Biểu hiện β galactosidase trong vi khuẩn bacillus subtilis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thúy BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG VI KHUẨN Bacillus subtilis TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 Sơ lƣợc vi khuẩn B subtilis 1.1 Lịch sử, đặc điểm phân loại theo hệ thống Bergey, đặc điểm hình thái phân bố vi khuẩn B subtilis .2 1.2 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn B subtilis .3 1.3 Cấu trúc genome .5 1.4 Tính an toàn ứng dụng B subtilis Cấu trúc operon lac, gen lacZ β- galactosidase 2.1 Cấu trúc operon lac 2.2 Gen lacZ β-galactosidase 12 Vector biểu gen vi khuẩn 16 3.1 Đặc điểm plasmid 16 3.2 Những vector tách dòng vector biểu E coli 18 3.3 Vector biểu B subtilis 21 3.3.1 Hệ thống vector biểu pHT 21 3.3.2 Hệ thống vector biểu pAL .22 3.4 Cài nhập vector biểu vào B subtilis 22 3.4.1 Cơ chế trình cài nhập vào B subtilis 23 3.4.2 Các kiểu cài nhập vào B subtilis 24 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 27 2.1 Nguyên liệu thiết bị 27 2.1.1 Tế bào plasmid 27 2.1.2 Hóa chất 28 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 29 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 29 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 30 2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 30 2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 31 2.2.4 Các phương pháp hóa sinh 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Thiết kế vector pUL1(PrrnO-RBS (spoVG)) dựa vector pET28b 37 3.2 Nhân dịng gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase vector pUL1 41 3.2.1 Khuếch đại gen lacZ từ vector pDG268 41 3.2.2 Nhân dòng gen lacZ vector pUL1 42 3.3 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ vector pDG364 tạo pUL2 44 3.3.1 Khuếch đại đoạn DNA gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ pUL1 44 3.3.2 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ vector pDG364 46 3.4 Cài nhập đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ vector pDG364 vào genome B subtilis PY79 kiểm tra cài nhập 48 3.4.1 Cài nhập đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ vector pDG364 vào genome vi khuẩn B subtilis 48 3.4.2 Kiểm tra cài nhập 49 3.5 Xác định hoạt độ enzyme β-galactosidase 50 3.5.1 Xác định hoạt tính β-galactosidase chất X-gal 51 3.5.2 Xác định hoạt độ β-galactosidase với chất ONPG 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 KẾT LUẬN: 54 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh B subtilis [41, 68] Hình 1.2 Hình ảnh bào tử B subtilis với độ phóng đại khác [69, 76, 77] Hình 1.3 Cơ chế thủy phân enzyme β- galactosidase .10 Hình 1.4 Cấu trúc operon lac [70] 10 Hình 1.5 Cơ chế điều hòa operon lac .12 Hình 1.6 Cấu trúc β-galactosidase E coli [66, 67] .13 Hình 1.7 Cơ chế thủy phân X-gal enzyme β-galactosidase [71] 14 Hình 1.8 Sơ đồ minh họa tế bào vi khuẩn chứa plasmid bên 16 (1) DNA nhiễm sắc thể, (2) Plasmid 16 Hình 1.9 Mơ hình đoạn DNA vector pHV32 đƣợc chèn vào nhiễm sắc thể B subtilis [35] 23 Hình 1.10 Mơ hình trao đổi chéo đơn (single crossover) minh họa việc sử dụng vector cài nhập để xây dựng đột biến knockout khung đọc mở (orfA) [11] 24 Hình 1.11 Mơ hình trao đổi chéo kép (double crossover) minh họa việc sử dụng vector cài nhập (ectopic integration vector) để chèn khung đọc mở (orfA) vào vị trí đích nhiễm sắc thể vi khuẩn B subtilis [11] .25 Hình 3.1 Kết khuếch đại đoạn PrrnO từ genome B subtilis .38 Hình 3.2 Sơ đồ tạo vector pUL1 .39 Hình 3.3 Kết PCR colony kiểm tra đoạn chèn PrrnO khuẩn lạc thu đƣợc .40 Hình 3.4 Kết khuếch đại đoạn lacZ từ vector pDG268 42 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR colony kiểm tra đoạn lacZ chèn plasmid pUL1 khuẩn lạc 43 Hình 3.6 Kết điện di gel agarose 1% kiểm tra sản phẩm chèn lacZ vào pUL1 44 Hình 3.7 Kết PCR khuếch đại đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ từ pUL1-lacZ 45 Hình 3.8 Sơ đồ tạo vector pUL2 .46 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm cắt pUL2 47 Hình 3.10 Sơ đồ cài nhập đoạn PrrnO- RBS (spoVG)-lacZ từ vector pUL2 vào genome B subtilis PY79 49 Hình 3.11 Kết thử hoạt tính amylase mơi trƣờng tinh bột (0,1%) thể biến nạp 50 Hình 3.12 Kết thử hoạt tính β-galactosidasetrênđĩa có bổ sung X-gal 51 Hình 3.13 Xác định hoạt độ β-galactosidase chủng 2, thời điểm 12h 52 Hình 3.14 Biểu đồ hoạt độ β-galactosidase thể tái tổ hợp thời điểm khác 52 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số vi sinh vật có khả tổng hợp enzyme β-galactosidase [50] 15 Bảng 1.2 Một số vector thƣơng mại dùng tách dòng biểu E coli [75] 20 Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng 27 Bảng 2.3 Thành phần loại đệm dung dịch 28 Bảng 2.4 Các thiết bị thí nghiệm 29 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 2.6 Các thành phần, điều kiện phản ứng nối ghép gen 33 Bảng 3.1.Thành phần, điều kiện phản ứng PCR PrrnO 38 Bảng 3.2 Thành phần điều kiện phản ứng PCR lacZ 41 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt lacZ pUL1 42 Bảng 3.4.Thành phần phản ứng nối lacZ pUL1 43 Bảng 3.5 Thành phần điều kiện phản ứng PCR PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ 45 Bảng 3.6 Thành phần điều kiện cắt pDG364 48 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ CÁC TỪ VIẾT TẮT amyEb Phần gen amyE phía sau amyEf Phần gen amyE phía trƣớc β-gal β-galactosidase BGSC Bacillus Genetic Stock Center BLAST Basic local alignment search tool bp base pair CFU Colony forming unit dNTP 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate DSM Difco Sporulation Medium E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl β-D- thiogalactoside kbp Kilo base pair kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani M Marker MCS Multiple cloning site NAD Nicotinamide adenine dinucleotide OD Optical density ONPG Ortho-netrophenol-β-galactosidase PCR Polymerase Chain Reaction RBS Ribosome binding site rRNA Ribosome Ribonucleic acid Sol Solution TAE Tris - Acetate - EDTA U Unit v/v volume/volume w/v Weight/volume X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ MỞ ĐẦU Hiện nay, phần lớn hệ vector (cả hệ vector nhân dòng vector biểu hiện) cho Escherichia coli đƣợc thƣơng mại hóa [75] Tuy nhiên, E coli đƣợc xem sinh vật có khả gây bệnh tiết độc tố Chính vậy, việc sử dụng E coli nhƣ tế bào vật chủ để biểu gen nhiều hạn chế Bên cạnh đó, Bacillus subtilis, đại diện tiêu biểu nhóm vi sinh vật Gram dƣơng, với vai trị tế bào vật chủ, thể nhiều ƣu điểm so với E coli Đó khả khơng gây bệnh (B subtilis đƣợc Hiệp hội Thuốc Thực phẩm Mỹ FDA coi “genereally regarded as safe”- GRAS) khả chịu đựng điều kiện nuôi cấy, bảo quản khắc nghiệt [18, 25] Trong nghiên cứu bản, B subtilis đƣợc sử dụng nhƣ mơ hình để nghiên cứu khả biệt hố chế điều hoà hoạt động gen tế bào [24] Trong hƣớng phát triển vacxin hệ mới, B subtilis đƣợc phát nghiên cứu nhƣ cơng cụ chuyển kháng ngun an tồn tiềm [19, 17, 59] Mặc dù có nhiều ƣu điểm với vai trò tế bào vật chủ so với E coli nhƣng vector thƣơng phẩm dùng cho việc tách dòng biểu gen sử dụng cho vi khuẩn B subtilis chƣa xuất rộng rãi thị trƣờng Nguyên nhân gen ngoại lai cần đƣợc cài nhập thẳng vào nhiễm sắc thể vi sinh vật này, gen ngoại lai cần phải có đầy đủ yếu tố cần thiết cho việc biểu gen Ở Việt Nam, thời điểm có cơng trình nghiên cứu biểu gen B subtilis nhƣ biểu gen vỏ bào tử [14], biểu gen tế bào sinh dƣỡng, có sử dụng chất cảm ứng IPTG [7] chƣa có nghiên cứu công bố việc biểu gen tế bào sinh dƣỡng B subtilis mà không cần sử dụng chất cảm ứng Do đó, chúng tơi thực đề tài: “Biểu β-galactosidase vi khuẩn B subtilis” với mục đích biểu gen tế bào sinh dƣỡngs, mà khơng cần sử dụng chất cảm ứng nhằm góp phần mở rộng khả ứng dụng vi sinh vật an toàn lĩnh vực nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sơ lƣợc vi khuẩn B subtilis 1.1 Lịch sử, đặc điểm phân loại theo hệ thống Bergey, đặc điểm hình thái phân bố vi khuẩn B subtilis Vào năm 1835, vi khuẩn B subtilis (tên ban đầu Vibrio subtilis) đƣợc phát Christian Gottfried Ehrenberg Sau đó, (năm 1872) Ferdinand Cohn phân loại đổi tên thành B subtilis [69] B subtilis vi khuẩn đƣợc nghiên cứu nhƣ mơ hình q trình biệt hóa phát triển tế bào Theo hệ thống phân loại Bergey (1994) B subtilis thuộc: Giới (regnum): Bacteria Ngành (divisio): Firmicutes Lớp (class): Bacilli Bộ (ordo): Bacillales Họ (familia): Bacillaceae Chi (genus): Bacillus Loài: B subtilis Năm 2011, Rooney cộng phát thêm chủng loài B subtilis B subtilis subsp inaquosorum Nhƣ vậy, có ba phân lồi (subspecies) B subtilis subsp inaquosorum, B subtilis subsp spizizenii B subtilis subsp subtilis [69, 10, 56] B subtilis trực khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, bắt màu tím Gram dƣơng, kích thƣớc 0,41-0,58 µm X 1,5–3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn B subtilis có khả di động (có từ - 12 tiên mao) có khả sinh nội bào tử (hình bầu dục nhỏ tế bào vi khuẩn nằm tế bào) B subtilis có khả thích nghi với mơi trƣờng cách hấp thu DNA ngoại lai tạo DNA tái tổ hợp nội bào tử B subtilis phát triển cách nảy chồi [13, 72] Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ Hình 1.1 Hình ảnh B subtilis [41, 68] B subtilis tế bào hình que, tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, đƣợc tìm thấy tự nhiên đất thảm thực vật mục, thực phẩm hỏng, khơng khí đƣờng tiêu hóa ngƣời động vật Số lƣợng vi khuẩn B subtilis đất khoảng 106 - 107 CFU/g [72] Nhiệt độ tối ƣu để phát triển 250C đến 350C [72] Khi gặp điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt, B subtilis có khả hình thành bào tử Thơng thƣờng đến 60% B subtilis tìm thấy đất tồn dạng bào tử [72] Vi khuẩn B subtilis vi khuẩn hiếu khí Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy B subtilis thực phát triển điều kiện yếm khí [44] Các vi khuẩn tạo ATP điều kiện yếm khí thơng qua q trình lên men butanediol hay sử dụng ammoni nitrate [44] B subtilis khác với vi khuẩn yếm khí tùy ý khác chỗ trải qua q trình lên men khơng có chất nhận điện tử bên [72] Trong trình lên men, tái tạo NAD+ chủ yếu qua chất trung gian lactate dehydrogenase (đƣợc tìm thấy tế bào chất) Lactate dehydrogenase chuyển hóa pyruvate thành lactate [72] 1.2 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn B subtilis Trong điều kiện môi trƣờng khơng thuận lợi, vi khuẩn B subtilis hình thành nội bào tử Nội bào tử trung tâm có kích thƣớc 0,5-0,8 X 0,4 µm Bào tử trƣởng thành có hình trịn hay hình elip, với chiều dài khoảng 1,5-1,8 µm, có Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ 3.5.1 Xác định hoạt tính β-galactosidase chất X-gal Các khuẩn lạc đáp ứng tiêu chí sàng lọc với chủng đối chứng âm dƣơng đƣợc ni cấy đĩa thạch DSM có chứa chất X-gal kháng sinh chloramphenicol (50 µg/ml) Kết đƣợc thể hình 3.12 pBluescript PY Hình 3.12 Kết thử hoạt tính β-galactosidasetrênđĩa có bổ sung X-gal pBluescript chủng E coli DH5α đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng vector chứa gen lacZ, có khả sinh tổng hợp β-galactosidase sinh trƣởng thành khuẩn lạc màu xanh Ngƣợc lại, chủng B subtitlis PY79 đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng âm khơng có gen lacZ nên khơng có khả sinh tổng hợp βgalactosidase sinh trƣởng thành khuẩn lạc màu trắng Các khuẩn lạc số 2, 4, khuẩn lạc chứa gen lacZ, chúng có khả tổng hợp βgalactosidase sinh trƣởng thành khuẩn lạc màu xanh Phƣơng pháp cho phép xác định định tính β-galactosidase nên để xác định xác hoạt độ enzyme β-galactosidase tiến hành phƣơng pháp xác định hoạt độ chất ONPG 3.5.2 Xác định hoạt độ β-galactosidase với chất ONPG Các khuẩn lạc đƣợc chuyển sang nuôi lắc mơi trƣờng DSM có bổ sung chloramphenicol nồng độ 50 µg/ml, tốc độ lắc 150 vịng/phút 370C Tại thời điểm 51 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ 12h thu dịch xác định hoạt độ β-galactosidase với chất ONPG Kết thu đƣợc nhƣ sau: Khuẩn lạc PY Chất 12,43 11,18 10,73 0,38 So màu sản phẩm ONPG bị phân giải βgalactosidase Hoạt độ (U/ml) Hình 3.13 Xác định hoạt độ β-galactosidase chủng 2, thời điểm 12h Dựa hoạt độ β galactosidase chủng khuẩn lạc số 2, 4, (khác biệt rõ rệt so với chủng B subtilis PY79), khẳng định biểu thành cơng gen mã hóa cho β galactosidase tế bào sinh dƣỡng vi khuẩn B subtilis Hoạt độ β-galactosidase chủng thời điểm 6h, 12h, 24h, 36h, 48h 60h đƣợc thể hình 3.14 Hình 3.14 Biểu đồ hoạt độ β-galactosidase thể tái tổ hợp thời điểm khác 52 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ Qua biểu đồ nhận thấy chủng có hoạt độ β-galactosidase tăng nhanh biểu cao thời điểm 12h, bắt đầu giảm mạnh thời điểm sau (24h, 36h, 48h 60h) Hoạt độ β-galactosidase tỉ lệ thuận với pha sinh trƣởng B subtilis PY79 Nghiên cứu Nguyễn Thị Hải Yến hoạt độ β-galactosidase thu đƣợc từ chủng vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16 thời điểm 12h, 24h, 36h, 48h 60h có giá trị thấp 238,98 mU/ml cao 393,39 mU/ml [9] Kết xác định hoạt độ β-galactosidase thu đƣợc từ khuẩn lạc thời điểm 12h, 24h, 36h, 48h 60h tƣơng ứng có giá trị thấp 1860 mU/ml cao 12430 mU/ml So sánh hoạt độ βgalactosidase hai kết kết luận hoạt độ β-galactosidase thu đƣợc từ khuẩn lạc cao hẳn so với hoạt độ β-galactosidase sinh từ nguồn vi khuẩn tự nhiên So sánh với nghiên cứu biểu β-galactosidase E coli BL21 Onladda J (2009) biểu gen mã hóa cho β-galactosidase vector pET21a(+) có sử dụng chất cảm ứng IPTG mM hoạt độ β-galactosidase cao 14000 mU/ml [53] Hoạt độ β-galactosidase thu đƣợc không sử dụng chất cảm ứng IPTG thấp không đáng kể Nhƣ nói chúng tơi biểu thành công β-galactosidase tế bào sinh dƣỡng B subtilis PY79 mà không cần sử dụng chất cảm ứng 53 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Thiết kế thành công vector pUL1 mang đoạn promoter PrrnO vị trí bám ribosome gen spoVG biểu B subtilis PY79 dựa pET28b Nhân dịng thành cơng gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase vector pUL1 Nhân dịng thành cơng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ vector pDG364 Cài nhập biểu thành cơng gen mã hóa cho β-galactosidase tế bào sinh dƣỡng chủng B subtilis PY79 mà không cần sử dụng chất cảm ứng KIẾN NGHỊ Tiến hành tinh đánh giá tính chất lý hóa β-galactosidase Biểu thêm số chất có hoạt tính mong muốn tế bào sinh dƣỡng B subtilis PY79 mà không sử dụng chất cảm ứng 54 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Ngọc Ân, Nguyễn Thị Thu Trang, Nguyễn Thanh Tố Nhi, Hồ Thị Nguyệt Thu, Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thu Hoa (2009) , “Tác dụng in vitro kháng virus gây bệnh kháng Gumboro tả gà Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu interferon anpha gà”, Tuyển tập Hội nghị CNSH tồn quốc Khu vực phía Nam 2009, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 376-381 Võ Thị Thƣơng Lan (2006), Một số vấn đề sinh học phân tử, NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Công nghệ DNA tái tổ hợp, NXB ĐH Quốc Gia TP HCM, TP HCM Đinh Đoàn Long Đỗ Lê Thăng (2008), Cở sở di truyền học phân tử tế bào, NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội Phạm Thị Tuyết Ngân, Vũ Ngọc Út, Trƣơng Quốc Phú Nguyễn Hữu Hiệp (2011), “Ảnh hƣởng vi khuẩn hữu ích lên yếu tố môi trƣờng tôm sú (Penaeus monodon) ni bể”, Tạp chí Khoa học ĐH Cần Thơ, 20b, tr 59-68 Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Trần Văn Giang (2008), “Nhân dòng phân tích trình tự gene mã hố β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 908, Hà Nội Trần Linh Thƣớc, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Thị Minh Phƣợng, Võ Minh Trí (2008), “Cấu trúc chủng Bacillus subtilis biểu mini-proinsulin dạng tiết môi trƣờng”, Hội nghị khoa học tồn quốc lần IV: Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ, nông , sinh, y học công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 55 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hồng Vân Bùi Thị Việt Hà (2011), Di truyền học vi sinh vật nhân sơ virus, NXB giáo dục Việt Nam, Hà Nội Nguyễn Thị Hải Yến (2003), Khảo sát đặc tính khả thu nhận enzym -galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16, luận văn thạc sỹ sinh học, ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐHQGHN, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 10 Ashlee M E., Richard L., Roberto K (2006), “ Bacillus subtilis Genome Diversity”, Journal of bacteriology, 189(3), pp 1163–1170 11 Bacillus Subtilis Expression Vectors Product Information and Instructions, Bacillus genetic stock center catalog vol.4 (2005), Mobitec Molecular biotechnology, Germany 12 Baillie L (2001), “The development of new vaccines against Bacillus anthracis”, J ApplMicrobiol., 91, pp: 609–613 13 Bandow J E., Brötz H., Hecker M (2002), "Bacillus subtilis Tolerance of Moderate Concentrations of Rifampin Involves the σB - Dependent General and Multiple Stress Response”, Journal of Bacteriology, 184(2), pp: 459 - 467 14 Bui Thu Thuy, Hoang Van Tong, Phan Huong Trang, Phan Tuan Nghia, Huynh Anh Hong, Simon Cutting, Nguyen Thi Van Anh (2011), “Cloning and expression of streptavidin on the outer coat of Bacillus subtilis PY79 spores”, VNU Journal of Science, Natural Science and Technology 27, 2S, pp:285 15 Burbulys D., Trach K A., Hoch.J A (1991), “Initiation of sporulation in B subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay”, Cell,64, pp:545-552 16 Coenen T M M., Bertens A M C., Hoog S C M., Verspeek R C M (2000), “Safety evaluation of a lactase enzyme preparation derived from Kluyveromyces lactis”, Food and Chemical Technology, 2000, pp: 671-677 56 Nguyễn Thị Thúy 17 Luận văn thạc sỹ Drabner B., Guzman C.A (2001), “ Elicitation of predictable immune responses by using live bacterial vectors”, Biomol Eng., 17(3), pp:75-82 18 Driks A (1999), “Bacillus subtilis spore coat”, Microbiology and Molecular Biology Reviews , 1, p:63 19 Duc L H., Cutting S.M (2003), “Bacterial spores as heat stable vaccine vehicles”, Expert Opin Biol Ther , 3, pp: 1263-1270 20 Duncan C H., Wilson G A., Young F E (1978), “Mechanism of integrating foreign DNA during transformation of Bacillus subtilis”, Proc Natl Acad Sci U S A, 75, pp:3664-3668 21 Edberg S C (1997), “Bacillus subtilis Final Risk Assessment”,US EPA human health assessment: Bacillus subtilis, U.S Environmental Protection Agency, Washington, D.C., USA 22 Ehrlich S D (1977), “ Replication and expression of plasmids from Staphylococcus aureus in Bacillus subtilis”, Proc Natl Acad Sci USA,74, pp:1680-1682 23 Ehrlich S D (1978), “DNA cloning in Bacillus subtilis”,Proc Natl Acad Sci USA,75, pp:1433-1436 24 Errington J (2003), “Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis”, Nature Reviews Microbiology, 1, pp: 117 25 Glick R Bernard, Pasternak J Jack (2003), Molecular Biotechnology: Principle and Application, Washington, ASM Press, USA 26 Graumann P (2007), “Bacillus: Cellular and Molecular Biology”, Caister Academic ISBN 978-1-904455-12-7 27 Gryczan T J., Dubnau D (1978), “Construction and properties of chimeric plasmids in Bacillus subtilis”,Proc Natl Acad Sci., 75, pp:1428-1432 57 Nguyễn Thị Thúy 28 Luận văn thạc sỹ Gupta D K., Vyas M (1989), “ Efficacy of Bacillus subtilis against mosquito larvae (Anophelis culicfacies)”, Zeitschrift fuer Angewandte Zoologie, 76(1), pp: 85-91 29 Haldenwang W G., Banner C D B., Ollington J F., Losick R., Hoch J A., O'Connor M B., Sonenshein A L (1980), “Mapping a Cloned Gene Under Sporulation Control by Insertion of a Drug-Resistance Marker into the Bacillus subtilis Chromosome”, J Bacteriol., 142, pp:90-98 30 Harwood C R (1989), Bacillus , page 6-39 31 Heravi K M., Marian W., Josef A.(2011), “Regulation of mtl operon promoter of Bacillus subtilis: Requirements of its use in expression vectors”, Microbial Cell Factories, 10 (1), pp: 10- 83 32 Horwitz J (1964), “Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity I Some Substituted 3-Indolyl-b-D-glycopyranosides”, J.Med Chem., 7, pp:574-575 33 Iber D., Clarkson J., Yudkin M D., Campbell I D (2006), “The mechanism of cell differentiation in Bacillus subtilis”, Nature, 441(7091), pp: 371-374 34 Isticato R., Cangiano G., Tran H T., Ciabattini A., Medaglini D., Oggioni M R., De Felice M., Pozzi G., Ricca E (2001), “Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores”, J Bacteriol., 183(21), pp: 6294-301 35 Kees J L., Kok J., Gerard V (1989), “Campbell-Like Integration of Heterologous Plasmid DNA into the Chromosome of Lactococcus lactis subsp lactis”, Applied and environmental Microbiology, 55, pp: 394-400 36 Keggins K M., Lovett P S., Duvall.E J (1978), “Molecular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the vector plasmid pUB110”, Proc Natl Acad Sci USA, 75, pp:1423-1427 37 Kobayashi K., et al (2003) "Essential Bacillus subtilis genes" Proc Natl Acad Sci U S A, 100(8), pp: 4678-4683 58 Nguyễn Thị Thúy 38 Luận văn thạc sỹ Krásný L and Gourse L Richard (2004), “An alternative strategy for bacteria ribosome synthesis: B rRNA transcription regulation”, BMBO Journal, 23, pp: 4473-4483 39 Kunst F., et al (1997), "The complete genome sequence of the Grampositive bacterium Bacillus subtilis" Nature., 390, pp: 249-256 40 Lee S., Belitsky B R., Brinker J P., Kerstein K O., Brown D.W., Clements J.D., Keusch G T., Tzipori S., Sonenshein A L., Herrmann J E (2010), “Development of a Bacillus subtilis-based rotavirus vaccine”, Clinical and Vaccine Immunology, 17 (11), pp: 1647-1655 41 Lepesant-Kejzlaro J., Lepesant J.-A., Walle J., BillaultA (1975), “ Revision of the linkage map of Bacillus subtilis 168: Indications for circularity of the chromosome”, J Bacteriol., 121, pp: 823-834 42 Losick R., and Pero J (1981), “Cascades of sigma factors”, Cell,25, pp:582-584 43 Mahler I., Halvorson H O (1977), “Transformation of Escherichia coli and Bacillus subtilis with a hybrid plasmid molecule”, J Bacteriol.,131, pp:374-377 44 Marino M., et al.(2001), "Modulation of Anaerobic Energy Metabolism of Bacillus subtilis by arfM (ywiD)" J Bacteriol 183(23), pp: 6815 - 6821 45 Mauriello Emilia M F., Duc Le H., Isticato R., Cangiano G., Hong Huynh A., De Felice M., Ricca Ezio, Cutting Simon M (2004), “Display of heterologous antigens on the Bacillus subtilis spore coat using CotC as a fusion partner”, Vaccine, 22(9-10), pp: 1177-1187 46 Morikawa M (2006), "Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species", Journal of Bioscience and Bioengineering, 10(1), pp: 1-8 47 Nagy Z., Kiss T., Szentirmai A., Bio S (2001), “β-Galactosidase of Penicillium chrysogenum: Production, puification and characterization of the enzyme”, Protein expression and purification, 21(1), pp: 24-29 59 Nguyễn Thị Thúy 48 Luận văn thạc sỹ Nakayama T., Amachi T (1999), “Encyclopedia of bioprocess technology: biocatalysis and bioseparation”, Enzymology , 3, pp:1291-1305 49 Nguyen H D., Nguyen, Q A., Ferreira, R.C., Ferreira, L.C., Tran, L.T and Schumann, W (2005), “Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability”, Plasmid, 54, pp: 241-248 50 Nguyen T H., Splechtna B., Steinbock M., Kneifel W., Lettner P H., Kulbe K D., Haltrich D (2006), “ Puification and characterization of two novel β-galactosidases from Lactobacillus reuteri”, Agricultural and Food chemistry, 54, pp: 4989-4998 51 Nicholson W & Setlow P (1990), Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood C & S Cutting, New York: John Wiley, pp.391-450, USA 52 Ogasawara, N., Y Fujita, Y Kobayashi, and Sadaie.Y 1995, “Systematic sequencing of the Bacillus subtilis genome: progress report of the Japanese group”, Microbiology, 141, pp:257-259 53 Onladda Juajun (2009), Characterization, cloning, expression and application of bacterial beta-galactosidase, thesis of Suranaree University of Technology, page: 70, Thailand 54 Perez A.R., Abanes-De Mello A., Pogliano K (2000), "SpoIIB Localizes to Active Sites of Septal Biogenesis and Spatially Regulates Septal Thinning during Engulfment in Bacillus subtilis", Journal of Bacteriology, 182(4), pp: 1096-1108 55 Phan T T P., Nguyen H D., Schumann W (2005), “Novel plasmidbased expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis”, Protein Expr Purif., 46(2), pp: 189-95 56 Rooney A P., Neil P J P., Ehrhardt C., James L S., Jason D B (2009), “Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp inaquosorum subsp nov.”, Appl Environ Microbiol, 59(10), pp: 2429-2436 60 Nguyễn Thị Thúy 57 Luận văn thạc sỹ Samarrai.W., David X L., Ann-Marie W., Barbara S., Jacob E., Anita S., Russell L W., Rivka R (2010), “Differential Responses of Bacillus subtilis rRNA Promoters to Nutritional Stress”,Journal of Bacteriology, 193(3), pp: 723-733 58 Sambrook J., Fritsch E.F and T Maniatis (1989), “Molecular Cloning A Laboratory Manual” Second edition Cold Spring Harbor Laboratory Press pp:1-74 59 Sangun L., Boris R B., James P B., Kathryn O K., David W B., John D C , Gerald T K., Saul T., Abraham L S., John E H (2010), “Development of a Bacillus subtilis-Based Rotavirus Vaccine”, Clin Vaccine Immunol.,17 ( 11), pp: 1647-1655 60 Schaechter M., Ingraham J L., Neidhardt F C (2006) Microbe., American Society for Microbiology, Washington, D.C, U.S.A 61 Schlessinger D (1976), Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, D.C, USA 62 Spizizen J (1958), “ Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate”, Proc Natl Acad Sci USA,44, pp:1072-1078 63 Stanghellini M E., Rasmussen S.L (1989), “Two new diseases of Salicornia sp caused by Bacillus subtilis and Macrophomina phaseolina”, Annual Meeting of the American Phytopathological Society, Pacific Division, 79(8), p: 912 64 Weber, M.H.W., Marahiel, M.A (1979), “Bacterial cold shock responses”, Science Progress, 86 (2003), pp:9–75 Bacillus subtilis Marburg, Mol Gen Genet., 170, pp:117–122 65 Yang M M., Zhang W W., Chen Y L Gong Y S (2010) “Development of a Bacillus subtilis expression system using the improved Pglv promoter”, Microbial Cell Factories, 9:55 doi:10.1186/1475-2859-9-55 Các trang web 66 67 68 69 70 http://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S163106910500065X-gr002.gif http://course1.winona.edu/sberg/308s10/Lec-note/Regulation.htm http://en.citizendium.org/wiki/Bacillus_subtilis http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis http://en.wikipedia.org/wiki/Beta-galactosidase 61 Nguyễn Thị Thúy 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 Luận văn thạc sỹ http://en.wikipedia.org/wiki/X-gal http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_subtilis http://sporegen.com/contact.html http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Subtilisin http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/choice_vector/ecoli/vectorfeatures/ http://www.hcmuaf.edu.vn/contents.php?ids=3963&ur=nhtri http://www.museion.ku.dk/2007/06/morbid-anatomy-for-connoisseurs/ http://www.sciencefoto.de/detail.php?id=215017&rubrik=Bio&lang=en&q=&qrubrik http://www.google.com.vn/imgres?q=mechanism+operon+lac http://www.Wikipedia.Plasmid 62 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ Phụ lục 1: Kết giải trình tự PrrnO-RBS (spoVG)-đoạn đầu lacZ trình tự đoạn cuối lacZ 63 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ Phụ lục 2: Sơ đồ vector pDG364, vector pHT01 64 Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ Phụ lục 3: Sơ đồ vector pET28 65 ... sinh dƣỡng vi khuẩn B subtilis mà không sử dụng chất cảm ứng Chính vậy, chúng tơi thực đề tài nghiên cứu: ? ?Biểu β- galactosidase vi khuẩn B subtilis? ?? nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng vi sinh vật... nghiên cứu cơng bố vi? ??c biểu gen tế bào sinh dƣỡng B subtilis mà không cần sử dụng chất cảm ứng Do đó, chúng tơi thực đề tài: ? ?Biểu β- galactosidase vi khuẩn B subtilis? ?? với mục đích biểu gen tế bào... phản ứng enzyme β- galactosidase với X-gal Nguyên lý: Hoạt tính enzyme β- galactosidase đƣợc định tính dựa vào khả β- galactosidase thuỷ phân X-gal Nếu vi khuẩn mang gen lacZ, enzyme βgalactosidase