3. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N
3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính enzym của các chủng Vibrio.sp
Tiến hành thử hoạt tắnh một số enzyme Amylase, Caseinase, Gelatinase, Lipase, Lecithinase và Hemolysin trên các chủng V.anguillarum,
M 1 2 3 4 5 250bp →
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ58
V. harveyi ựã ựược ựịnh danh bằng PCR. Trên bảng 3-8 cho thấy, hầu hết các chủng vi khuẩn ựều có hoạt tắnh Amylase, Caseinase, Gelatinase, Lipase, Lecithinase và Hemolysis (17-24/30 chủng), trong ựó hoạt tắnh Gelatinase, Lipase, Lecithinase và Hemolysis biểu hiện rất cao. đa phần các chủng vi khuẩn nghiên cứu ựều biểu hiện hoạt tắnh của các enzym ngoại bào. đặc biệt, các chủng V.anguillarum phân lập ựược ựều thể hiện hoạt tắnh β-hemolysis (++) tương ựương chủng chuẩn. Với biểu hiện hoạt tắnh β-hemolysis là hoạt tắnh có khả năng gây ựộc tố cao nhất (hơn hoạt tắnh α và γ) các chủng này có khả năng ứng dụng cho sản xuất chế phẩm sinh học và vắcxin.
Hình3-18 Hoạt hoạt tắnh enzym của V.anguillarum,
A. Hoạt tắnh Caseinasse B. Gelatinase C- Hoạt tắnh Hemolysis
A B
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ59
A B
C D
E G
Hình 3-19 Kết quả xác ựịnh hoạt tắnh enzym của V. harveyi A - Gelatinase; B -Caseinase; C Ờ Leucethinase; D - Lipase; E - Amylase; G -Hemolysis Tại hình 3-18, ba chủng Vibrio anguillarum: HW72, Va4, Va6 ựều tiết ra enzym phân huỷ cơ chất Gelatinase, Caseinase và thạch máu. Vòng cơ chất bị tác ựộng ựã ựổi màu vòng quanh các chủng. Chúng ta thấy, vòng cơ chất bị tác ựộng của chủng HW72 là lớn nhất. Hai vòng của các chủng còn lại bé hơn tuy nhiên cũng ựã thể hiện ựược hoạt tắnh enzym của các chủng này. Duy
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ60
nhất, chủng Va1 là không có hoạt tắnh enzym tác ựộng nên cơ chất xung quanh chủng không bị biến ựổi mầu.
Tại hình 3-19, chúng tôi thử nghiệm hoạt tắnh enzym của V. harveyi trên các cơ chất ựã trình bầy. Cũng giống như chủng chuẩn HW72, ở một số cơ chất các chủng chuẩn ATCC14126, VIB 395 nhỉnh hơn về ựường kắnh vòng cơ chất bị tác ựộng. Các chủng chúng tôi phân lập ựược cũng thể hiện rất tốt khả năng tiết enzym phân huỷ cơ chất.
Bảng3-8 Hoạt tắnh enzym của các chủngV. anguillarum, V. harveyi
TT Tên, kắ hiệu A m yl as e C as ei na se G el at in as e L ip as e L ec ith in as e H em ol yy si s 1 HW 72 ++ + - ++ ++ β++ 2 Va1 - - - + - - 3 Va2 ++ +++ ++ +++ +++ ++ 4 Va3 - - - - - 5 Va4 - - ++ - - β++ 6 Va5 - - ++ - + 7 Va6 - - ++ + + β++ 8 Va7 ++ ++ ++ ++ +++ β++ 9 Va8 - - ++ + +++ β++ 10 Va9 + + ++ ++ + 11 Va10 - - ++ ++ ++ - 12 Va11 + ++ + ++ ++ β++ 13 Va12 - - ++ ++ +++ β++ 14 Va13 - - ++ + +++ β++ 15 Va14 ++ ++ ++ ++ +++ β+ 16 Vh15 - + - - - β++ 17 Vh16 - + - + α++ 18 Vh19 + + - - β++
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ61 19 Vh 20 ++ + - ++ ++ α+ 20 Vh21 + + + + - α++ 21 Vh22 - - - - - - 22 Vh23 ++ + +++ +++ +++ α+++ 23 Vh25 +++ +++ +++ +++ +++ α+++ 24 Vh26 + + - - - β++ 25 Vh27 + + + + - β++ 26 Vh28 + - - + β+++ 27 Vh29 + + - + - β++ 28 Vh30 + + - - - β++ 29 ATCC14126 + ++ ++ ++ ++ α++ 30 VIB 395 ++ ++ +++ +++ +++ α+++
Ghi chú:( -) âm tắnh; (+) hoạt tắnh thấp; (++) hoạt tắnh trung bình;(+++) hoạt tắnh cao
Trong các chủng Vibrio anguillarum ựa dạng có 3 chủng (Va2 -Tôm sú; Va7- Tôm chân trắng; Va11- Cá song) có hoạt tắnh enzym cao (Amylase, Caseinase Gelatinase) nhất là hoạt tắnh β+ hemolysis có khả năng gây ựộc tắnh ở vật chủ. Các chủng V. harveyi cũng ựa dạng: một số chủng V. harveyi
có hoạt tắnh α-hemolysis: sự tạo màu xanh lục bao quanh khuẩn lạc trên môi trường thạch máu (Vh21; Vh25) số khác + β-hemolysis: sự tạo một vùng trong suốt (Vh28-Vh29).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
- Tại thời ựiểm tiến hành nghiên cứu ựã phân lập trên tôm sú, tôm thẻ chân trắng, cá song, cá tráp, cá bơn, cá hồng ựỏ, cá chim vây vàng, ốc hương, cá cảnh biển thu ựược 1 số chủng vi khuẩn có ựặc tắnh ựiển hình, kết quả PCR xác ựược 15 chủng Vibrio anguillarum.
- Gen empA là gen ựặc trưng của vi khuẩn V. anguillarum có thể sử dụng gen empA làm gen chỉ thị ựể nhận dạng V. anguillarum bằng phương pháp PCR. đã xây dựng ựược quy trình kỹ thuật phương pháp PCR phát hiện chắnh xác vi khuẩn Vibrio anguillarum.
- Hầu hết các chủng Vibrio anguillarum phân lập ựược trên thuỷ sản ựều có hoạt tắnh enzym (Amylase, Caseinase, Gelatinase, Lipase và Lecithinase) ngoài ra chúng cũng biểu hiện hoạt tắnh β-hemolysis trên môi trường thạch máu, những chủng mang β-hemolysis là những chủng có ựộc tắnh cao có thể sử dụng cho sản xuất chế phẩm phòng bệnh & vắcxin.
II. KIẾN NGHỊ
- đề nghị tiếp tục phổ biến áp dụng phương pháp PCR phát hiện Vibrio anguillarum thêm trên các ựối tượng thủy sản khác nhau ựể khẳng ựịnh kết quả.
- đầu tư nghiên cứu sâu hơn về dịch tễ học phân tử tắnh chất gây bệnh của V.anguillarum ựể ựưa ra các giải pháp phòng trị bệnh do V. anguillarum
hiệu quả, trong ựó ựịnh hướng nghiên cứu sản xuất vắcxin phòng bệnh do
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ63
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Lân Dũng (bản dịch) (1993), Thực tập vi sinh vật học, NXB đại học và Trung học chuyên nghiệp.
2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2001), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội.
3. Lê Lan Hương (2005), điều tra nghiên cứu ký sinh trùng và bệnh vi khuẩn trên ốc hương, sò huyết. Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật ựề tài cấp Bộ.
4. Nguyễn Thị Thanh Lợi, Nguyễn Hoàng Uyên, Nguyễn Chắ Thuận, Nguyễn Văn Hảo (2003). Phát hiện gen tdh (thermostable direct haemolysin) ở các chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập từ tôm sú (Penaeus monodon) ở Việt Nam. Hội nghị CNSH toàn quốc 2003. tr: 1111-1115.
5. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác ựịnh hoạt ựộ Emzym, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
6. Bùi Quang Tề (2002), Nghiên cứu lựa chọn bước ựầu các chất thay thế một số hoá chất và kháng sinh cấm sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật ựề tài cấp Bộ.
7. Bùi Quang Tề (2003), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trừ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
8. Nguyễn Chắ Thuận, Nguyễn Hoàng Uyên, Nguyễn Thị Thanh Lợi (2004). Xác ựịnh gen ựộc tố Thermostable direct hemolysin (tdh) của
V.parahaemolyticus bằng kỹ thuật lai ADN (2004). Những vấn ựề NCCB trong khoa học sự sống- ựịnh hướng Y Dược học; Hà Nội -28/10/2004: tr 475-478.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ64
9. Nguyễn Chắ Thuận, Nguyễn Hoàng Uyên, Nguyễn Thị Thanh Lợi, Lê Trần Bình. 2002. Phương pháp lai ADN probe gắn alkaline -Phosphatase (AP) ựể xác ựịnh Vibrio parahaemolyticus. BCKH Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, NCCB 1037-1039.
10. Nguyễn Chắ Thuận, Nguyễn Xuân Vũ, Nguyễn Hoàng Uyên (2005). đặc ựiểm hóa sinh, hoạt tắnh enzym của một số chủng vi khuẩn phân lập từ ống tiêu hóa của tôm sú (P.monodon) và khả năng ứng dụng. TT BCKH toàn quốc Hà Nội 12/2005 tr.312-314.
11. Nguyễn Hoàng Uyên, Nguyễn Chắ Thuận, Nguyễn Thị Thanh Lợi, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2003. Phát hiện gen mã hoá hemolysin bền nhiệt và không bền nhiệt (tlh) của Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp PCR. TC Sinh vật học 25(4):42-46
12. Nguyễn Hoàng Uyên, Nguyễn Thị Thanh Lợi, Nguyễn Chắ Thuận, Lê Thanh Hoà (2004): Tách dòng gen thermostable direct hemolysin (tdh) mã hóa protein dung huyết chịu nhiệt của chủng Vibrio parahaemolyticus
ATCC17803 và PM1 phân lập từ tôm sú (Penaeus monodon). Tạp chắ Công nghệ Sinh học 2 (1) 43-48-2004.
13. Phan Thị Vân (2006), Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phổ biến ựối với cá mú, cá giò nuôi và ựề xuất các giải pháp phòng trị bệnh. Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật ựề tài cấp Bộ.
14. Lê Xân (2007), Nghiên cứu ựặc ựiểm sinh học, kỹ thuật nuôi thương phẩm và tạo ựàn cá bố mẹ hậu bị của năm loài cá biển kinh tế: cá song vằn (Epinephelus fuscoguttatuss), cá song vang (Epinephelus lanceolatus), cá song chuột (Cromileptis altivelis), cá hồng vân bạc (Lutjanus argentimaculatus) và cá chim vây vàng (Trachinotus blochi). Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật ựề tài cấp Bộ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ65
B. TIẾNG ANH
15. Anicet R. Black. (1994), ỘA medium for presumptive identification of
Vibrio anguillarum.Ợ, Applied and Enviromental Microbiology, May. 1994, p 1681ọ1683.
16. Arias, C.R., Garay, E. and Aznar, R. (1995) Nested PCR method for rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus in fish, sediments, and water. In Appl EnvironMicrobiol. Vol. 61, pp. 3476-3478.
17. Austin, B., A. C. Pride, and G. A. Rhodie (2003) Association of a bacteriophage with virulence in Vibrio harveyi. In J. Fish Dis. Vol. 26, pp. 55-58.
18. Austin, B., and D. A. Austin (1999) Bacterial fish pathogens: disease of farmed and wild fish. Berlin, Germany: Springer-Verlag KG.
19. Austin, M. Alsina, D.A. Austin, F. Grimont, P.D.A.Grimont, T.Jofre, S.Koblavi, J.K.Larsen, K. Pedersen, T. Tiainen, L.Verdonock, and J.Swings (1995), ỘIdentification and Typing of Vibrio anguillarum: a comparasion of different methodsỢ, System. Applied. Microbiol.18, p258ọ302.
20. Barbieri, E., Falzano, L., Fiorentini, C., Pianetti, A., Baffone, W., Fabbri, A., Matarrese, P., Casiere, A., Katouli, M., Kuhn, I., Mollby, R., Bruscolini, F. and Donelli, G. (1999) Occurrence, diversity, and pathogenicity of halophilic Vibrio spp. and non-O1 Vibrio cholerae from estuarine waters along the Italian Adriatic coast. In Appl Environ Microbiol. Vol. 65, pp. 2748- 2753.
21. Bassler, B.L., Wright, M. and Silverman, M.R. (1994) Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ66
sequence and function of genes encoding a second sensory pathway. Mol Microbiol 13: 273-286.
22. Bassler, B.L., Wright, M., Showalter, R.E. and Silverman, M.R. (1993) Intercellular signalling in Vibrio harveyi: sequence and function of genes regulating expression of luminescence. Mol Microbiol 9: 773-786.
23. Ben-Haim, Y., Thompson, F.L., Thompson, C.C., Cnockaert, M.C., Hoste, B., Swings, J. and Rosenberg, E. (2003) Vibrio coralliilyticus sp. nov., a temperature-dependent pathogen of the coral Pocillopora damicornis. In Int J Syst Evol Microbiol. Vol. 53, pp. 309-315.
24. Bose, N. and Taylor, R.K. (2005) Identification of a TcpC-TcpQ outer membrane complex involved in the biogenesis of the toxin-coregulated pilus of Vibrio cholerae. J Bacteriol 187: 2225-2232.
25. Buchmann, K., J. L. Larsen, and B. Therkildsen (2001) Improved recapture rate of vaccinated sea-ranched Atlantic salmon, Salmo salar L. In J. Fish Dis. Vol. 24, pp. 245-248.
26. Chai, S., Welch, T.J. and Crosa, J.H. (1998) Characterization of the interaction between Fur and the iron transport promoter of the virulence plasmid in Vibrio anguillarum. In J Biol Chem. Vol. 273, pp. 33841-33847. 27. Chatterjee, J., Miyamoto, C.M. and Meighen, E.A. (1996) Autoregulation of luxR: the Vibrio harveyi lux-operon activator functions as a repressor. Mol Microbiol 20: 415-425.
28. Chatterjee, J., Miyamoto, C.M. and Meighen, E.A. (1996) Autoregulation of luxR: the Vibrio harveyi lux-operon activator functions as a repressor. Mol Microbiol 20: 415-425.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ67
29. Chopp, D.L., Kirisits, M.J., Moran, B. and Parsek, M.R. (2003) The dependence of quorum sensing on the depth of a growing biofilm. Bull Math Biol 65: 1053-1079.
30. Colwell, R.R., P. R. Brayton, D. J. Grimes, D. B. Roszak, S. A. Huq & L. M. Palmer (1985) Viable but Non-Culturable Vibrio cholerae and Related Pathogens in the Environment: Implications for Release of Genetically Engineered Microorganisms. In Nature biotechnology. Vol. 3, pp. 817-820. 31. Connell, T.D., Metzger, D.J., Lynch, J. and Folster, J.P. (1998) Endochitinase is transported to the extracellular milieu by the eps-encoded general secretory pathway of Vibrio cholerae. In J Bacteriol. Vol. 180, pp. 5591-5600.
32. DeLisa, M.P., Valdes, J.J. and Bentley, W.E. (2001) Quorum signaling via AI-2 communicates the "Metabolic Burden" associated with heterologous protein production in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng 75: 439-450.
33. Denner, E.B., Vybiral, D., Fischer, U.R., Velimirov, B. and Busse, H.J. (2002) Vibrio.
34. Denner, E.B., Vybiral, D., Fischer, U.R., Velimirov, B. and Busse, H.J. (2002) Vibrio calviensis sp. nov., a halophilic, facultatively oligotrophic 0.2 microm-fiIterabIe marine bacterium. In Int J Syst Evol Microbiol. Vol. 52, pp. 549-553.
35. Duan, K., Dammel, C., Stein, J., Rabin, H. and Surette, M.G. (2003) Modulation of Pseudomonas aeruginosa gene expression by host microflora through interspecies communication. Mol Microbiol 50: 1477-1491.
36. Dufour, P., Jarraud, S., Vandenesch, F., Greenland, T., Novick, R.P., Bes, M., Etienne, J. and Lina, G. (2002) High genetic variability of the agr
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ68
locus in Staphylococcus species. In J Bacteriol. Vol. 184, pp. 1180-1186. Chatterjee, J., Miyamoto, C.M. and Meighen, E.A. (1996) Autoregulation of luxR: the Vibrio harveyi lux-operon activator functions as a repressor. Mol Microbiol 20: 415-425.
37. Eberhard, A., Burlingame, A.L., Eberhard, C., Kenyon, G.L., Nealson, K.H. and Oppenheimer, N.J. (1981) Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase. Biochemistry 20: 2444-2449.
38. Gomez-Gil, B., A. Roque, J. F. Turnbull, and L. Tron-Mayen (1998) Species of Vibrioisolated from hepatopancreas, haemolymph and digestive tract of a population of healthy juvenile Penaeus vannamei. In Aquaculture. Vol. 163, pp. 1-9.
39. Grisez, L., Reyniers J.; Verdonck L.; Swings J.; Ollevier F. (1997) Dominant intestinal microflora of sea bream and sea bass larvae, from two hatcheries, during larval development. In Aquaculture. Vol. 155, pp. 387-399. 40. Heidelberg, J.F., Heidelberg, K.B. and Colwell, R.R. (2002) Bacteria of the gammasubclass Proteobacteria associated with zooplankton in
Chesapeake Bay. In Appl Environ Microbiol. Vol. 68, pp. 5498-5507.
41. Heidelberg, J.F., Heidelberg, K.B. and Colwell, R.R. (2002) Seasonality of Chesapeake Bay bacterioplankton species. In Appl Environ Microbiol. Vol. 68, pp. 5488-5497.
42. Hirono, I., Masuda, T. and Aoki, T. (1996) Cloning and detection of the hemolysin gene of Vibrio anguillarum. In Microb Pathog. Vol. 21, pp. 173- 182.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ69
43. Hjeltnes, B., and R. J. Roberts (1993) Vibriosis. In Bacterial diseases of fish. R. J. Roberts, N.R.B., and V. Inglis (ed.) Oxford, United Kingdom: Blackwell Scientific, pp. 109-121.
44. Huys, G., Gevers, D., Temmerman, R., Cnockaert, M., Denys, R., Rhodes, G., Pickup,R., McGann, P., Hiney, M., Smith, P. and Swings, J. (2001) Comparison of the antimicrobial tolerance of oxytetracycline-resistant heterotrophic bacteria isolated from hospital sewage and freshwater fishfarm water in Belgium. Syst Appl Microbiol 24: 122-130.
45. Javier Martiner ỜPicardo (1995), ỘSpecies- Specific detection of Vibrio anguillarum in marine aquaculture enviroment by selective culture and DNA hybridizationỢ, Applied and Emviromental Microbiology, Feb.1996, p 443ọ449.
46. Jessica L. RockẨ and David R. Nelson (2006) Identification and Characterization of a Hemolysin Gene Cluster in Vibrio anguillarum. Infec.ImmunMay 2006, p. 2777Ờ2786.
47. Jun Okuda, Tshihiro Nakai, Park Se Chang, Takainori Oh, Takeshi Ninishino, Tsumotu Koitabashi and Mitsuaki Nishibuchi (2001), ỘThe tox R gene of Vibrio (Listonella) anguillarum controls expression of the major outer membrane proteins but not virulence in a natural host modelỢ, Infection and Immunity, Oct.2001, pp 609ọ611.
48. Jun Okuda,Toshhiro Nakai and Mitsuaki Nishbuchi, 2001 The toxR
Gene of Vibrio (Listonella) anguillarum Controls Expression of the Major Outer Membrane Proteins but Not Virulence in a Natural Host Model
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ70
49. Liu PC, Lee KK (1997), ỘPurivication and characterization of a cysteine protease produced by pothogenic luninous Vibrio harveyiỢ, Curr microbio, Jul 2997, pp 32-39.
50. Mercedes Alsina. 1994 .A medium for Presumptive Identification of
Vibrio anguillarum App.Environ.Microbiol. 60:1681-1683.
51. Norqvist A, B. Norrman and Wolf-Watz 1990. Identification and characterization of a zine metalloprotease associated with invastion by the fish pathology Vibrio anguillarum.Infec.Immun,58; 3731-3736.
52. Norqvist, A.; B. Norman and Hwolf-Watz (1990), ỘIdentification and characterization of zinc metalloprotease associated with invasion by the first pathogen Vibrio anguillarumỢ, Infect Immum, Nov.1990, p 1737ọ1990.
53. Ortigosa, M., C. Esteve, and M. J. Pujalte (1989) Vibrio species in seawater and mussels: abundance and numerical taxonomy. In Syst. Appl.