probe) phát hiện các chủng gây Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 4 bệnh bằng kỹ thuật lai ADN, PCR [9], [11], [4], [8], [12]. Với ưu ñiểm có ñộ nhạy cao, chính xác ñặc hiệu, có khả năng phân tích mẫu với thời gian phân tích ngắn. Các phương pháp chẩn ñoán bệnh dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử ñã ñược sử dụng rộng rãi ñể chẩn ñoán, xét nghiệm nhiều loại vi khuẩn, virút gây bệnh ở người và nhiều loại vật nuôi. Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, kỹ thuật lai ADN, PCR, RT-PCR ñã ñược sử dụng ñể phát hiện nhiều loại virút, vi khuẩn (Ligthner. 1999). Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử ñể chẩn ñoán bệnh ở Việt Nam là vấn ñề mới song rất cần thiết, bởi phương pháp này có ý nghĩa thiết thực ñối với nghề nuôi thuỷ sản của Việt Nam trước mắt cũng như lâu dài. Trên thế giới các nghiên cứu về V.anguillarum ñược tiến hành trên các ñối tượng thuỷ sản, một số các nghiên cứu chủ yếu ở cá hồi nhằm phát hiện các gen gây bệnh, ñộc tố gây bệnh [19], ñể nhận dạng chủng gây bệnh và sản xuất vắcxin. Ở Việt Nam bằng phương pháp phân loại truyền thống [1] ñã phát hiện ñược V.anguillarum trên một số ñối tượng thủy sản nuôi: tôm [6], cá song [13], ốc hương [3] . . Tuy nhiên theo các nghiên cứu cho thấy một số loài Vibrio có hình thái, mầu sắc khuẩn lạc gần giống nhau; ñặc biệt trên môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose) và VAM (Vibrio anguillarum Medium) V.anguillarum và V.harveyi ñều cho khuẩn lạc màu vàng có hình thái giống nhau [15], [50]. Do vậy việc ñịnh tên bằng phương pháp phân loại truyền thống gặp một số khó khăn. Mặt khác, nghiên cứu lựa chọn ra các chủng Vibrio anguillarum mang gen gây bệnh ñể ứng dụng sản xuất chế phẩm phòng bệnh và vắcxin là vấn ñề ñang ñược mọi người quan tâm. “Sử dụng kỹ thuật PCR ñể phát hiện vi khuẩn Vibrio anguillarum trên một số loài thủy sản nuôi của Việt Nam” là hướng nghiên cứu mới góp phần tìm hiểu về cơ chế gây bệnh và phương pháp phát hiện V.anguillarum giúp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 5 cho việc chẩn ñoán nhanh, chính xác ñể ñưa ra các biện pháp phòng ngừa và trị bệnh kịp thời, hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại cho ngành nuôi trồng thuỷ sản là rất cần thiết. Mục tiêu nghiên cứu: ðưa ra phương pháp xác ñịnh nhanh, chính xác vi khuẩn Vibrio anguillarum gây bệnh trên các ñối tượng hải sản nuôi & có ñược chủng Vibrio anguillarum có các ñặc tính ñiển hình ñịnh hướng ứng dụng cho sản xuất chế phẩm phòng bệnh & vắcxin. Nội dung nghiên cứu của ñề tài: Phân lập, nhận dạng sơ bộ vi khuẩn V. anguillarum ở tôm he (P.monodon, P.vannamei), cá song (E.coioides) và một số loài cá biển nuôi tại Việt Nam so sánh với chủng chuẩn, thu nhận chủng thuần. Ứng dụng phương pháp PCR ñể phát hiện nhanh, chính xác vi khuẩn Vibrio anguillarum. Khảo sát so sánh trình tự ñoạn gen ñặc trưng, gen ñộc tố gây bệnh. Khảo sát hoạt tính enzym (Amylase, Caseinase, Lipase, Gelatinase và Lecithinase) của các chủng V. anguillarum phân lập.