3. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N
3.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn trên môi trường ñặ c trưng
Bảng 3-2 Kết quả phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS ,VAM
Khuẩn lạc trên TCBS khuẩn lạc vàng Chủng cho trên TT tượng thuỷ sản ðặc ñiểm/ñối
phân lập Tổng số mẫu Xanh, các mầu khác Vàng VAM 1. Tôm sú 20 11 9 9 2. Tôm chân trắng 6 0 6 6 3. Cá song 16 10 6 6 4. Cá tráp 4 4 0 0 5. Cá hồng ñỏ 6 6 0 0 6. Cá chim 5 5 0 0 7. Cá bơn 6 0 6 6 8. Cá cảnh biển 1 1 0 0 9. Ốc hương 4 4 0 0 10. Chủng chuẩn 3 0 3 3 Tổng cộng 71 41 30 30
Các mẫu bệnh phẩm ñược xử lý theo phương pháp tại mục 2.3.1. Trên môi trường VAM [15], V.anguillarum & V.harveyi ñều cho khuẩn lạc mầu vàng. Kết quả phân lập từ các mẫu tôm, cá ñược trình bày trên bảng trên bảng 3-2. Trong số 71 mẫu vi khuẩn thu ñược 30 chủng cho khuẩn lạc vàng trên TCBS. Từ các khuẩn lạc vàng, hòa trong dung dịch NaCl 0,85% cấy trải lên ñĩa thạch với môi trường VAM, nuôi ở 280C trong 24-48 giờ, chọn trên ñĩa thạch các khuẩn lạc màu vàng, lớn tròn bóng sáng. Sau ñó chọn cấy chuyển vài lần trên môi trường 2216E ñể thu các chủng thuần nhất [50], Anicet R. Black [15], giữ trong glyccerol 15% ở - 700C ñể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………41 Hình 3-2: Khuẩn lạc V.anguillarum trên
môi trường TCBS
Hình 3-3 Khuẩn lạc của HW 72 trên môi trường VAM
Hình 3-4 Khuẩn lạc của chủng (Va5) trên môi trường VAM
Hình 3-5 : Khuẩn lạc V.anguillarum
trên môi trường TCBS
Hình 3-6: Khuẩn lạc của chủng ( Va3) trên môi trường VAM
Hình 3-7: Khuẩn lạc của chủng (Va7) trên môi trường VAM
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………42
Trên hình 3-2, 3-5 ở môi trường TCBS các khuẩn lạc phát triển tốt, ñều, sáng bóng và có mầu vàng. Các chủng này ñều sử dụng ñường sucrose lên men axit vì vậy làm ñổi màu môi trường TCBS từ xanh sang vàng. Trong hình 3-3, 3-4, 3-6, 3-7 trên môi trường VAM các chủng ñều có hình thái khuẩn lạc to, tròn ñều sáng bóng hình thái không có gì khác nhau giữa các chủng thử nghiệm và chủng chuẩn (hình 3-3), các chủng này sử dụng ñường sorbitol, lên men axit và làm ñổi màu môi trường từ xanh tím sang vàng. Như vậy các chủng phân lập ñược về hình thái, kích thước giống các chủng
V.anguillarum hoặc V. harveyi và ñược ký hiệu Va và Vh.
3.2 Kết quả nghiên cứu xác ñịnh V.anguillarum bằng phương pháp sinh học phân tử
3.2.1 Kết quả nghiên cứu khuếch ñại ñoạn gen empA của Vibrio anguillarum anguillarum
- PCR khuếch ñại gen empA chủng chuẩn
Sử dụng 3 chủng V. anguillarum (HW72), V.harveyi (ATCC4126, VIB 395) làm mẫu chuẩn ñể thiết lập các ñiều kiện phản ứng và chu trình nhiệt khuếch ñại gen empA.
Cặp mồi F và R, ñược thiết kế dựa trên trình tự gen empA Metalloproteaza của chủng Vibrio anguillarum có mã số AY091854 của tác giả Chen J.X.
Phản ứng khuếch ñại gen bằng PCR thực hiện với cặp mồi có trình tự như sau:
F: 5’ − CCTTTAACCAAGTGGGCGTA − 3’ R: 5’ − CGATTTGTAAGGGCGACAAT − 3’ - Tách ADN tổng số
Các chủng V. anguillarum (HW72), V.harveyi (ATCC4126, VIB 395) từ trong ống giữ - 700C ñược lấy ra và làm giàu trong dung dịch APW lỏng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………43
trong 24 giờ ở 280C. Thu sinh khối và tách ADN bằng Kit Genomic DNA Purification Kit của Fermentas. Kiểm tra kết quảñộ sạch bằng ñiện di trên gel agrose 1% (hình 3-8). Trên ảnh ñiện di ñồ sản phẩm thu ñược chỉ có 1 vạch duy nhất là ADN tổng số của các chủng vi khuẩn phân lập không bịñứt gãy và không chứa ARN và có thể sử dụng làm vật liệu cho phản ứng PCR.
Hình 3-8: ADN tổng số của các chủng chuẩn ðường 1: HW72; ðường 2: ATCC14126, ðường 3: VIB 395 - Thành phần phản ứng
Bảng 3-3: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Nồng ñộ Thể tích (µl)
H2O khử ion vô trùng - 12
Buffer 10x 1x 2,5
MgCl2 25mM 1,5
dNTP 2mM 2,5
Primer F 10µM 1
Primer R 10µM 1
Taq-ADN polymeraza 1u/1ml 1,5
ADN khuôn 50ng/µl 3
Tổng thể tích 25 µl
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………44
+ Lắc nhẹ trên máy Vortex và li tâm nhanh tất cả các thành phần dung dịch sau khi ñã ñược làm tan.
+ Cho vào trong 1 ống typ PCR các thành phần phản ứng sau (bảng 3-3): H2O ion ñã khử trùng, ñệm PCR, dNTP, primer F, primer R, MgCl2, Taq-ADN Polymeraza, ADN khuôn. Toàn bộ quá trình trên tiến hành trên khay nước ñá.
+ Lắc nhẹ trên máy Vortex và li tâm typ PCR ñựng hỗn hợp các thành phần trên.
ðặt mẫu vào máy, kiểm tra chu trình nhiệt và bắt ñầu thực hiện phản ứng PCR.
- Chu trình phản ứng:
+ Biến tính 950C : 3 phút
+ Lặp lại 35 chu kì : 940C: 1 phút; 560C: 30 giây; 720C: 30 giây. + Bước tổng hợp kéo dài ở chu kỳ cuối cùng (720C) trong 10 phút. + Sau ñó giữ mẫu ở 40C cho ñến khi phân tích.
+ Nhiệt ñộ bắt mồi ñược khảo sát theo tính tóan từ 540C-600C và chọn ñược nhiệt ñộ tối ưu là 56 0C. + Kiểm tra sản phẩm PCR ñoạn gen empA 248 bp bằng ñiện di trên gel
agarose 1,5 % ñệm TAE 1x.
Kết quả ñựơc trình bày trên hình 3-9, ñoạn gen empA Metalloproteaza ñược khuếch ñại là một băng rõ nét với ñộ dài khoảng 248 bp (theo tính toán lý thuyết). Chủng vi khuẩn ñược xác ñịnh là Vibrio anguillarum là chủng chuẩn Hw72 cho kết quả PCR dương tính. Các chủng V. harveyi cũng có hình thái khuẩn lạc vàng trên TCBS và VAM, tuy nhiên khuếch ñại gen empA cho kết quả âm tính.
Như vậy ñây là cặp mồi ñặc hiệu, chu trình nhiệt và các ñiều kiện của phản ứng tối ưu ñể phát hiện gen empA của Vibrio anguillarum. Các chủng Vibrio
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………45
harveyi chuẩn có hình thái tương tự trên VAM, TCBS nhưng khi PCR gen
empA cho kết quả âm tính.
Hình 3-9 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng chuẩn M- thang chuẩn 1 Kb: 250 bp; 500 bp, 750 bp…
ðường1: HW 72; ðường 2: ATCC14126; ðường 3: VIB 395 -PCR khuếch ñại gen empA các chủng mẫu phân lập
Từ kết quả thu ñược trên chủng chuẩn, chúng tôi tiến hành tách ADN của tất cả các chủng cho khuẩn lạc vàng trên VAM ñã thu nhận ñược, kiểm tra ñộ sạch và tiến hành PCR khuếch ñại gen empA theo chu trình nhiệt ñã chọn. Kết quả ñược trình bày ở hình 3-10 và hình 3-11: trong số 30 chủng ñược phân lập từ mẫu tôm sú, tôm chân trắng, cá song và cá bơn. Kết quả PCR khuếch ñại gen empA từ các mẫu ADN của vi khuẩn thu nhận ñược 14 mẫu dương tính với sản phẩm PCR có kích thước 248 bp ñúng như sản phẩm PCR của chủng chuẩn HW 72. Hình 3-10 gồm 10 mẫu vi khuẩn phân lập từ tôm cho kết quả dương tính, hình 3-11 kết qua PCR các chủng phân lập từ cá song có 4 mẫu dương tính. M 1 2 3 1000bp 750bp 500 bp 250 bp 248 bp
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………46 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 3-10 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng phân lập từ mẫu tôm M: thang chuẩn 50 bp;
ðường 1- 10 các chủng cho kết quả dương tính; ðường 11: âm tính
M 1 2 3 4 5 6
Hình 3-11 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng phân lập từ mẫu cá M: thang chuẩn 2 kb; ðường 1: ADN chủng chuẩn HW 72 ðường 3,4,5,6: dương tính (các chủng phân lập từ cá song)
ðường 2: Kết quả âm tính
3.2.2 Kết quả nghiên cứu giải trình tự và phân tích gen empA của V. anguillarum anguillarum
Sau khi có sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành làm sạch bằng Kit bioneer, Kiểm tra trên ñiện di 1,5% agarose (hình 3-12)
248 bp 248 bp 250 bp→ 150 bp→ 50 bp→ 750 bp→ 500 bp→ 250 bp→
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………47
-
Hình 3-12 Sản phẩm PCR gen empA làm sạch
Tiến hành xác ñịnh trình tự gen empA của chủng V.anguillarum Va3 phân lập từ tôm tại Việt Nam trên máy xác ñịnh trình tự nucleotit tựñộng ABI 3100.
Hình ảnh chrroma (Trình tự sắp xếp các Nucleotit) Trình tựñoạn gen empA CGATTTGTAAGGGCGACAATCCACGAAGAAGTGGAAGGTTTGGCTGCCGGGCT TTGACATACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTGATCGAAACTTTAGCGCT GGTTGAGCTTGCGACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTT GTAACCCTATTACTGGTTTACCTTTTTCTAGTACATTCTCCGTTGGAGGCACTAC GCCACAGCTAGCATTTACGCCCACTTGGTTAAAGG 248 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………48
Sử dụng phần mềm BLAST ở trang web www.ncbi.nlm.nih.gov, so sánh trình tự ñoạn gen empA của chủng V.anguillarum Va3 với các trình tự AY428808; AY091854, AY046320 và L02528 ñã ñược công bố trên ngân hàng giữ liệu gen Quốc tế. Kết quả trình tự các nucleotít của gen empA của Va3 trùng tới 97% với gen empA của chủng V.anguillarum so sánh. Các thông số kỹ thuật ñược thể hiện tại các nội dung dưới ñây.
SeqA Name Len(nt) SeqB Name Len(nt) Score
===================================================== 1 Va3 249 2 AY428808 250 97 1 Va3 249 3 AY091854 250 97 1 Va3 249 4 AY046320 250 97 1 Va3 249 5 L02528 250 97 ===================================================== AY046320 CGATTTGTAAGGGCGACAATCCCACGAAGAAGTGGTTGGTTT-GCTGCC-GGCTTTGACA 58 L02528 CGATTTGTAAGGGCGACAATCCCACGAAGAAGTGGTTGGTTT-GCTGCC-GGCTTTGACA 58 AY091854 CGATTTGTAAGGGCGACAATCCCACGAAGAAGTGGTTGGTTT-GCTGCC-GGCTTTGACA 58 AY428808 CGATTTGTAAGGGCGACAATCCCACGAAGAAGTGGTTGGTTT-GCTGCC-GGCTTTGACA 58 Va3 CGATTTGTAAGGGCGACAATCC-ACGAAGAAGTGGAAGGTTTGGCTGCCGGGCTTTGACA 59 ********************** ************ ***** ****** ********** AY046320 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTAATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 118 L02528 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTAATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 118 AY091854 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTGATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 118 AY428808 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTGATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 118 Va3 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTGATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 119 ***************************** ****************************** AY046320 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTG 178 L02528 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTG 178 AY091854 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTG 178 AY428808 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTG 178 Va3 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTA 179
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………49 *********************************************************** AY046320 CCTTTTTCTAGCACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 238 L02528 CCTTTTTCTAGCACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 238 AY091854 CCTTTTTCTAGCACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 238 AY428808 CCTTTTTCTAGCACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 238 Va3 CCTTTTTCTAGTACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 239 *********** ************************************************ AY046320 TGGTTAAAGG 248 L02528 TGGTTAAAGG 248 AY091854 TGGTTAAAGG 248 AY428808 TGGTTAAAGG 248 Va3 TGGTTAAAGG 249 **********
Như vậy kết quả sản phẩm PCR thu ñược từ Va3 ñúng là gen empA của
V.anguillarum
3.2.3 Kết quả PCR khuếch ñại gen luxA
Trong số các chủng cho khuẩn lạc vàng thu ñược trên môi trường VAM, kết quả PCR ñoạn gen empA chỉ thu ñược 14 chủng dương tính (không kể chủng chuẩn). Theo lí thuyết thì các chủng V. harveyi cũng phát triển trên môi trường VAM và khuẩn lạc cũng có màu vàng. ðể tiếp tục xác ñịnh các chủng này có phải là V. harveyi hay không, chúng tôi sử dụng bộ Kit PCR ñịnh tên V. harveyi của phòng thí nghiệm ñã có sẵn ñể tiến hành khuếch ñại ñoạn gen luxA - là gen ñặc hiệu cho V. harveyi.
a. Chuẩn bị phản ứng PCR
- Lấy bộ kit ra khỏi tủ lạnh sâu (-200C) làm tan băng từ từ trên khay ñá vụn, ly tâm nhẹ trước khi mở nắp.
- Cho vào các ống PCR mỗi ống: 22µl PCR-Pemix, 1µl Enzym mix trộn kỹ sau ñó thêm 2µl ADN khuôn. Tổng thể tích 1 phản ứng bằng 25µl.
- ðặt mẫu vào máy, kiểm tra chu trình nhiệt và bắt ñầu thực hiện phản ứng PCR.
b. Chu trình phản ứng:
- Biến tính 940C : 5 phút
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………50
- Bước tổng hợp kéo dài ở chu kỳ cuối cùng (720C) trong 10 phút. Sau ñó giữ mẫu ở 40C cho ñến khi phân tích.
c. ðiện di sản phẩm của phản ứng:
- ðiện di sản phẩn PCR trên gel agarose 1,5% ñêm TAE 1x.
Kết quả ñiện di sản phẩn PCR trình bày ở hình 3-13 cho thấy chỉ duy nhất chủng chuẩn ATCC14126 V. harveyi (ñường 1) cho kết quả dương tính với 1 băng duy nhất có kích thước là 324 bp ñúng như ñoạn gen thiết kế theo lý thuyết, còn lại chủng HW72 (ñường 2) và các chủng V.anguillarum (ñường 3,4,5) ñều cho kết quả âm tính.
M 1 2 3 4 5
Hình 3-13 Sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi chuẩn M: thang chuẩn 1 kb; ðường 1: chủng chuẩn ATCC14126
ðường 2: HW72 âm tính; ðường 3,4,5: Các chủng V.anguillarum âm tính Như vậy sử dụng PCR khuếch ñại gen luxA có thể xác ñịnh ñược các chủng V.harveyi.
Trên cơ sở kết quả khảo sát các chủng chuẩn. Sử dụng kit PCR khuếch ñại gen luxA tiếp tục khảo sát các chủng ñược phân lập trên môi trường VAM có hình thái khuẩn lạc tròn bóng, vàng và khuếch ñại gen empA âm tính.
324 bp 1000bp
750 bp 500 bp 250 bp
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………51
M C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Hình 3-14 Sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi
M: thang chuẩn 1 kb; ðường C - ATCC14126
ðường: 1-11 chủng phân lập từ mẫu cá (Vh15,Vh16,…Vh 30) dương tính; ðường: 12,13 âm tính.
M C 1 2 3 4 5
Hình 3-15 Sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi
M: thang chuẩn 1 kb; ðường C: ATCC14126 ðường 1-5: chủng phân lập từ mẫu Tôm (Vh19-Vh23) Kết quả trình bày hình ở hình 3-14 là sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi (ðường C)- ATCC14126. ðường 1-11 chủng phân lập từ mẫu cá (Vh15,Vh16,…Vh 30) dương tính. ðường 12,13 âm tính.
Trên hình 3-15, sản phẩm PCR gen luxA của chủng V.harveyi (ðường C) ATCC14126; ðường 1-5: chủng phân lập từ mẫu tôm (Vh19-Vh23).
Như vậy sử dụng phương pháp PCR khuếch ñại ñoạn gen luxA ñã xác ñịnh V.harveyi ñược phân lập ở các ñối tượng hải sản khác nhau tôm, cá.
324 bp 324 bp 1000bp 750 bp 500bp 250 bp 1000bp 750bp 500bp 250bp
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………52
Sử dụng kỹ thuật PCR ñã ñịnh tên ñược các chủng chúng tôi thu nhận ñược. Danh mục các chủng ñược trình bày ở bảng 3-4.
Bảng 3-4 Kết quảñịnh danh bằng phương pháp PCR
TT Tên, kí hiêu V.anguillarum V.harveyi
1 HW 72 + - 2 Va1 + - 3 Va2 + - 4 Va3 + - 5 Va4 + - 6 Va5 + - 7 Va6 + - 8 Va7 + - 9 Va8 + - 10 Va9 + - 11 Va10 + - 12 Va11 + - 13 Va12 + - 14 Va13 + - 15 Va14 + - 16 Vh15 - + 17 Vh16 - + 18 Vh19 - + 19 Vh 20 - + 20 Vh21 - + 21 Vh22 - + 22 Vh23 - + 23 Vh25 - + 24 V26 - + 25 Vh27 - + 26 Vh28 - + 27 Vh29 - + 28 Vh30 - +
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………53
29 ATCC14126 - +
30 VIB 395 - +
3.2.4 Kết quả so sánh phương pháp PCR và kit API-20E xác ñịnh
V.anguillarum và V. harveyi
Sử dụng bộ Kit API-20E khảo sát ñặc ñiểm sinh hoá của các chủng
Vibrio ñã phân lập. Kết quả trên hình 3-16 và bảng 3-5 cho thấy các chủng V. anguillarum cho phản ứng dương tính với ONPG, ADH, IND, VP, GEL, GLU, MAN, SOR, SAC và phản ứng âm tính với LDC, ODC, H2S, URE, TDA, INO, RHA, AMY và với CIT, ARA các chủng có các phản ứng khác nhau.
Hình 3-16 Kết quả kiểm tra API 20E chủng Va3 (2), HW72 (3) và VIB 395(1)
Kết qủa kiểm tra các chủng vibrio spp. ñã phân lập ñược trình bày ở bảng 3-5, xác ñịnh ñược 13 chủng V. anguillarum và 13 chủng Vibrio