3. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N
3.2.3Kết quả PCR khuếch ñạ i gen luxA
Trong số các chủng cho khuẩn lạc vàng thu ñược trên môi trường VAM, kết quả PCR ñoạn gen empA chỉ thu ñược 14 chủng dương tính (không kể chủng chuẩn). Theo lí thuyết thì các chủng V. harveyi cũng phát triển trên môi trường VAM và khuẩn lạc cũng có màu vàng. ðể tiếp tục xác ñịnh các chủng này có phải là V. harveyi hay không, chúng tôi sử dụng bộ Kit PCR ñịnh tên V. harveyi của phòng thí nghiệm ñã có sẵn ñể tiến hành khuếch ñại ñoạn gen luxA - là gen ñặc hiệu cho V. harveyi.
a. Chuẩn bị phản ứng PCR
- Lấy bộ kit ra khỏi tủ lạnh sâu (-200C) làm tan băng từ từ trên khay ñá vụn, ly tâm nhẹ trước khi mở nắp.
- Cho vào các ống PCR mỗi ống: 22µl PCR-Pemix, 1µl Enzym mix trộn kỹ sau ñó thêm 2µl ADN khuôn. Tổng thể tích 1 phản ứng bằng 25µl.
- ðặt mẫu vào máy, kiểm tra chu trình nhiệt và bắt ñầu thực hiện phản ứng PCR.
b. Chu trình phản ứng:
- Biến tính 940C : 5 phút
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………50
- Bước tổng hợp kéo dài ở chu kỳ cuối cùng (720C) trong 10 phút. Sau ñó giữ mẫu ở 40C cho ñến khi phân tích.
c. ðiện di sản phẩm của phản ứng:
- ðiện di sản phẩn PCR trên gel agarose 1,5% ñêm TAE 1x.
Kết quả ñiện di sản phẩn PCR trình bày ở hình 3-13 cho thấy chỉ duy nhất chủng chuẩn ATCC14126 V. harveyi (ñường 1) cho kết quả dương tính với 1 băng duy nhất có kích thước là 324 bp ñúng như ñoạn gen thiết kế theo lý thuyết, còn lại chủng HW72 (ñường 2) và các chủng V.anguillarum (ñường 3,4,5) ñều cho kết quả âm tính.
M 1 2 3 4 5
Hình 3-13 Sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi chuẩn M: thang chuẩn 1 kb; ðường 1: chủng chuẩn ATCC14126
ðường 2: HW72 âm tính; ðường 3,4,5: Các chủng V.anguillarum âm tính Như vậy sử dụng PCR khuếch ñại gen luxA có thể xác ñịnh ñược các chủng V.harveyi.
Trên cơ sở kết quả khảo sát các chủng chuẩn. Sử dụng kit PCR khuếch ñại gen luxA tiếp tục khảo sát các chủng ñược phân lập trên môi trường VAM có hình thái khuẩn lạc tròn bóng, vàng và khuếch ñại gen empA âm tính.
324 bp 1000bp
750 bp 500 bp 250 bp
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………51
M C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Hình 3-14 Sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi
M: thang chuẩn 1 kb; ðường C - ATCC14126
ðường: 1-11 chủng phân lập từ mẫu cá (Vh15,Vh16,…Vh 30) dương tính; ðường: 12,13 âm tính.
M C 1 2 3 4 5
Hình 3-15 Sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi
M: thang chuẩn 1 kb; ðường C: ATCC14126 ðường 1-5: chủng phân lập từ mẫu Tôm (Vh19-Vh23) Kết quả trình bày hình ở hình 3-14 là sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi (ðường C)- ATCC14126. ðường 1-11 chủng phân lập từ mẫu cá (Vh15,Vh16,…Vh 30) dương tính. ðường 12,13 âm tính.
Trên hình 3-15, sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi (ðường C) ATCC14126; ðường 1-5: chủng phân lập từ mẫu tôm (Vh19-Vh23).
Như vậy sử dụng phương pháp PCR khuếch ñại ñoạn gen luxA ñã xác ñịnh V.harveyi ñược phân lập ở các ñối tượng hải sản khác nhau tôm, cá.
324 bp 324 bp 1000bp 750 bp 500bp 250 bp 1000bp 750bp 500bp 250bp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………52
Sử dụng kỹ thuật PCR ñã ñịnh tên ñược các chủng chúng tôi thu nhận ñược. Danh mục các chủng ñược trình bày ở bảng 3-4.
Bảng 3-4 Kết quảñịnh danh bằng phương pháp PCR
TT Tên, kí hiêu V.anguillarum V.harveyi
1 HW 72 + - 2 Va1 + - 3 Va2 + - 4 Va3 + - 5 Va4 + - 6 Va5 + - 7 Va6 + - 8 Va7 + - 9 Va8 + - 10 Va9 + - 11 Va10 + - 12 Va11 + - 13 Va12 + - 14 Va13 + - 15 Va14 + - 16 Vh15 - + 17 Vh16 - + 18 Vh19 - + 19 Vh 20 - + 20 Vh21 - + 21 Vh22 - + 22 Vh23 - + 23 Vh25 - + 24 V26 - + 25 Vh27 - + 26 Vh28 - + 27 Vh29 - + 28 Vh30 - +
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………53
29 ATCC14126 - +
30 VIB 395 - +