3. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N
3.2.5Quy trình xác ñị nh vi khuẩ nV anguillarum bằng kỹ thuật
Polymerase chain reaction (PCR)
a. Thiết bị, dụng cụ
Bộ nghiền mẫu vô trùng; Tủ thao tác vô trùng; Máy trộn mẫu; Máy khuấy từ; Máy ly tâm (13.000 vòng/phút); Máy PCR; Bộñiện di ADN; Bàn ñọc kết quả với tia UV, bước sóng 312 nm; Máy chụp ảnh ñể lưu kết quả; Tủ lạnh nhiệt ñộ -20oC hoặc thấp hơn; Tủ lạnh nhiệt ñộ 4oC;Lò vi sóng (microwave); Micropipette các loại; Ống eppendorf chuyên dùng cho PCR các loại: 1,5 ml và 0,5 ml; Ðầu típ: 1 - 5; 10; 100 và -1000 µl.
b. Mồi, hóa chất
Mồi chuyên biệt:
empA - F 5’ CCT TTA ACC AAG TGG GCG TA-3’
empA - R 5’ CGA TTT GTA AGG GCG AAC AT-3’
Hóa chất:
- Hoá chất dùng cho PCR
- Agarose 1,5% trong dung dịch TAE
- Dung dịch nạp mẫu (bromophenol blue và glycerol) 6X gồm: + Bromophenol blue 0,25 % và glycerol 40 %
+ Dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml) + Thang ADN chuẩn: 1.000 bp
c. Chuẩn bị mẫu
Các bước tiến hành:
Từ các chủng ñã thu nhận trên môi trường VAM, cấy trên ống thạch nghiêng môi trường 2216E ủ 280C 18-24 giờ; cho 2 ml ñệm PBS; li tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút thu tủa và ADN tổng số từ vi khuẩn ñược tách chiết theo bộ Kit Genomic DNA Purification Kit của Fermentas theo trình tự như sau:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………56
Ly tâm 1ml huyền dịch tế bào ñã ñược nuôi qua ñêm trong 5 phút, tốc ñộ 5000 vòng/phút. Loại dịch nổi, rửa tế bào 2 lần bằng dung dịch PBS 1x rồi hoà lại sinh khối vi khuẩn trong 200µl dung dịch TE1x. Thêm 400µl dung dịch phá tế bào và ủ ở 650C trong 5 phút. Sau ñó bổ xung 600µl chloroform, lắc nhẹ rồi ly tâm 10.000vòng/phút trong 2 phút.
Hút toàn bộ pha trên sang ống mới rồi thêm 800µl dung dịch tủa, lắc nhẹ, ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 2 phút và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút. Loại toàn bộ dịch nổi rồi hoà tủa ADN vào 100µl dụng dịch NaCl 1,2M và trộn ñều.
Ủ với Rnase với nồng ñộ cuối cùng 0,2mg/ml rồi ủ 370C trong 1 giờñể loại ARN. Thêm 300µl cồn tuyệt ñối và ñể 10 phút ở – 200C. Sau ñó ly tâm lấy tủa ở 14.000 vòng/phút trong 15 phút. Loại cồn và rửa tủa 2 lần bằng cồn 70%. Làm khô rồi hoà tủa trong nước khử ion ñã khử trùng.
Kiểm tra ñộ sạch và xác ñịnh hàm lượng bằng cách ñiện di trên gel agarose 1% hay ño quang phổở 2 bước sóng 280nm và 260nm.
d. Thực hiện phản ứng PCR: Bảng 3-7 Thành phần phản ứng PCR (25 µl.) TT Thành phần Thể tích 1. ðệm 10x 2,5 µl 2. MgCl2 25 mM 1,5 µl 3. dNTP 2 mM 2,5 µl 4. Mồi F –R (10 µM) 1,0 µl 5. Taq 1 U/ µl 1,5 µl 6. Dịch chiết ADN 4,0 µl 7. H20 12 µl Tổng cộng 25 µµµµl
e. Chu trình nhiệt cho phản ứng:
Thực hiện phản ứng khuếch ñại: 94oC trong 3 phút (1 chu kỳ); nhiệt ñộ 93oC trong 1 phút; ở nhiệt ñộ 56oC trong 1 phút; ở nhiệt ñộ 72oC: 1 phút; (35 chu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………57
kỳ); Chu kỳ cuối nhiệt ñộ 72oC trong 10 phút; ñểở nhiệt ñộ 4oC cho ñến khi phân tích.
g. ðiện di sản phẩm nhận ñịnh kết quả
Lấy 5 µl sản phẩm PCR trộn với 1µl dung dịch 6X Loading Dye rồi cho vào các giếng thạch. Ðiện di trên gel agarose 1,5 % trong ñệm TAE 1X, thời gian 30 phút ởñiện thế 100V và cường ñộ 50mA.
− Nhuộm bản gel bằng Ethidium bromide (5-15phút); soi bản gel trên ñèn UV (312nm) rồi xem kết quả
− Căn cứ vào thang ADN và mẫu chuẩn ñể nhận ñịnh kết quả. Nếu trên ảnh ñiện di sản phẩm PCR, ADN của mẫu nghiên cứu xuất hiện duy nhất 1 băng ñặc trưng kích thước 249 bp thì kết luận chủng thu nhận ñược chính là
V.anguillarum.
Hình 3-17 Sản phẩm khuếch ñại trên gel agarose 1,5% trong ñệm TAE 1X. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chú thích- Giếng M thang ADN chuẩn 1.000 bp; Giếng 1-2: sản phẩm khuếch ñại 250 bp; Giếng 3-4: mẫu ñối chứng dương; Giếng 5 : mẫu ñối chứng âm.