Nhân dòng biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV 1 tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Loan NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1 TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời (Human immunodeficiency virus HIV) nguyên nhân gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ngƣời (AIDS) số virus gây bệnh nghiêm trọng HIV biến đổi liên tục cấu trúc hệ gen để kháng lại thuốc điều trị gây tỷ lệ tử vong cao Kể từ xuất (từ năm 1981) đến có khoảng 60 triệu ngƣời hành tinh bị nhiễm HIV, có khoảng 25 triệu ngƣời chết bệnh có liên quan đến AIDS AIDS trở thành bệnh gây chết nhiều ngƣời lịch sử loài ngƣời (UNAIDS, 2010) Theo tài liệu cơng bố, có hai type HIV gây nên AIDS HIV type (HIV-1) HIV type (HIV-2), nhƣng HIV-1 nguyên nhân gây AIDS ngƣời tồn giới Trong chu trình sống HIV-1, enzyme reverse transriptase, integrase protease có vai trị quan trọng khơng thể thiếu chép, đóng gói hình thành virus hồn chỉnh Vì vậy, chất ức chế enzyme đƣợc nghiên cứu, sản xuất để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS điều trị đƣợc gọi liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus (antiretroviral drug therapy, gọi tắt ART) Trong số enzyme nói trên, protease đƣợc mã hóa gen pol virus có chức cắt chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) vị trí định để tạo thành protein cấu trúc chức cần thiết cho virus hoàn chỉnh Nếu protease bị hoạt tính, HIV-1 khơng đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh (Darke tập thể, 1989) Tuy nhiên, tốc độ sinh sản nhanh HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus đƣợc tạo ngày tỷ lệ sai sót cao enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến bệnh nhân nhiễm bệnh chí chƣa điều trị Khi có ART, chủng mang đột biến kháng thuốc đƣợc chọn lọc trở thành chủng ƣu (Hoffmann tập thể, 2007) Mặc dầu, ngày có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV đƣợc phát triển thƣơng mại hóa nhƣng chƣa tìm đƣợc chất ức chế thực có hiệu Vì vậy, việc sản xuất tinh để thu đƣợc lƣợng lớn protease HIV-1 cho nghiên cứu điều tra, phát triển chất ức chế hiệu cần thiết Hiện nay, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 (đƣợc gọi tắt protease HIV-1) nhƣng thực tế cho thấy protease HIV-1 không dễ dàng đƣợc biểu tế bào vật chủ đặc tính gây độc tế bào, khó tan; lƣợng protease thu đƣợc sau biểu thƣờng thấp, số trƣờng hợp phát đƣợc phƣơng pháp miễn dịch với quy trình biểu hiện, tinh gồm nhiều bƣớc phức tạp Mặt khác, nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 phân lập từ phân nhóm B phân nhóm HIV phổ biến gây bệnh Mỹ, Australia nƣớc Tây Âu Trong khi, phần lớn trƣờng hợp nhiễm HIV-1 giới Việt Nam không thuộc phân nhóm B Những nghiên cứu gần cho thấy khác cấu trúc protease phân nhóm B so với phân nhóm khác dẫn đến hiệu điều trị thuốc ức chế protease (PI) mức độ kháng thuốc khác Chính vậy, thiết lập hệ thống biểu tinh protease HIV-1 tái tổ hợp hiệu đại diện cho phân nhóm HIV-1 gây bệnh chủ yếu Việt Nam có vai trò quan trọng việc nâng cao hiệu điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS Bên cạnh đó, đột biến kháng PI tƣơng đối đặc hiệu cho loại thuốc riêng biệt, thay loại thuốc khác trƣớc có tích lũy đột biến phác đồ sau thành cơng (Hoffmann tập thể, 2007) Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thƣờng theo hƣớng phát đột biến gen mã hóa protease HIV-1 có vai trị quan trọng việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS Ở Việt Nam, protease HIV-1 từ bệnh nhân Việt Nam vấn đề cịn đƣợc nghiên cứu Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ngƣời Việt Nam tìm số đột biến liên quan kháng thuốc Đặc biệt, chƣa có nghiên cứu biểu protease HIV-1 phân lập từ bệnh nhân ngƣời Việt Nam Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài “Nhân dòng, biểu nghiên cứu số tính chất protease từ HIV-1 Việt Nam” để tạo chế phẩm protease HIV-1 tái tổ hợp sử dụng cho mục đích sàng lọc phát triển chất ức chế nhân lên HIV, bƣớc làm sở phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Phát số đột biến gen mã hóa protease HIV-1 ngƣời Việt Nam - Thiết lập quy trình hiệu cho việc biểu gen mã hóa protease HIV-1 vi khuẩn E coli tinh protease HIV-1 tái tổ hợp dạng có hoạt tính - Nghiên cứu số tính chất protease HIV-1 tìm hiểu tác dụng số chất ức chế làm sở để tìm kiếm phát triển PI ứng dụng điều trị HIV/AIDS Đối tƣợng nội dung nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu đề tài: Gen mã hóa protease HIV-1 từ huyết bệnh nhân nhiễm HIV-1 Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng Nội dung nghiên cứu đề tài: - Tinh RNA HIV-1 tổng hợp cDNA số mẫu HIV-1 từ bệnh nhân nhiễm HIV-1 Việt Nam - Nhân bản, nhân dịng đọc trình tự gen mã hóa protease HIV-1 mẫu virus phân lập đƣợc, đánh giá sai khác trình tự gen mã hóa protease HIV-1 đối tƣợng bệnh nhân nhiễm HIV-1 so với trình tự gen tƣơng ứng giới - Thiết kế hệ thống vector xác định điều kiện biểu gen mã hóa cho protease HIV-1 E coli - Xây dựng quy trình tinh protease HIV-1 tái tổ hợp - Nghiên cứu số đặc trƣng xúc tác protease HIV-1 tái tổ hợp thu đƣợc - Tìm hiểu tác dụng ức chế số hợp chất tổng hợp tự nhiên lên protease HIV-1 tái tổ hợp Địa điểm thực đề tài Các nghiên cứu luận án đƣợc thực chủ yếu Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Đóng góp đề tài - Cơng trình nghiên cứu có tính hệ thống từ việc nhân bản, nhân dịng biểu E coli gen mã hóa protease HIV-1 tái tổ hợp thuộc chủng CRF01_AE Việt Nam; thiết lập đƣợc phƣơng pháp đơn giản để tinh protease HIV-1 với hiệu suất thu nhận enzyme cao so với nghiên cứu giới - Là cơng trình phát thấy tác dụng ức chế protease HIV-1 axit asiatic, 8-hydroxyquinoline menadione Ứng dụng thực tiễn đề tài - Cách thức biểu gen mã hóa protease HIV-1 tinh protease tái tổ hợp tạo cơng trình nghiên cứu dễ dàng đƣợc áp dụng để sản xuất số protease tái tổ hợp khó tan đặc hiệu với số chất định - Chế phẩm protease HIV-1 tạo sở cho việc tìm kiếm phát triển PI để ứng dụng điều trị bệnh nhân HIV/AIDS CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV-1 1.1.1 HIV-1 nguyên nhân AIDS Virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời (HIV) lần đƣợc Montagnier tập thể Viện Pasteur Paris phân lập vào năm 1983 với tên gọi ban đầu virus liên quan tới viêm hạch (LAV) Năm 1986, virus đƣợc Ủy ban Quốc tế thống gọi tên HIV (Greene, 2007) Cùng thời điểm ngƣời ta phân lập đƣợc virus Tây Phi đặt tên HIV–type 2, virus gốc HIV-type Hai loại virus làm suy giảm hệ thống miễn dịch ngƣời đặt tên chung HIV Mặc dù HIV-type có số điểm giống với HIV-type nhƣ cách thức truyền bệnh, hình thức nhiễm bệnh hội phƣơng pháp điều trị nhƣng ngƣời nhiễm HIV-type phát sinh bệnh so với nhiễm HIV-type HIV-type thấy chủ yếu vùng Châu Phi (Hoffmann tập thể, 2007) Vì vậy, HIVtype (HIV-1) đƣợc xem nhƣ nguyên nhân gây nên bệnh AIDS HIV thuộc họ retrovirus, họ gây ung thƣ cho ngƣời động vật HIV-1 có nhóm M (main), N (new), O (outlier) Có tới 90% lây nhiễm HIV tồn giới thuộc nhóm M; nhóm có phân type đƣợc ký hiệu chữ A-D, F-H, J, K nhiều dạng tái tổ hợp khác đƣợc gọi tắt phân nhóm CRF (circulating recombinant forms) Sự khác phân nhóm với phân nhóm khác trình tự axit amin protein vỏ vƣợt 30% Phân nhóm B phổ biến Mỹ, Tây Âu Australia; phân nhóm khơng phải nhóm B lại phân bố nƣớc phát triển châu Á châu Phi, nơi mà phần lớn ngƣời bị nhiễm sinh sống Sự đa dạng virus thấy vùng Sahara (châu Phi) Ở Việt Nam nƣớc Đơng Nam Á phân nhóm HIV-1 phân lập từ bệnh nhân nhiễm HIV-1 chủ yếu thuộc nhóm CRF01_AE, bên cạnh số phân nhóm B, C dạng tái tổ hợp khác (UNAIDS, 2010; Nguyen tập thể, 2003; Ishizaki tập thể, 2009; Phan tập thể, 2010) Phần lớn việc nghiên cứu để tìm thuốc điều trị bệnh HIV gây nên dựa phân nhóm B Tuy nhiên gần đây, đa dạng trình tự axit amin phân nhóm đƣợc xem nhƣ hƣớng nghiên cứu quan trọng đƣờng kháng thuốc PI (Bandaranayake tập thể, 2008) 1.1.2.Tình hình nhiễm HIV-1 Đại dịch HIV/AIDS thách thức to lớn tiến trình phát triển xã hội Sau thập kỷ phát mà nƣớc phát triển, HIV/AIDS lan rộng toàn giới, đặc biệt khu vực châu Phi nƣớc châu Á Đến chƣa có vaccine phịng ngừa HIV hay thuốc chữa trị đặc hiệu Theo chƣơng trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2010), đến cuối năm 2008 số ngƣời nhiễm HIV/AIDS sống giới tăng 20% so với năm 2000 tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS ƣớc tính cao gấp lần năm 1990 Số liệu tính đến cuối năm 2009 ƣớc tính khoảng 33,3 triệu ngƣời mang bệnh HIV/AIDS, số đối tƣợng nhiễm 2,6 triệu ngƣời có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân chết AIDS năm 2009 Ở Việt Nam, trƣờng hợp nhiễm HIV-1 đƣợc phát đầu năm 1990; năm 2000 đến 2007, số ngƣời nhiễm tăng gấp đôi từ 122.000 đến 290.000 ngƣời năm có khoảng 40.000 ngƣời nhiễm Tính đến ngày 30/9/2010 nƣớc có 180.631 trƣờng hợp nhiễm HIV/AIDS Thành phố Hồ Chí Minh địa phƣơng có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao với 23% tổng số bệnh nhân nƣớc (Liao tập thể, 2009; UNAIDS, Vietnam) Theo đánh giá chung, tình hình nhiễm HIV/AIDS có xu hƣớng giảm nhƣng đại dịch HIV/AIDS giai đoạn tập trung – xảy chủ yếu nhóm có hành vi nguy cao, đặc biệt nhóm tiêm chích ma túy mại dâm Theo phân tích chuyên gia, tổng số ngƣời nhiễm HIV sống tiếp tục gia tăng hệ hai tác động chủ yếu: Số ngƣời nhiễm HIV hàng năm toàn cầu cao kết tích cực liệu pháp điều trị kháng virus làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sống cho ngƣời bệnh 1.1.3 Sinh bệnh học nhiễm HIV-1 1.1.3.1 Cấu trúc hình thể HIV-1 Trên kính hiển vi điện tử, HIV-1 HIV-2 có cấu trúc gần nhƣ giống hồn tồn Chúng khác khối lƣợng protein nhƣ gen phụ trợ Cả HIV-1 HIV-2 nhân tế bào lympho CD4 gây bệnh ngƣời, mức độ suy giảm miễn dịch HIV-2 gây (Hoffmann tập thể, 2007) HIV-1 có kích thƣớc khoảng 120 nm, dạng cầu (hình 1.1) Vỏ ngồi virus lớp lipid kép với nhiều protein gắn vào nhô lên đƣợc ký Env Protein Env có phần chỏm đƣợc tạo thành từ phân tử glycoprotein có khối lƣợng phân tử 120 kDa (gp120) phần thân đƣợc tạo thành phân tử gp41 gắn với tạo thành phân tử gp160 đính vào lớp vỏ ngồi virus; gp160 đƣợc phát huyết nhƣ mô bạch huyết bệnh nhân HIV Trong q trình nảy chồi, virus gắn thêm protein từ màng tế bào vật chủ vào lớp lipoprotein virus, ví dụ protein HLA lớp I II, protein kết dính nhƣ ICAM-1 giúp virus gắn vào tế bào đích Protein p17 đƣợc gắn vào mặt màng lipoprotein Lõi có dạng hình trụ đƣợc bao bọc lớp capsid tạo thành từ 2.000 protein p24 (Hare, 2006; Hoffmann tập thể, 2007) Hình 1.1 Cấu trúc hạt HIV-1 (Hoffmann tập thể, 2007) 1.1.3.2 Tổ chức hệ gen virus Hệ gen HIV-1 nằm phần lõi virus bao gồm hai sợi RNA (+) đơn, sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb có gen mã hóa cho 15 protein khác (hình 1.2) So với virus khác thuộc họ retrovirus hệ gen HIV-1 phức tạp Trên sợi RNA có gen cấu trúc gag, pol env; gag có nghĩa “group-antigen” (kháng nguyên nhóm), pol “polymerase” env “envelope” (vỏ) Cấu trúc “cổ điển” gen retrovirus 5’LTR-gag-pol-envLTR 3’ Trong đó, vùng LTR (long terminal repeat hay đoạn lặp dài đầu cùng) hai đầu gen virus, nối với DNA tế bào vật chủ sau tích hợp khơng mã hóa cho protein virus Các gen gag env mã hóa cho nucleocapsid glycoprotein màng virus; gen pol mã hóa cho enzyme: reverse transcriptase, integrase protease Ngồi ra, HIV-1 cịn có gen (vif, vpu, vpr, tat, rev nef) vùng RNA kb (Hoffmann tập thể, 2007) Hình 1.2 Cấu tạo hệ gen HIV-1 (Hoffmann tập thể, 2007) Hình 1.2 Cấu tạo hệ gen HIV-1 (Hoffmann tập thể, 2007) 1.1.3.3 Chu trình nhân nhiễm HIV-1 Quá trình nhiễm HIV-1 tế bào vật chủ bắt đầu việc gắn phần virus lên bề mặt tế bào (hình 1.3) Quá trình đƣợc bắt đầu protein bề mặt vỏ gp120 gắn vào thụ thể bề mặt tế bào đích Nhiều trƣờng hợp thụ thể CD4 có tế bào lympho T có số tế bào khác nhƣ đại thực bào, bạch cầu đơn nhân hay tế bào lympho B Các tế bào có vai trị quan trọng hệ thống miễn dịch thể; chúng nhận diện, báo động huy động tế bào lympho công tiêu diệt vi sinh vật lạ vào thể Sự liên kết gp120 với CD4 để lộ vị trí khác trimer Env, sau gp120 liên kết với đồng thụ thể, thƣờng thụ thể chemokine CXCR4 CCR5 Tiếp phân tử gp41 qua thụ thể gắn vào màng tế bào đích hịa tan màng, HIV-1 cởi bỏ lớp vỏ lipid bên bơm vật liệu di truyền RNA với reverse transcriptase vào tế bào chất tế bào vật chủ Nhờ reverse transcriptase, sợi RNA virus đƣợc tổng hợp thành sợi DNA bổ sung (cDNA) Sợi RNA virus kết hợp cDNA thành chuỗi RNA/DNA – chuỗi lai chuyển thành sợi DNA xoắn mạch thẳng, sau chuyển thành DNA xoắn dạng vòng chui qua màng nhân vào nhân tế bào nhờ enzyme integrase, DNA kép virus đƣợc chèn vào DNA nhiễm sắc thể tế bào chủ DNA virus đƣợc hợp thành (hay gọi tiền virus, phân biệt với dạng virion) tồn trạng thái tiềm tàng nhiều nhiều năm trƣớc trở thành dạng hoạt động mà khơng biểu bệnh (Hare, 2006) Quá trình chép hệ gen virus đƣợc thực dƣới điều khiển phức tạp số protein, bao gồm Tat yếu tố chép DNA tế bào Chính việc gắn vật chất di truyền virus vào hệ gen làm thay đổi cấu trúc gen tế bào vật chủ DNA virus thị cho tế bào sản xuất RNA virus nhờ enzyme RNA polymerase Các RNA đƣợc nhân lên, protein virus đƣợc tổng hợp nhờ ribosome tế bào vật chủ, chúng di chuyển mạng lƣới nội chất màng tế bào, trình nảy chồi tạo thành virion nằm màng tách khỏi tế bào chủ, vào máu lại gắn vào tế bào lympho T khác Sự vận chuyển RNA virus đƣợc chép khỏi nhân phụ thuộc vào số nhân tố virus vật chủ có Rev; đƣợc vận chuyển nhân dƣới dạng vật liệu di truyền cho virion hay đƣợc nối phần toàn nhằm tổng hợp nên protein khác virus (Hare, 2006; Hoffmann tập thể, 2007) Bản DNA HIV Hình 1.3 Chu kỳ sống HIV-1 (Weiss, 2001) Các tế bào lympho T CD4+ bị nhiễm bị giết trực tiếp lƣợng lớn virus đƣợc sản sinh nảy chồi từ bề mặt, phá vỡ màng tế bào protein axit amin virus có mặt bên tế bào, cản trở hoạt động máy tế bào Mặt khác, tế bào lympho T CD4+ bị nhiễm rơi vào tình trạng 10 viii 128 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc hạt HIV-1 Hình 1.2 Cấu tạo hệ gen HIV-1 Hình 1.3 Chu kỳ sống HIV 10 Hình 1.4 Các thuốc chống HIV đích tác dụng 12 Hình 1.5 Mơ hình cấu trúc protease HIV-1 18 Hình 1.6 Cấu trúc kẹp trung tâm hoạt động protease HIV-1 19 Hình 1.7 Các vị trí cắt protease HIV-1 polyprotein gag gag-pol 25 Hình 1.8 Cơng thức hóa học chất ức chế với gốc chất P1/P1’ và vị trí gắn chúng S1/S1’ 37 Hình 1.9 Cơ chế kháng th́ c của đô ̣t biế n I50L 38 Hình 1.10 Cơ chế thủy phân protease HIV-1 43 Hình 2.1 Nguyên tắ c xác đinh ̣ hoa ̣t đô ̣ của protease HIV-1 sƣ̉ du ̣ng chấ t huỳnh quang 57 Hình 2.2 Cơng thức hóa học Nle (A) Nph (B) 59 Hình 3.1 Điện di sản phẩm RT-PCR lồng mẫu máu nhiễm không nhiễm HIV 61 Hình 3.2 Điện di gel agarose sản phẩm PCR kiểm tra kết biến nạp sử dụng cặp mồi pCR2.1-Fw/Rv (A) cặp mồi HIV-Fw/Rv2 (B) 62 Hình 3.3 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 thu đƣợc (pCR2.1-Prot) với trình tự chủng CRF01_AE miền Bắc Việt Nam (AB519612) 64 Hình 3.4 So sánh trình tự axit amin protease HIV-1 thu đƣợc (pCR2.1-Prot) với trình tự axit amin protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE miền Bắc Việt Nam (AB519612) 68 Hình 3.5 So sánh trình tự gen mã hóa protease HIV-1 từ bệnh nhân khác với đoạn gen tƣơng ứng chủng CRF01_AE miền Bắc Việt Nam (AB519612) Trung Quốc (EU518273) 68 Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt vector pET28a pCR2.1-Prot EcoRI NdeI 71 129 ix Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra vector pET28a mang gen mã hóa protease HIV-1 với cặp mồi T7-Fw/Rv 72 Hình 3.8 SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) phân đoạn tinh dich ̣ chiế t tế bào E coli BL21(DE3) mang pET28a-Prot qua cột Ni-agarose 74 Hình 3.9 SDS-PAGE kiểm tra độ protease HIV-1 biểu pET28aProt sau sắc ký qua cột Ni-agarose cột DE-52 cellulose 75 Hình 3.10 Hoạt tính cắt chất tổng hợp protease HIV-1 biểu pET28a 76 Hình 3.11 Trình tự mồi HIV-Fw3 HIV-Rv3 để biểu gen mã hóa protease HIV-1 hai hệ thống vector pET32a pET43a 78 Hình 3.12 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 sau gắn thêm trình tự tự cắt đƣợc nhân dịng vào vector pGEM-T (pGEM-Prot) với trình tự đoạn gen tƣơng ứng vector pCR2.1-Prot 79 Hình 3.13 Trình tự gen mã hóa protease HIV-1 vector pET32a-Prot (A) pET43a-Prot (B) 80 Hình 3.14 SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) dịch chiết tủa tế bào BL21 (DE3) plysS mang pET32a-Prot vàBL21 (DE3) plysS mang pET43a-Prot 81 Hình 3.15 Kiểm tra độ tinh protease HIV-1 biểu hệ thống pET32a-Prot SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) sau sắc ký qua cột His-bind 84 Hình 3.16 Hoạt tính cắt chất tổng hợp protease HIV-1 tái tổ hợp biểu pET32a-Prot sau tinh qua cột His-bind 85 Hình 3.17 Trình tự mồi ngƣợc HIV-Rv4 HIV-Rv5 để cải tiến biểu protease HIV-1 86 Hình 3.18 (A, B, C, D) Kết đọc trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 các vector pET32a-Prot-HA-His (A), pET32a-Prot-TEV-HA-His (B), pET43a-Prot-HA-His (C) pET43a-Prot-TEV-HA-His (D) 87 Hình 3.19 SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu protease HIV-1 hệ thống vector pET32a pET43a cải tiến 89 Hình 3.20 SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra mức độ hòa tan protease HIV-1 phân đoạn tủa tế bào nồng độ urea khác 92 x 130 Hình 3.21 SDS-PAGE kiểm tra độ tinh protease HIV-1 biểu hệ thống pET32a-Prot-HA sau sắc ký qua cột His-bind 93 Hình 3.22 Sắc ký đồ tinh protease HIV-1 từ dịch hòa tan tủa tế bào hệ thống cột mono Q - sepharose (A) cột His-bind (B) mắc nối tiếp 94 Hình 3.23 SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) phân đoạn sắc ký dịch hòa tan tủa tế bào chứa protease HIV-1 tái tổ hợp qua cột mono Q-sepharose His-bind 95 Hình 3.24 SDS-PAGE protease HIV-1 sau hồi tính 96 Hình 3.25 Hoạt tính cắt chất tổng hợp đặc hiệu protease HIV-1 tái tổ hợp tinh 97 Hình 3.26 Nhiệt độ hoạt động tối thích (A) độ bền với nhiệt (B) protease HIV-1 tái tổ hợp 100 Hình 3.27 pH hoạt động tối thích protease HIV-1 tái tổ hợp 101 Hình 3.28 Đồ thị phụ thuộc tốc độ phản ứng thủy phân chất tổng hợp protease HIV-1 tái tổ hợp vào nồng độ chất 103 Hình 3.29 Ảnh hƣởng các hợp chất khác lên hoạt độ thủy phân chấ t protease HIV-1 tái tổ hợp 105 131 xi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome) APS Ammonium Persulphate ART Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus (Antiretroviral drug therapy) -ME -mercaptoethanol bp Cặp bazơ (base pair) BSA Protein huyết bò (Bovine Serum Albumin) CRF Dạng tái tổ hợp lƣu hành (circulating recombinant form) CBB Coomassie Brilliant Blue CDC Trung tâm Kiểm soát Phòng ngừa dịch bệnh (Mỹ) (The Center for Disease Control and Prevention) DABCYL 4-(4-Dimethylaminophenylazo) Benzoic Acid Đê ̣m A Tris HCl 20 mM pH 7,9, NaCl 100 mM, PMSF mM, imidazol 5mM Đê ̣m B Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 100 mM, Triton X-100 1% Đệm C Tris-HCl 20 mM pH 7,9 NaCl 100 mM, urea 8M, imidazol mM Đệm D Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 50 mM, DTT mM, -ME mM, glycerol 5% dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate ddH2O Nƣớc cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H2O) DTT Dithiothreitol EDANS 5-[(2-Aminoethyl) amino] naphthalene-1-sulfonic acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FDA Cục Quản lý thực phẩm thuốc (Mỹ) (Food and Drug Administration) HAART Liệu pháp kháng retrovirus hiệu lực cao (Highly Active Anti-Retroviral Therapy) 132 vi HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời (Human immunodeficiency virus) IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa Kilodalton KLPT Khối lƣợng phân tử LB Luria Bertani MCS Trình tự nhân dịng đa điểm cắt (Multiple Cloning Sequence) MES 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid MOPS 3-(N-orpholino) propanesulfonic acid NNRTI Các chất ức chế reverse transcriptase nucleoside (Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor) NRTI Các chất ức chế reverse transcriptase dạng nucleoside (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor) OD Mật độ quang học (Optical Density) PAGE Điện di gel polyacrylamide (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) PBS Đệm phosphate có muối (Phosphate buffered saline) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) PI Chất ức chế protease (Protease inhibitor) PMSF Phenyl Methylsulphonyl Fluoride PVDF Polyvinylidere Fluoride SDS Sodium Dodecylsulphate TEMED N, N, N’,N’- Tetramethyl-Ethylenediamine X-gal 5-Bromo-4 chloro-3-indolyl--D galactopyranoside UNAIDS Chƣơng trình HIV/AIDScủa Liên hợp quốc (United Nations Program on HIV/AIDS) 133 vii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trin ̀ h nghiên cƣ́ u của riêng Các số liệu, kế t nêu luận án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác NCS Nguyễn Thị Hồng Loan NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Thị Hồng Loan 134 LỜI CẢM ƠN Lời đầ u tiên , cho phép được bày tỏ lòng biế t ơn sâu sắ c nhấ t tới PGS TS Phan Tuấ n Nghiã ; người thầ y đã tận tình hướng dẫn , giúp đỡ , tạo điề u kiê ̣n thuận lợi nhấ t cho suố t quá trình làm thực nghiê ̣m và viế t luận án Người thầ y đã dìu dắ t và bồ i dưỡng cho những đức tính cầ n thiế t của một người làm công tác nghiên cứu khoa học từ những ngày đầ u làm quen với khoa học Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới TS Nguyễn Thi ̣ Vân Anh đã chỉ dẫn và giúp đỡ quá trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình và tạo điề u kiê ̣n về thời gian của Ba n Chủ nhiê ̣m Khoa Sinh học và PGS TS Bùi Phương Thuận các thầ y, cô giáo , anh chị , bạn bè đồng nghiệp Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa sinh và Khoa Sinh học thành viên nhóm nghiên cứu Phòng Protein tái tở hợp, Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein , Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tôi xin gửi lời cảm ơn tới: Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học và Phòng chức Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo đ iề u kiê ̣n hoàn thành các thủ tục cần thiết c nghiên cứu sinh, Đề tài KLEPT 09.01 hỗ trợ toàn kinh phí để thực luận án ; Bê ̣nh viê ̣n Bê ̣nh Nhiê ̣t đới Trung ương đã cung cấ p mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HIV ; Trung tâm Khoa học Vật liê ̣u , Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã cho phép và giúp đỡ sử dụng ̣ thố ng máy quang phổ huỳnh quang Tôi xin bày tỏ lòng biế t ơn tới bậc bố , mẹ; chồ ng con, gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, đợng viên, dành tình cảm và điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận án NCS Nguyễn Thị Hồng Loan 135 PHỤ LỤC ii Danh sách bệnh nhân nhiễm HIV-1 đƣợc lấy mẫu cho nghiên cứu luận án STT Tên bệnh nhân Năm sinh Ký hiệu mẫu ART Đỗ Ngọc C 1982 BN1 Phạm Thị T 1978 BN2 Nguyễn Thị H 1980 BN3 Vũ Hồng C 1985 BN4 Nguyễn Văn T 1976 BN5 Hoàng Thị G 1984 BN6 Trần Quốc T 1975 BN7 Lê Bạch D 1985 BN8 Nguyễn Tiến D 1978 BN9 10 Trần Thu H 1977 BN10 11 Bùi Bích V 1980 BN11 12 Lƣu Thu H 1981 BN12 13 Đồng Thanh H 1983 BN13 14 Nguyễn Hồng H 1982 BN14 15 Bùi Quang T 1974 BN15 16 Lại Thị T 1985 BN16 17 Trần Lê H 1979 BN17 136 STT Tên bệnh nhân Năm sinh Ký hiệu mẫu ART 18 Nguyễn Tùng N 1967 BN18 19 Trần Hải S 1970 BN19 20 Hồng Bình P 1974 BN20 21 Nguyễn Ngọc A 1944 BN1* PI 22 Nguyễn Hà T 1967 BN2* PI 23 Quách Thành L 1978 BN3* PI 24 Nguyễn Xuân T 1976 BN4* PI 25 Nguyễn Thị Minh N 1976 BN5* PI 26 Phạm Thị B 1973 BN6* PI 27 Nguyễn Văn T 1982 BN7* PI 28 Nguyễn Xuân D 1982 BN8* PI 29 Nguyễn Thị T 1979 BN9* PI 30 Tạ Thành L 1978 BN10* PI 31 Nguyễn Quyết T 1979 BN11* PI 32 Lê Đình T 1971 BN12* PI 33 Trần Thị H 1974 BN13* PI 34 Nguyễn Thị L 1975 BN14* PI 35 Nguyễn Thị D 1974 BN15* PI 36 Phan Hà S 1973 BN16* PI 37 Nguyễn Thị T 1977 BN17* PI 137 STT Tên bệnh nhân Năm sinh Ký hiệu mẫu ART 38 Nguyễn Anh T 1971 BN18* PI 39 Nguyễn Thị G 1982 BN19* PI 40 Trần Minh S 1972 BN20* PI 41 Phạm Minh D 1961 BN21* PI 42 Nguyễn Văn B 1977 BN22* PI 43 Trần Văn T 1969 BN23* PI 44 Hoàng Thị H 1969 BN24* PI 45 Phùng Văn H 1978 BN25* PI 46 Lê Bá T 1967 BN26* PI 47 Trần Anh T 1977 BN27* PI 48 Hoàng Thị N 1978 BN28* PI 49 Trung Việt T 1977 BN29* PI 50 Nguyễn Hữu Đ 1974 BN30* PI Ghi chú: Bệnh nhân điều trị PI 138 PHỤ LỤC Kết đo A260 nm A280 nm, đánh giá số A260/280 định lƣợng RNA sau tinh từ huyết bệnh nhân nhiễm HIV-1 Ghi chú: Số thứ tự (STT) bảng phụ lục tương ứng với số thứ tự tên bệnh nhân bảng phụ lục 139 PHỤ LỤC Trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc phân tích 140 PHỤ LỤC Sơ đồ vector pET28a, pET32a pET43a 141 PHỤ LỤC Kế t quả phân tić h protease HIV-1 tinh sa ̣ch hệ thống khối phổ MALDITOF-TOF Viện Khoa học Công nghệ tiên tiến Hàn Quốc (KAIST) 142 ... hóa protease HIV- 1 có vai trò quan trọng việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/ AIDS Ở Việt Nam, protease HIV- 1 từ bệnh nhân Việt Nam vấn đề cịn đƣợc nghiên cứu Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào... tài ? ?Nhân dịng, biểu nghiên cứu số tính chất protease từ HIV- 1 Việt Nam? ?? để tạo chế phẩm protease HIV- 1 tái tổ hợp sử dụng cho mục đích sàng lọc phát triển chất ức chế nhân lên HIV, bƣớc làm sở... cDNA số mẫu HIV- 1 từ bệnh nhân nhiễm HIV- 1 Việt Nam - Nhân bản, nhân dịng đọc trình tự gen mã hóa protease HIV- 1 mẫu virus phân lập đƣợc, đánh giá sai khác trình tự gen mã hóa protease HIV- 1 đối