3. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N
3.2.1Kết quả nghiên cứu khuếch ñạ iñ oạn gen empA của Vibrio
3.2 Kết quả nghiên cứu xác ñịnh V.anguillarum bằng phương pháp sinh học phân tử
3.2.1 Kết quả nghiên cứu khuếch ñại ñoạn gen empA của Vibrio anguillarum anguillarum
- PCR khuếch ñại gen empA chủng chuẩn
Sử dụng 3 chủng V. anguillarum (HW72), V.harveyi (ATCC4126, VIB 395) làm mẫu chuẩn ñể thiết lập các ñiều kiện phản ứng và chu trình nhiệt khuếch ñại gen empA.
Cặp mồi F và R, ñược thiết kế dựa trên trình tự gen empA Metalloproteaza của chủng Vibrio anguillarum có mã số AY091854 của tác giả Chen J.X.
Phản ứng khuếch ñại gen bằng PCR thực hiện với cặp mồi có trình tự như sau:
F: 5’ − CCTTTAACCAAGTGGGCGTA − 3’ R: 5’ − CGATTTGTAAGGGCGACAAT − 3’ - Tách ADN tổng số
Các chủng V. anguillarum (HW72), V.harveyi (ATCC4126, VIB 395) từ trong ống giữ - 700C ñược lấy ra và làm giàu trong dung dịch APW lỏng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………43
trong 24 giờ ở 280C. Thu sinh khối và tách ADN bằng Kit Genomic DNA Purification Kit của Fermentas. Kiểm tra kết quảñộ sạch bằng ñiện di trên gel agrose 1% (hình 3-8). Trên ảnh ñiện di ñồ sản phẩm thu ñược chỉ có 1 vạch duy nhất là ADN tổng số của các chủng vi khuẩn phân lập không bịñứt gãy và không chứa ARN và có thể sử dụng làm vật liệu cho phản ứng PCR.
Hình 3-8: ADN tổng số của các chủng chuẩn ðường 1: HW72; ðường 2: ATCC14126, ðường 3: VIB 395 - Thành phần phản ứng
Bảng 3-3: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Nồng ñộ Thể tích (µl)
H2O khử ion vô trùng - 12
Buffer 10x 1x 2,5
MgCl2 25mM 1,5
dNTP 2mM 2,5
Primer F 10µM 1
Primer R 10µM 1
Taq-ADN polymeraza 1u/1ml 1,5
ADN khuôn 50ng/µl 3
Tổng thể tích 25 µl
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………44
+ Lắc nhẹ trên máy Vortex và li tâm nhanh tất cả các thành phần dung dịch sau khi ñã ñược làm tan.
+ Cho vào trong 1 ống typ PCR các thành phần phản ứng sau (bảng 3-3): H2O ion ñã khử trùng, ñệm PCR, dNTP, primer F, primer R, MgCl2, Taq-ADN Polymeraza, ADN khuôn. Toàn bộ quá trình trên tiến hành trên khay nước ñá.
+ Lắc nhẹ trên máy Vortex và li tâm typ PCR ñựng hỗn hợp các thành phần trên.
ðặt mẫu vào máy, kiểm tra chu trình nhiệt và bắt ñầu thực hiện phản ứng PCR.
- Chu trình phản ứng:
+ Biến tính 950C : 3 phút
+ Lặp lại 35 chu kì : 940C: 1 phút; 560C: 30 giây; 720C: 30 giây. + Bước tổng hợp kéo dài ở chu kỳ cuối cùng (720C) trong 10 phút. + Sau ñó giữ mẫu ở 40C cho ñến khi phân tích.
+ Nhiệt ñộ bắt mồi ñược khảo sát theo tính tóan từ 540C-600C và chọn ñược nhiệt ñộ tối ưu là 56 0C. + Kiểm tra sản phẩm PCR ñoạn gen empA 248 bp bằng ñiện di trên gel (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
agarose 1,5 % ñệm TAE 1x.
Kết quả ñựơc trình bày trên hình 3-9, ñoạn gen empA Metalloproteaza ñược khuếch ñại là một băng rõ nét với ñộ dài khoảng 248 bp (theo tính toán lý thuyết). Chủng vi khuẩn ñược xác ñịnh là Vibrio anguillarum là chủng chuẩn Hw72 cho kết quả PCR dương tính. Các chủng V. harveyi cũng có hình thái khuẩn lạc vàng trên TCBS và VAM, tuy nhiên khuếch ñại gen empA cho kết quả âm tính.
Như vậy ñây là cặp mồi ñặc hiệu, chu trình nhiệt và các ñiều kiện của phản ứng tối ưu ñể phát hiện gen empA của Vibrio anguillarum. Các chủng Vibrio
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………45
harveyi chuẩn có hình thái tương tự trên VAM, TCBS nhưng khi PCR gen
empA cho kết quả âm tính.
Hình 3-9 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng chuẩn M- thang chuẩn 1 Kb: 250 bp; 500 bp, 750 bp…
ðường1: HW 72; ðường 2: ATCC14126; ðường 3: VIB 395 -PCR khuếch ñại gen empA các chủng mẫu phân lập
Từ kết quả thu ñược trên chủng chuẩn, chúng tôi tiến hành tách ADN của tất cả các chủng cho khuẩn lạc vàng trên VAM ñã thu nhận ñược, kiểm tra ñộ sạch và tiến hành PCR khuếch ñại gen empA theo chu trình nhiệt ñã chọn. Kết quả ñược trình bày ở hình 3-10 và hình 3-11: trong số 30 chủng ñược phân lập từ mẫu tôm sú, tôm chân trắng, cá song và cá bơn. Kết quả PCR khuếch ñại gen empA từ các mẫu ADN của vi khuẩn thu nhận ñược 14 mẫu dương tính với sản phẩm PCR có kích thước 248 bp ñúng như sản phẩm PCR của chủng chuẩn HW 72. Hình 3-10 gồm 10 mẫu vi khuẩn phân lập từ tôm cho kết quả dương tính, hình 3-11 kết qua PCR các chủng phân lập từ cá song có 4 mẫu dương tính. M 1 2 3 1000bp 750bp 500 bp 250 bp 248 bp
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………46 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 3-10 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng phân lập từ mẫu tôm M: thang chuẩn 50 bp;
ðường 1- 10 các chủng cho kết quả dương tính; ðường 11: âm tính
M 1 2 3 4 5 6
Hình 3-11 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng phân lập từ mẫu cá M: thang chuẩn 2 kb; ðường 1: ADN chủng chuẩn HW 72 ðường 3,4,5,6: dương tính (các chủng phân lập từ cá song)
ðường 2: Kết quả âm tính