Đang tải... (xem toàn văn)
Luận văn được thực hiện với mục đích: Xác định sự sai khác di truyền gen TG5 giữa các nhóm bò vàng địa phương của Việt Nam ở mức độ phân tử giúp định hướng cho việc bảo tồn và phát huy giá trị các giống bản địa Việt Nam.
MỞ ĐẦU Việc bảo tồn sử dụng hiệu nguồn tài nguyên đa dạng sinh học nói chung nguồn gen động vật ni nói riêng nước ta vấn đề cấp thiết Do áp lực kinh tế thị trường đòi hỏi giống có suất cao, biến đổi khí hậu thị hóa nên nhiều giống vật ni địa có nguy bị Từ năm 1990 tổ chức Nông lương thực giới (FAO) xây dựng chương trình phát triển bền vững nguồn gen động vật ni tồn cầu, mục tiêu chương trình nhằm trợ giúp việc trì đa dạng sinh học phát triển nông nghiệp bền vững Đây chương trình tổng thể sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử thị vi vệ tinh (microsatellite), phân tích trình tự ADN, PCR-RFLP, SNP… để đánh giá đa dạng di truyền giống thân giống vật nuôi mức độ phân tử nhằm định hướng cho việc quản lý, bảo tồn sử dụng nguồn gen động vật ni quy mơ tồn cầu [20] Theo thống kê FAO giới có khoảng 3500 giống vật ni, có khoảng 815 giống bò khác Tuy nhiên số thống kê chưa đầy đủ nhiều giống bò địa khác chưa phát hiện, đồng thời nhiều giống có nguy bị khơng bảo tồn [19] Tình hình chăn ni bị thịt Việt Nam phủ đẩy mạnh cơng tác khuyến nơng nhằm “u hóa” đàn bị tỷ lệ bị vàng gốc chưa bị lai tạp nhiều [11] Các chương trình lai tạo tập trung vào cải thiện tầm vóc suất, cịn vấn đề liên quan đến chất lượng thịt để phục vụ thị trường cịn bỏ ngỏ Theo chuyên gia ngành chăn nuôi đánh giá Việt Nam có khoảng nhóm bị vàng địa phương, nhóm mang nét đặc trưng chọn lọc theo sở thích người dân đáp ứng với điều kiện khí hậu vùng Các nhóm bị thường có kích thước nhỏ suất thịt, sản lượng sữa thấp chúng lại có khả chịu điều kiện khó khăn, khả kháng bệnh sinh sản tốt [5] Nhưng liệu bị vàng Việt Nam có gen tiềm ẩn liên quan đến chất lượng thịt như: độ mềm thịt, độ ngọt, mỡ giắt thịt… kiểm tra thông qua marker phân tử để thiết kế chương trình lai tạo hợp lý hay khơng? Trên giới ứng dụng nhiều kỹ thuật lĩnh vực di truyền phân tử để xác định đa hình gen liên quan đến đến tính trạng kinh tế như: chất lượng thịt, tốc độ sinh trưởng…nhằm phát triển chúng thị phân tử hỗ trợ chọn lọc giống bị thịt có suất chất lượng cao Thịt có mỡ giắt độ dày mỡ lưng đặc điểm chất lượng quan trọng có ảnh hưởng đến chất lượng thịt xẻ tác động đến sản xuất bò thịt Chọn lọc nhằm làm tăng thịt có giắt mỡ lại có độ dày mỡ lưng thấp từ lâu công nhận mục tiêu quan trọng cho sản xuất thịt bị chất lượng cao Trong chăn ni bị thịt, truyền thống lựa chọn để tăng thịt có mỡ giắt giảm mỡ lưng không đơn giản hai tính trạng có quan hệ đồng biến (thịt có mỡ giắt nhiều độ dày mỡ lưng cao) Ngày với phát triển mạnh lĩnh vực di truyền phân tử, việc kiểm tra mức độ phân tử ADN nhằm xác định gen quy định phẩm chất tốt tính trạng mỡ giắt thịt cung cấp công cụ hữu hiệu để cải tiến di truyền tính trạng cách thuận lợi Một số gen liên quan đến chất lượng thịt bò xác định như: TG5, CAST-T1, Calpain 316-T2, Calpain 4751-T3 Sự thay đổi trình tự nucelotide gen dẫn đến làm tăng hay giảm độ dày mỡ lưng tỷ lệ mỡ giắt thịt làm biến đổi độ mềm mùi vị thịt, phát kỹ thuật di truyền PCR-RFLP hay giải trình tự gen Do đó, việc kiểm tra di truyền thị (marker) liên quan đến độ mềm thịt trở thành sản phẩm thương mại [31], [32] ứng dụng việc xác đinh kiểu gen mong muốn phục vụ cơng tác lai tạo giống bị thịt Tác giả De cộng (2004) gen Thyroglobulin -TG5- có liên quan đến độ dày mỡ lưng mỡ giắt bắp thịt (marbling) quần thể bò lai F2 Wagyu X Limousin [18] Giống bò Wagyu tiếng Nhật thịt mềm mọng, thơm, tỷ lệ thịt có mỡ giắt cao nên ưa chuộng thị trường Do vậy, gen TG5 đề cử thị phân tử dựa ADN ứng dụng chọn lọc giống bị thịt Cho đến chưa có cơng trình nghiên cứu đa hình di truyền gen TG5 giống bị Việt Nam Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đa hình di truyền gen thyroglobulin (TG5) số nhóm bị vàng Việt Nam” với mục đích: Xác định sai khác di truyền gen TG5 nhóm bị vàng địa phương Việt Nam mức độ phân tử giúp định hướng cho việc bảo tồn phát huy giá trị giống địa Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền Đa dạng di truyền biểu vài mức độ, từ quan sát kiểu hình đến thị phân tử Phương pháp phương pháp đánh giá đa dạng giống qua đặc điểm kiểu hình [28] Các thị kiểu hình chia thành tính trạng riêng biệt (ví dụ tính trạng hình thái sinh thái di truyền) tính trạng số lượng (ví dụ trọng lượng thể) sử dụng để đánh giá biến dị di truyền mối quan hệ phát sinh loài giống quần thể Các thị khác đa hình protein, hoạt tính enzym nhóm máu sử dụng để đánh giá biến dị di truyền quần thể [21], [25], [26] Tuy nhiên, thị cho kết đa hình thấp hạn chế nghiên cứu đa dạng di truyền Hiện với phát triển Công nghệ sinh học đặc biệt công nghệ phân tích gen cung cấp nhiều dấu hiệu với kỹ thuật di truyền phân tử như: PCR-RFLP, kỹ thuật microsatellile, giải trình tự ADN sử dụng rộng rãi nghiên cứu với đối tượng khác Đặc biệt kỹ thuật, công nghệ phân tích di truyền áp dụng nhiều chăn nuôi nhằm hỗ trợ chọn tạo giống vật nuôi (marker assisted selection) nghiên cứu đa dạng di truyền, dự án bảo tồn khai thác nguồn gen Kỹ thuật di truyền phân tử coi hữu hiệu dùng đề đánh giá mức độ sai khác di truyền giống thân giống gia súc, gia cầm 1.1 Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) hay gọi phản ứng chuỗi trùng hợp, Karry Mullis hoàn thiện vào năm 80 đưa lại cách mạng di truyền học phân tử Kỹ thuật PCR cho phép nhân đoạn ADN định trước Kỹ thuật PCR sử dụng đặc điểm trình chép ADN ADN polymerase dùng đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi tương hợp với Cả hai sợi ADN dùng để làm khuôn cho trình tổng hợp đoạn mồi oligonucleotide cung cấp cho hai sợi Hỗn hợp phản ứng lại đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi tổng hợp, sợi sau lại dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm bước: gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN tách rời đoạn Kết cuối phản ứng PCR sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết, ta có n phân tử ADN mạch kép nằm hai đoạn mồi Đó đặc điểm quan trọng thứ hai kỹ thuật PCR, dẫn đến kết đoạn ADN định trước nhân lên [4] 1.2 Các phương pháp nghiên cứu đa hình di truyền dựa PCR 1.2.1 Phương pháp PCR-RFLP( Polymerase chain reaction-Restriction fragment length polymorphism ) Sau nhân đoạn ADN nhờ cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR cắt enzym giới hạn Sau phân tích sản phẩm cắt enzym giới hạn, điện di gel phát thay base nitơ hay thay đổi trật tự base nitơ vị trí cắt ADN nhân lên Phương pháp áp dụng phổ biến nhiều phịng thí nghiệm giới biểu đa hình tương đối cao, dễ tiến hành chi phí thấp 1.2.2 Phương pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism) AFLP phương pháp nghiên cứu đa hình chiều dài đoạn nhân chọn lọc Cơ sở phương pháp dùng enzym giới hạn để cắt nhỏ ADN genome thành phân đoạn có kích thước khác nhau, có đoạn mang đầu mút giống Nếu ta sử dụng đoạn nối (adaptor) có gắn thêm oligonucleotide chọn trước để định hướng cho việc gắn mồi tất đoạn ADN có đầu gắn giống nhân lên Khi ta thay đổi số lượng trật tự oligonucleotide đầu nối ta nhận đoạn ADN nhân có kich thước khác giúp ta phân biệt đa hình chúng 1.2.3 Phương pháp RAPD (Random amplified polymorphism DNA) RAPD phương pháp phân tích đa hình đoạn ADN nhân ngẫu nhiên Dựa sở phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự ngẫu nhiên thường dài khoảng 10 base Phương pháp áp dụng đối tượng chưa biết trình tự ADN genom Phương pháp cho phép phát đa hình cao ngày áp dụng rộng rãi chọn giống phân loại thực vật Nhìn chung phương pháp phân tích đa hình di truyền nhờ thị ADN dựa PCR ngày phát triển nhanh chóng áp dụng rộng rãi chọn giống Tuy nhiên có số hạn chế cho việc áp dụng phương pháp chọn lọc này: - Tốc độ lập đồ gen cho việc áp dụng phương pháp chậm, nhiều gen đưa vào đồ xa thị biết - Việc sử dụng thị phân tử dựa vào PCR tốn nên có số lượng hạn chế thị dựa vào PCR sử dụng chọn lọc 1.2.4 Microsatellite Thuật ngữ Microsatellite Litt Luty giới thiệu vào năm 1989 nhằm trình tự ADN lặp lại cách có trật tự (Tandemly repeated DNA sequence) Các đoạn có độ dài vài cặp bazơ nitơ (2-6 bp), có tính đa hình cao nhân lên phản ứng PCR Microsatellite phân bố ngẫu nhiên toàn hệ gen, tập trung thành cụm nhỏ (clusters) khoảng 200bp tìm thấy tất thể sống đặc biệt thể sống có hệ gen lớn Người ta thấy trung bình 10.000 nucleotide gặp trình tự microsatellite Những đoạn lặp lại polyA /polyT kiểu phổ biến tất hệ gen tần số phân bố loài khác Ngoài cịn có số kiểu lặp lại phổ biến khác kiểu lặp lại nucleotide (CA)/(GT) [10] Microsatellite có tính chất cần thiết cho thị phân tử (Molecular marker) đa dạng khả biến đổi lớn chiều dài chúng dễ dàng phát phản ứng PCR từ lượng ADN nhỏ 1.3 Giải trình tự ADN Nguyên tắc hầu hết phương pháp giải trình tự ADN dựa phương pháp Sanger cộng công bố năm 1977, gọi phương pháp dideoxyribonucleotide (gọi tắt phương pháp dideroxy) Nguyên tắc phương pháp dideroxy dựa việc bổ sung dẫn xuất tương ứng dNTP 2’,3’-dideoxynucleotide (viết tắt ddNTP) vào thành phần phản ứng tổng hợp ADN ống nghiệm Do ddNTP thiếu nhóm C3’-OH, nên gắn vào mạch ADN tổng hợp, trình tổng hợp ADN dừng lại Trong phương pháp Sanger, chép ADN bắt đầu việc gắn đoạn oligonucleotide có trình tự bổ sung với trình tự ADN cần giải ủ chúng enzym ADN polymerase Phân tử ADN tổng hợp có trình tự bổ sung với mạch ADN làm khuôn Các phản ứng tổng hợp trình tự chia thành ống nghiệm tách biệt Mỗi ống bổ sung hỗn hợp gồm loại dNTP thông thường, loại dNTP đánh dấu phóng xạ để phát mạch tổng hợp Ngoài loại loại ddNTP (ddATP ddGTP, ddCTP, ddTTP) bổ sung tương ứng vào ống nghiệm nêu với nồng độ 1/10 so với nộng độ loại dNTP tương ứng Với thành phần phản ứng vậy, phần lớn trường hợp, dNTP liên kết vào mạch ADN tổng hợp, ddNTP (ở nồng độ thấp) liên kết vào số mạch ADN tổng hợp làm kết thúc q trình chép Do có nhiều phân tử ADN tổng hợp đồng thời nên trình dẫn đến hình thành hỗn hợp nhiều phân tử ADN chép khơng hồn chỉnh giống đầu 5’ đánh dấu khác đầu 3’ chiều dài loại nucleotide kết thúc chuỗi Các sản phẩm sau phân tách gel polyacrylamide đọc trình tự theo thứ tự băng xuất điện di theo chiều từ cực dương sang cực âm [3] Giải trình tự ADN tự động Kỹ thuật giải trình tự Sanger mơ tả xác định xác trình tự nucleotide đoạn ADN dài tới 300bp Tuy nhiên, phương pháp cần nhiều thao tác kỹ thuật Ngoài việc đọc kết điện di mắt cịn sai sót Hiện nay, giải trình tự ADN hệ gen lớn dựa vào phương pháp giải trình tự tự động Phương pháp giải trình tự tự động kết hợp đồng thời phản ứng độc lập vào phản ứng chung Trong điều kiện vậy, việc dùng nucleotide đánh dấu phóng xạ (gắn vào đầu 5’ mạch ADN tổng hợp mới) khơng phù hợp đoạn ADN tổng hợp khác nucleotide nên khó phân tách điện di thông thường Để khắc phục điều đó, người ta dùng ddNTP gắn chất phát quang Các ddNTP lúc liên kết vào mạch ADN kéo dài làm ngừng phản ứng chép Cấu trúc phần phát quang ddNTP gồm “gốc phát quang” liên kết với gốc dicholororhodamine (viết tắt dRhodamine, chất nhận lượng quang) khác qua đoạn nối Bốn gốc dRhodamine bị “gốc phát quang” kích thích (bởi nguồn sáng lazer thường từ Argon) nhận lượng phát quang bước sóng khác Nhờ vậy, loại ddNTP kích thích nguồn sáng Argon máy giải trình tự phát “tín hiệu” khác Thơng tin cảm biến tín hiệu kết hợp với máy tính xử lý tự động chuyển thành trình tự ADN Các ddNTP gắn chất phát quang theo nguyên lý nêu gọi yếu tố kết thúc chuỗi BigDyeTM [3] Một số nghiên cứu vai trò cấu trúc gen Thyroglobulin Thyroglobulin hóc mơn glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 660 kDa, tổng hợp từ tế bào nang tuyến giáp giải phóng vào máu dạng tiền hóc môn Mỗi phân tử thyroglobulin chứa 140 amino acid tyrosine (amino acid nằm cấu trúc phân tử thyroglobulin) Thyroglobulin chứa triodothyronine (T3) thyroxin (T4) Trong thể người Thyroglobulin giải phóng với lượng khơng đáng kể Thay vào đó, T4 T3 tách khỏi phân tử thyroglobulin để vào máu Hầu hết hóc mơn tuyến giáp sản xuất T4 Nội tiết tố tương đối khơng hoạt động, chuyển thành dạng T3 hoạt động gan mô khác nhờ phản ứng deioddinated Khoảng 99,7% T3 máu gắn vào globulin số lại hormon tự Hóc mơn T3 có ảnh hưởng đến trưởng thành quan thể Ailhaud cộng (1992) cho thấy vai trị hóc mơn T3 T4 có tác động tới sinh trưởng biệt hóa tế bào tạo mỡ in vitro in vivo [12] Tương tự, T3 T4 cho có liên quan đến tích tụ mỡ giắt bị Wagyu [24] Thịt bị có tỷ lệ mỡ giắt cao mềm so với thịt khơng có mỡ giắt Mỡ giắt bị Wagyu có thành phần a xít béo no nên tốt cho sức khỏe người ăn kiêng người béo người bị tim mạch [35] Hình Lát cắt bắp thịt chứa mỡ giắt bò Wagyu- Nhật Bản Mỡ giắt thịt tạo thành vân thịt (hình 1) Vân thịt yếu tố quan tâm nhiều đánh giá chất lượng thịt Vân thịt có ảnh hưởng nhiều tới tính trạng độ ngon miệng mùi vị Vân thịt đánh giá theo cấp từ không đến nhiều theo màu mỡ theo màu thịt minh họa hình A B Hình Thịt giắt mỡ với mức độ khác phân theo màu mỡ (A) màu thịt (B) 10 enzym BstYI mẫu bị nghiên cứu chúng tơi, minh họa qua hình 15 M CT CC CC CT CC CC CC CC CC CC CC 473 bp 295 bp 178 bp 75 bp M CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC 295 bp 178 bp 75 bp Hình 15 Ảnh điện di kết cắt đoạn gen TG5 enzym BstYI M: Thang ADN chuẩn 100 bp 3.4 Kiểu gen tần số alen nhóm, giống bị A Kiểu gen Kết điện di đoạn gen TG5 sau cắt enzym BstYI tồn 621 mẫu bị thuộc nhóm, giống, kiểu gen thu thể bảng 31 Bảng Số cá thể theo kiểu gen nhóm, giống bị nghiên cứu Nhóm/Giống Kiểu gen CC Kiểu gen CT Kiểu gen TT Tổng số Bò Hà Giang 64 66 Bò Lạng Sơn 66 0 66 Bị Thanh Hóa 65 66 Bò Nghệ An 66 0 66 Bò U đầu rìu 65 66 Bị Phú n 66 0 66 Bò Bà Rịa 65 66 Bò Brahman 94 100 Bò lai Sind 58 59 609 12 621 Tổng Trong 621 mẫu cá thể nghiên cứu, có 12 cá thể mang kiểu gen dị hợp TC lại 609 mẫu CC, khơng có cá thể có kiểu gen đồng hợp TT Trong giống bị Brahman giống có số cá thể mang gen dị hợp TC cao (6 cá thể), tiếp đến bò Hà Giang cá thể, nhóm bị vàng Thanh Hóa, U đầu rìu, Bà Rịa lai Sind nhóm có cá thể , nhóm cịn lại khơng phát cá thể dị hợp TC ( 100% CC) B Tần số a len Sau thu kiểu gen TG5 cá thể nhóm, giống bị nghiên cứu, chúng tơi tính tần số alen nhóm, giống bị Kết thể chi tiết bảng 32 Bảng Tần số alen nhóm, giống bị nghiên cứu Nhóm/Giống Tần số alen C Tần số alen T Bò Hà Giang 0,985 0,015 Bò Lạng Sơn 1,000 0,000 Bò Thanh Hóa 0,992 0,008 Bị Nghệ An 1,000 0,000 Bị U đầu rìu 0,992 0,008 Bị Phú n 1,000 0,000 Bị Bà Rịa 0,992 0,008 Bò Brahman 0,970 0,030 Bò lai Sind 0,992 0,008 0,990 0,010 Tổng đàn Trong nhóm giống bị nghiên cứu giống bị Brahman có tần số alen T cao 0,03 tiếp đến bị Hà Giang 0,015; nhóm bị Thanh Hóa, U đầu rìu, Bà Rịa lai Sind có tần số alen thấp (0,008); nhóm bị cịn lại Lạng Sơn, Nghệ An Phú Yên có tần số alen T (100% alen C alen T) Sự khác tần số alen T nhóm bị vàng địa khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) gộp nhóm bị vàng để so sánh với bị lai Sind bị Brahman khác có ý nghĩa (sẽ trình bày kỹ mục 3.5) Kết nghiên cứu chúng tơi giống bị Brahman nhập Việt Nam tương đương với kết Casas (2005) [15] nghiên cứu bò Brahman thương phẩm Mỹ ( alen T chiếm 0,035) Tuy nhiên cơng trình Kaplanova (2009) [23] nghiên cứu bị sữa Cộng Hòa Séc (Czech Spotted Cattle Holstein Red Holstein Ayshire) cho thấy tần số alen T tương đối cao (0,23) Rincker (2006) [27] nghiên cứu 175 cá thể bị Simmental cho thấy có 26,8% kiểu gen CC, 54,3% kiểu gen CT 18,9% kiểu gen TT ( tần số a len T 0,46) Tác giả Van Eenennaam (2007) [30] nghiên cứu đa hình SNP gen TG5 tần 33 số alen T cao bị Wagyu trung bình số giống bị Bos taurus khác thấp bò Bos indicus So sánh với kết nghiên cứu giống bò khác số tác giả giới phân bố tần số kiểu gen TG5 bị vàng Việt Nam có khác biệt đáng kể Thể có 98% kiểu gen CC có 2% CT khơng có kiểu gen TT Như nêu, mối liên quan alen T với tính trạng mỡ thịt bị nhiều tác giả nghiên cứu cho thấy cá thể mang kiểu gen TT có độ mỡ giắt cao sau đến kiểu gen CT thấp kiểu gen CC Như mối liên quan kiểu gen với điều kiện môi trường nên quần thể bò Vàng Việt Nam thích nghi với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm chịu kham khổ, lại hóa để cày kéo nên alen T coi khơng có lợi Tần số alen T xuất nhỏ kết chọn lọc tự nhiên giúp cho chúng thích nghi với điều kiện mơi trường 3.5 So sánh tần số kiểu gen tần số alen nhóm, giống bị: Bị vàng địa, bị lai Sind bị Brahman đỏ Sau phân tích đa hình nhóm, giống bị chúng tơi nhận thấy tần số alen T khơng có khác có ý nghĩa nhóm bị vàng địa Vì chúng tơi gộp nhóm bị thành nhóm chung gọi bò vàng để so sánh với giống bò lai Sind bò Brahman Số liệu thể bảng 10 Bảng 10 Tần số kiểu gen tần số alen nhóm, giống bị Giống Kiểu CC Kiểu CT Kiểu TT Tần số alen C Tần số alen T Bò Brahman 94 0.970 0.030 Bò lai Sind 58 0.992 0.008 Bò vàng 457 0.995 0.005 Sử dụng phương pháp phân tích thống kê bình phương để so sánh khác tần số alen T theo cách gộp thành nhóm, giống (tương đương với so sánh alen C) chúng thấy có khác có ý nghĩa độ 34 tin cậy 99% (p < 0.01) Tần số alen T cao giống bò Brahman trung bình bị lai Sind thấp bị vàng địa Như mức độ chọn lọc khác có ảnh hưởng định đến xuất alen T Giống bò Brahman giống bò tiếng nhập từ Mỹ chọn lọc cao theo hướng suất thịt tỷ lệ thịt xẻ Bò lai Sind chọn lọc mức trung bình thường khơng chọn theo dịng định mà dựa chọn lọc chủ quan người chăn ni, cịn bị vàng hay cịn gọi bị cóc, bị cỏ chăn ni theo hướng quảng canh chưa có chọn lọc theo dịng 3.6 Kết giải trình tự gen TG5 Để xem xét trình tự đoạn gen TG5 nhóm, giống bị có khác ngồi điểm đa hình mà phát PCR-RFLP hay khơng Chúng lựa chọn mẫu ngẫu nhiên số nhóm giống : Hà Giang, Bà Rịa, Brahman, Nghệ An, Thanh Hóa, U đầu rìu để giải trình tự đoạn gen TG5 Trong mẫu đại diện cho kiểu gen CT là: Hà Giang 76, Bà Rịa 28, Brahman 04, Brahman 98; mẫu đại diện cho kiểu gen CC Nghệ An 63, Hà Giang 45, Thanh Hóa 28, U đầu rìu 75 Sử dụng phương pháp giải trình tự tự động trực tiếp máy ABI 3130, chúng tơi thu trình tự nucleotide mẫu thí nghiệm so sánh với đoạn trình tự X05380 [33] ngân hàng gen quốc tế Kết thể hình 16 35 36 Vị trí đột biến C-T 37 Hình 16 Trình tự 548 nucleotide đoạn gen TG5 theo chiều xuôi Kết tổng hợp từ giải trình tự theo chiều xi ngược, chúng tơi thành cơng giải trình tự đọan gen TG5 có kích thước 548 bp Trong trình tự mẫu thí nghiệm chúng tơi thấy điểm đa hình vị trí 373 tính theo chiều xuôi Đột biến C thành T xuất mẫu bò: Hà Giang 76, Bà Rịa 28, Brahman 98 Brahman 04 Đột biến phát enzym cắt giới hạn BstYI Như kết giải trình tự mẫu hồn tồn xác so với kết cắt enzym BstYI là: mẫu dị hợp TC mẫu đồng hợp CC Hình ảnh minh họa vị trí đột biến kiểu gen dị hợp CT vị trí tương đương không đột biến kiểu gen đồng hợp CC thể hình 17 18 Vị trí đột biến Hình 17 Trình tự chiều xi đoạn gen TG5 kiểu gen di hợp TC (đột biến C→T) 38 Hình 18 Trình tự chiều xi đoạn gen TG5 kiểu gen đồng hợp CC So sánh kết giải trình tự chúng tơi với trình tự X05380 ( trình tự vùng 5’ exon 1của gen TG5) công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI tác giả De Martynoff (1987) (hình 19) [17] Hình 19 Trình tự cấu trúc vùng 5’ exon1 gen TG5 theo De Martynoff (1987) 39 Chúng thấy đoạn trình tự mà chúng tơi nhân lên nằm hoàn toàn vùng 5’ trước exon gen (từ -849 đến – 301) khơng có khác biệt ngồi vị trí đột biến C thành T xuất mẫu kiểu gen dị hợp TC Như chứng tỏ trình tự đoạn gen TG5 bảo thủ nằm vùng điều khiển gen Cho nên hồn tồn dùng phương pháp PCR- RFLP với enzym cắt BstYI để phân tích đa hình gen TG5 giống bị Trên sở trình tự nucleotide đoạn gen TG5 thu được, chúng tơi minh họa vị trí cắt đoạn gen TG5 enzym BstYI alen C T sau: 75 bp 473 bp Alen T 75bp 295bp 178bp Alen C Hình 20 Vị trí cắt enzym BstYI đoạn gen TG5 theo chiều 5’-3’ Hai vị trí cắt enzym BstYI đoạn gen TG5 có trình tự nhận biết là: GGATCT -điểm cắt khơng đa hình vị trí 75; AGATCC- điểm đa hình vị trí 373 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trên sở nghiên cứu sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa hình gen TG5 số nhóm giống bị Việt Nam rút số kết luận sau: Trong số 621 mẫu bị nhóm, giống tiến hành phân tích đa hình gen TG5 xác định kiểu gen CC CT với tần số tương ứng 98,1% 1,9% chưa phát cá thể mang kiểu gen TT Qua cho thấy tần số alen T – alen cho có liên quan đến tính trạng mỡ giắt quần thể bò vàng Việt Nam thấp (xấp xỉ 1%) Sự khác đa hình gen TG5 nhóm bị vàng Việt Nam khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0.05) so sánh nhóm bị vàng với bị lai Sind bị Brahman khác có ý nghĩa với độ tin cậy 99% (p < 0.01) Trong trình tự đoạn gen TG5, phát điểm đa hình biến đổi C thành T vị trí 373 mẫu có kiểu gen dị hợp CT Kết hoàn toàn tương đồng với kết cắt đoạn gen TG5 enzym BstYI phương pháp PCR-RFLP để phân tích đa hình Kiến nghị Để có đánh giá đầy đủ tính đa hình di truyền gen TG5 chúng tơi có số kiến nghị sau Tiến hành ghép đơi đực giống có kiểu gen TC với bị có kiểu gen TC nhằm theo dõi đa hình di truyền qua đời Cần tiến hành mổ khảo sát để xác định mối tương quan đa hình gen TG5 với đặc điểm mỡ giắt bò vàng Việt Nam 41 Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Kim Đường (2008), “Một số vấn đề trạng chăn nuôi bị Nghệ An”, Tạp chí Khoa học, Cơng nghệ Chăn nuôi, Số 13, tr 12-19 Võ Thị Thương Lan (2005), Sinh học phân tử, NXB ĐHQG, Hà Nội Đinh Đoàn Long (2009), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, Nhà xuất đại học Quốcgia Hà Nội Lê Đình Lương (1998), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội Lê Viết Ly, Hoàng Kim Giao, Mai Văn Sánh, Võ Văn Sự Lê Minh Sắt, (1999), Bảo tồn nguồn gen vật nuôi Việt Nam, Tập I, Phần gia súc, NXB Nông nghiệp Nguyễn Văn Niêm, Đỗ Hữu Hoan, Lưu Công Khánh Đỗ Xuân Cốn (2000),“Đặc điểm sinh học, khả sản xuất phát triển chăn ni bị vàng Hà Giang tỉnh miền núi phía Bắc”, Báo cáo khoa học chăn ni thú y 1999-2000 Nguyễn Văn Niêm Lê Viết Ly (2006), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học bị U đầu rìu”, Báo cáo khoa học, tr 311-324 Võ Văn Sự, Nguyễn Văn Thiện, Đặng Tất Nhiễm, Lê Viết Ly, Nguyễn Viết Hải, Hoàng Văn Tiệu (2004), Át lát giống vật nuôi Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen Nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Nhữ Văn Thụ (2001), “Microsatellites”, Thông tin KHKT Chăn nuôi, Số 1, tr.46- 51 11 http://www.cucchannuoi.gov.vn/?index=s&id=409 42 Tài liệu tiếng Anh 12 Ailhaud G., Grimaldi P and Negrel R (1992), “Cellular and molecular aspects of adipose tissue development”, Annu Rev Nutr 12, pp 207-233 13 Barendse W (1997), Assessing lipid metabolism Patent Aplication WO9923248 PCT/AU98/00882 14 Barendse W., Bunch R., Thomas M., Armitage S., Baud S and Donaldson N (2001), “The TG5 DNA marker test for marbling capacity in Australian feedlot cattle”, Proceedings of the Beef Quality CRC Marbling Symposium, October 9-10, Coffs Harbour, pp: 30-35 15 Casas E., White S.N., Riley D.G., Smith T.P.L., Brenneman R.A., Olson T.A, Johnson D.D., Coleman S.W., Bennett G.L and Chase C.C (2005), “Assessing of single nucleotide polymorphisms in genes residing on chromosomes 14 and 29 for association with carcass composition traits in Bos indicus cattle”, J Anim Sci 83, pp.13-19 16 Casas E., White S.N., Shackelford., Wheeler T.L., Koohmaraie M., Bennett G.L and Smith T.P.L (2007), “Assessing the association of single nucleotide polymorphisms at the thyroglobulin gene with carcass traits in beef cattle”, J Anim Sci 85, pp 2807-2814 17 De Martynoff G, Pohl V Merken L et al (1987), “Structural organization of the bovine thyroglobulin gene and of its 5’-flanking region”, European Journal of Biochemistry, 164(3), pp 591-599 18 De, S., Macneil, M.D., Wu, X.L., Michal, L.L., Xiao, Q., Garcia, M.D., Griffin, K.B., Gaskins, C.T., Reeves, J.J., Busboom, J.R (2004), “Detection of quantitative trait loci for marbling and backfat in wagyu x limousin f2 crosses using a candidate gene approach”, Western Section of Animal Science Proceedings 55, pp 95-98 19 FAO (1995), Global project for the maintenance of domestic animal genetic diversity (MoDAD) Draft project formulation report, Food and Agriculture Organization of United Nations Rome 43 20 FAO (2002), Secondary Guidelines for Development of National Farm Animal Genetic Recourse Management Plans, Measurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD): Recommended Microsatellite Markers, Food and Agriculture Organization of the United Nation 21 Gintovt, V E., Podstreshny, A P., Mashurov, A P and Berendyaeva, Z I (1983), “Study of gene pool od the domestic fowl by the methods of immunogenetic analysis”, Genetika, 17, pp 873-882 22 Jiang, Z et al (2005), “Significant associations of the mitochondrial transcription factor A promoter polymorphisms with marbling and subcutaneous fat depth in Wagyu x Limousine F2 crosses”, Biochemical and Physiological Research Communications, 334, pp 516523 23 Kaplanová K., Dvořák J., Urban T (2009), “Association of single nucleotide polymorphisms in TG, LEP and TFAM genes with carcass traits in cross-breed cattle”, Proceedings of International Ph D Students Conference November 25, 2009 Brno, Czech Republic, pp 139 24 Mears, G.J., P.S Mir, D.R.C Bailey, and S.D.M Jones (2001), “Effect of Wagyu genetics on marbling, backfat, and circulating hormones in cattle”, Can J Anim.Sci, 81, pp 6573 25 Mina, N S., Sheldon, B L., Yoo, B H and Frankham, R (1990), “Heterozygosity at protein loci in inbred and outbred lines of chickens”, Poultry Science, 70, pp 1864-1872 26 Nikiforov, A A., Moiseyeva, I G and Zakharpv, I A (1998), “Position of Russian chicken breed in the diversity of Erasian breeds”, Genetics, 34, pp 850-851 27 Rincker C.B., Pyat N.A., Berger L.L., and Faulkner D.B (2006), “Relationship among GeneSTAR marbling marker, intramuscular fat 44 deposition and expected progeny differences in early weaned Simmental steer”, J Anim Sci, 85, pp 686-693 28 Romanov, M N (1999), “Goose production efficiency as influenced by genotype, nutrition and production systems”, World’s Poultry Science Journal, 55, pp 281-294 29 Thaller, G et al (2003), “DGAT1, a new positional and functional candidate gene for intramuscular fat deposition in cattle” Animal Genetics, 34, pp 354-357 30 Van Eenennaam A.L., Li J., Thallaman R.M., Quaas R.L., Dikeman M.E., Gill C.A., Franke D.E and Thomas M.G (2007), “Validation of commercial DNA test for quantitative beef quality traits”, J Anim Sci, 85, pp 891-900 31 http://www.bovingen.com 32 http://www.igenity.com 33 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X05380.1 34 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3032624 35 http://www.publish.csiro.au/issue/795.htm 45 ... cơng trình nghiên cứu đa hình di truyền gen TG5 giống bị Việt Nam Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu đa hình di truyền gen thyroglobulin (TG5) số nhóm bị vàng Việt Nam? ?? với... nghiên cứu nhóm bị vàng địa phương: bò vàng Lạng Sơn, bò vàng Hà Giang, bò vàng Thanh Hóa, bị vàng Nghệ An, bị U đầu rìu, bò vàng Phú Yên, bò vàng Bà Rịa Vũng Tàu Đồng thời chúng tơi nghiên cứu. .. phân tích đa hình gen TG5 số nhóm giống bị Việt Nam chúng tơi rút số kết luận sau: Trong số 621 mẫu bò nhóm, giống tiến hành phân tích đa hình gen TG5 xác định kiểu gen CC CT với tần số tương