Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR

Vật liệu nghiên cứu

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………29. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………30.

Phương pháp nghiên cứu

Chỳng tụi tiến hành ủặt cỏc chủng nấm ủược nuụi cấy trờn mụi trường ở cỏc tủ nhiệt ủộ khỏc nhau: 200C, 280C, 300C ủể tỡm ra nhiệt ủộ tối ưu cho sự phát triển của chủng nấm A. Tiến hành ủo tốc ủộ phỏt triển của khuẩn lạc trờn ủĩa petri thuỷ tinh bằng cỏch: chủng nấm ủược cấy vào vị trớ trung tõm của ủĩa, sau ủú kẻ hai ủường vuụng gúc tớnh từ ủiểm trung tõm ủú, sau ủú ủo ủường kớnh phỏt triển của khuẩn lạc theo từng ngày (thường sau 6 – 7 ngày ủường kớnh khuẩn lạc ủạt cực ủại). Sau khi khảo sát một số quy trình tách chiết ADN tổng số ở nấm men, nấm sợi cũng như cỏc loại nấm Aspergillus ủược cụng bố [59], chỳng tụi chọn phương pháp tách chiết dựa theo quy trình của Aga et al (2003).

Nguyờn lý ủiện di: cỏc phõn tử ADN là cỏc polyanion nờn trong mụi trường trung tớnh va kiềm, dưới tỏc dụng của ủiện trường, chỳng sẽ di chuyển về cực dương. Tiến hành: Sau khi gel agarose 1% ủược chuẩn bị, tiến hành tra mẫu gồm 5 àl mẫu ADN ủược trộn với 1 àl ủệm mẫu cú chứa glyceron 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xelene cyanol và ethidium bromide (EtBr) ở nồng ủộ 50àg/àl và tra vào cỏc giếng trờn gel. Sau ủú, gel ủược lấy ra và soi dưới ỏnh sỏng tử ngoại của máy soi chụp gel IQ5 (Bio-Rad), các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng cỏc băng màu sỏng trờn gel màu ủen.

Ít nhất cú 20 gen mó húa cho cỏc enzym tham gia vào con ủường này và một số gen quan trọng ủó ủược giải trỡnh tự và nghiờn cứu chức năng ủầy ủủ. Trong cỏc gen quan trọng tham gia vào quỏ trỡnh sinh tổng hợp Aflatoxin: Ver-1, Omt-1, Nor-1, và Apa-2 ủang ủược quan tõm và sử dụng làm gen ủớch trong cỏc nghiờn cứu xỏc ủịnh nấm A. Nguyên tắc của PCR là sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt (Taq DNA polymerase) ủể tổng hợp cỏc ủoạn ADN mới từ mạch khuụn trong mụi trường cú dNTPs và cặp mồi ủặc hiệu.

Nguyờn tắc phản ứng: Phản ứng Multiplex PCR là một dạng thay ủổi của phản ứng PCR thụng thường, ở ủú hai hoặc hơn hai locus ủược nhõn lờn ủồng thời trong cựng một phản ứng. Ly tõm, hỳt phần chloroform sang ống mới, sau ủú ủể khụ (chỳ ý ủể trong box sử dụng cho cỏc chất ủộc hại, cú thể dùng phương pháp hút chân không cho kết quả nhanh hơn). Pha ủộng trong thớ nghiệm chạy sắc ký TLC nhằm phỏt hiện ủộc tố Aflatoxin bao gồm toluel: ethylacetate: aceticacid pha theo tỉ lệ tương ứng 50:30:4 theo thể tớch.

Kết quả thu thập và phân lập nấm bệnh Aspergillus flavus từ một số nông sản ở Việt Nam

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………38. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………39. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………40.

Trên môi trường Czapek, khuẩn lạc của loài nấm này cú mầu sắc từ xanh ủến vàng, mặt sau cú màu sắc từ vàng ủến ủỏ nõu (hỡnh 4.3). Ngoài ra, môi trường PDA dễ chuẩn bị và chi phí thấp hơn, nên chỳng tụi sử dụng mụi trường PDA ủặc cho quỏ trỡnh phõn lập, làm thuần sợi nấm và mụi trưởng PDA lỏng ủể nuụi sinh khối nấm phục vụ cho thớ nghiệm tỏch chiết ADN tổng số ở phần sau. Kết quả, từ cỏc mẫu nụng sản ở cỏc ủịa phương khỏc nhau chỳng tụi ủó phõn lập và làm thuần ủược 50 chủng nấm A.

Cỏc chủng nấm thuần này ủược bảo quản trong dung dịch glycerol 50% ủó khử trựng (cú bổ sung 100àg/ml tetracycline), ở 40C ủể phục vụ các thí nghiệm tiếp theo (Hình 4.4). Qua bảng 4.2 và hỡnh 4.5 chỳng ta cú thể thấy ủược, khụng cú sự khỏc biệt nhiều về tốc ủộ phỏt triển của nấm A. Ở 200C, quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh là chậm nhất trong các ủiều kiện nhiệt ủộ khảo sỏt.

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và phát triển của 50 chủng nấm A. Ngoài ra, cựng một loại nụng sản nhưng ủịa ủiểm thu thập mẫu khỏc nhau cũng cú sự khỏc biệt về tốc ủộ phỏt triển của chủng nấm. Như vậy, cú thể thấy ngoài nhiệt ủộ, loại nụng sản và ủịa ủiểm thu thập mẫu cũng ảnh hưởng ủến sinh trưởng và phỏt triển của chủng nấm A.

Kết quả tách chiết ADN tổng số

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………46. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………48. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………49.

Kết quả phõn tớch bằng phản ứng PCR ủặc hiệu với 4 cặp mồi ver-1, omt-1, nor – 1 và apa-2

Kết quả này gợi mở khả năng thành cụng ban ủầu trong việc sử dụng cỏc mồi ủặc hiệu núi trờn ủể giỳp phõn biệt nhanh và phỏt hiện cỏc loài nấm A. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………51. Kết quả phản ứng PCR với từng mồi ủặc hiệu riờng rẽ ủược tổng kết ở cỏc bảng dưới (bảng 4.5 và bảng 4.6).

Ngoài việc xuất hiện của từng gen, chỳng ta xem xột tần số bắt cặp của cỏc gen trong phản ứng PCR ủặc hiệu. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………52. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………53.

Cuối cựng, cú 7 chủng khụng thu nhận ủược bất cứ băng nào với phản ứng PCR riêng rẽ (chiếm 14%). PCR ủặc hiệu với cỏc cặp mồi riờng rẽ, sử dụng khuụn là cỏc mẫu ADN nấm A.flavus.

Các phương pháp khác dùng để chẩn đốn nấm Aspergillus flavus sinh ủộc tố Aflatoxin

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………58. Một lần nữa, chỳng tụi khẳng ủịnh việc tối ưu thành cụng phản ứng Multiplex PCR sử dụng 4 cặp mồi ủặc hiệu nor-1, ver-1, omt-1 và apa-2 trong việc phỏt hiện nhanh và chớnh xỏc sự cú mặt của 4 gen núi trờn, ủồng thời dự đốn khả năng sinh độc tố Aflatoxin của các chủng nấm A. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………59.

Chú thích: A: những chủng lên cả 4 băng trong phản ứng Multiplex PCR ; -: những chủng khụng lờn ủủ 4 băng. Một lần nữa, càng tăng tính thuyết phục về hiệu quả của phương pháp Multiplex PCR với cả 4 cặp mồi. Những chủng cú màu vàng sẫm trên môi trường thường có biểu hiện màu xanh nhạt và có màu sáng hơn.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………61 Hình 4.17: Mầu sắc biểu hiện của nấm Aspergillus flavus trên môi trường. Ly tõm, hỳt phần chloroform sang ống mới, sau ủú ủể khụ (chỳ ý ủể trong box sử dụng cho cỏc chất ủộc hại, cú thể dựng phương phỏp hỳt chõn khụng cho kết quả nhanh hơn). Phần tủa thu ủược sau ủú ủược hũa tan trong 10 – 20 àl chloroform, sau ủú ủược chấm lờn bản sắc ký lớp mỏng (TLC).

Chỳng tụi sử dụng Aflatoxin tổng số làm ủối chứng dương ủể so sỏnh và phỏt hiện sự cú mặt của ủộc tố Aflatoxin (hỡnh 4.19). Như vậy, cú tới 25/25 chủng nấm cú dấu vết sinh ủộc tố Aflatoxin và cú kết quả dương tớnh với phản ứng Multiplex PCR ủồng thời với 4 cặp mồi (chiếm 100%), khụng cú bất kỳ trường hợp ở phản ứng Multiplex PCR khụng khuyếch ủại ủủ cả 4 gen nhưng phỏt hiện cú dấu vết sinh nhiều ủộc tố Aflatoxin (++), mà chỉ cú một vài trường hợp là cú sinh ủộc tố Aflatoxin (+). Tuy vậy, vẫn cú 5 chủng chỉ xuất hiện một hoặc hai băng ủặc hiệu trong phản ứng Multiplex PCR nhưng vẫn phỏt hiện ủược dấu vết ủộc tố Aflatoxin.