Tạo bào tử Bacillus Subtilis biểu hiện Streptavidin gắn kháng thể Biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

Tạo bào tử Bacillus Subtilis biểu hiện Streptavidin gắn kháng thể Biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm Tạo bào tử Bacillus Subtilis biểu hiện Streptavidin gắn kháng thể Biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - BÙI THU THỦY TẠO BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS BIỂU HIỆN STREPTAVIDIN GẮN KHÁNG THỂ BIOTINYL HÓA KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bùi Thu Thủy TẠO BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS BIỂU HIỆN STREPTAVIDIN GẮN KHÁNG THỂ BIOTINYL HĨA KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ VÂN ANH Hà Nội - 2011 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH i BẢNG VIẾT TẮT iv MỞ ĐẦU .1 Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ 1.1.1 Nội bào tử vi khuẩn 1.1.2 Bào tử Bacillus subtilis .4 1.2 STREPTAVIDIN .10 1.2.1 Giới thiệu chung streptavidin .10 1.2.2 Cấu trúc streptavidin 11 1.2.3 Cấu tạo biotin 11 1.2.4 Tƣơng tác streptavidin-biotin 12 1.2.5 Thiết kế trạng thái đơn hóa trị streptavidin với vị trí gắn biotin .13 1.3 VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM 15 1.3.1 Giới thiệu chung bệnh đốm trắng tôm virus gây bệnh đốm trắng 15 1.3.2 Protein vỏ VP28 virus WSSV 17 1.3.3 Các phƣơng pháp phát virus gây bệnh đốm trắng tôm 17 1.3.4 Bào tử B subtilis biểu streptavidin bề mặt (bào tử-strep) ứng dụng 18 1.4 PHẢN ỨNG NGƢNG KẾT MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG 19 Chƣơng II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21 2.1 NGUYÊN LIỆU 21 2.1.1 Chủng vi khuẩn .21 2.1.2 Các kit 21 2.1.3 Các cặp mồi .21 2.1.4 Mẫu tôm sú nhiễm bệnh đốm trắng 22 2.1.5 Các nguyên liệệt độ phòng, ngƣng kết bắt đầu xuất giếng phản ứng số (chứa dung dịch WSSV nồng độ gốc) Ngƣợc lại giếng đối chứng âm (giếng số 6) giếng chứa dung dịch virus pha lỗng lần, 16 lần 64 lần bào tử-strep bắt đầu tập trung lại đáy giếng Sự khác biệt đƣợc thể rõ sau ủ, đặc biệt rõ nét thứ Nhƣ vậy, phản ứng ngƣng kết xuất giếng chứa nồng độ virus gốc, với giếng chứa WSSV pha lỗng 4, 16 64 lần ngƣng kết khơng xuất Hiện tƣợng đƣợc giải thích nồng độ virus Khóa 2009-2011 57 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y thấp, không đủ để hình thành mạng lƣới liên kết chéo kháng nguyên với kháng thể Do vậy, ngƣng kết không đƣợc tạo thành Để đảm bảo độ tin cậy thí nghiệm, chúng tơi tiến hành lặp lại thí nghiệm nhiều lần đƣờng kính ngƣng kết đƣợc đo lại để thuận lợi cho việc xác định xác kết mẫu kiểm tra sau Kết thu đƣợc bảng dƣới Bảng 4: Kết phản ứng ngƣng kết Đƣờng kính trung bình (mm) Mẫu Đƣờng kính ≥ 4,5 mm Đƣờng kính 3,9-4,5 mm Đƣờng kính ≤ 3,9 mm Dịch nghiền chứa WSSV ≥ 3,8x104 copies/ 50 µl 11 0 Dịch nghiền chứa WSSV ≤ 4,3x103 copies/ 50 µl 0 18 Âm tính (dịch nghiền tôm không nhiễm WSSV mẫu chứa đệm NTE) Số lƣợng Từ bảng kết trên, chúng tơi bƣớc đầu kết luận, mẫu cho đƣờng kính đƣờng kính ngƣng kết ≥ 4,5 mm mẫu dƣơng tính với số copies ≥ 104/ 50µl dịch nghiền Ngƣợc lại, mẫu cho đƣờng kính ≤ 3,9 mm mẫu âm tính mẫu chứa số copies WSSV ≤ 103/ 50µl dịch nghiền Ngồi ra, q trình thí nghiệm, số trƣờng hợp dƣơng tính giả xuất mẫu tơm khơng nhiễm WSSV, đƣờng kính ngƣng kết nằm khoảng 3,9-4,5 mm Kết dƣơng tính giả đƣợc giải thích tƣơng tác không đặc hiệu bào tử-strep gắn kháng thể với tạp chất có dịch nghiền tơm Bên cạnh đó, kết cho thấy phản ứng ngƣng kết cho phép phát có mặt WSSV nồng độ tối thiểu 3,8x104 copies, thấp khoảng 10 lần so với sử dụng kỹ thuật PCR (nồng độ thấp 4,3x103) 3.4.3.2 Phản ứng ngưng kết bào tử-strep gắn kháng thể đơn dòng kháng VP28-biotinyl với nồng độ virus pha loãng Dựa kết thu đƣợc sử dụng kháng thể đa dịng kháng VP28, chúng tơi tiếp tục tiến hành thí nghiệm tƣơng tự kháng thể đơn dòng kháng VP28 Trong thí nghiệm kháng thể đơn dịng, lƣợng kháng thể đƣợc Khóa 2009-2011 58 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y dùng để gắn với bào tử-strep 50µg Hình 42 kết phản ứng sau tiếng ủ bào tử-strep – kháng thể đơn dòng kháng VP28-biotinyl với dải nồng độ virus giảm dần Hình 42: Thử phản ứng ngƣng kết bào tử-strep-kháng thể đơn dòng kháng VP28- biotinyl với nồng độ virus pha loãng Giếng A: Đối chứng (-) đệm NTE Giếng B: Dịch nghiền virus nồng độ ban đầu Giếng C: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:4 Giếng D Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:16 Giếng E: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:64 Giếng F: Đối chứng (-) dịch nghiền tơm khơng nhiễm WSSV Kết hình 42 cho thấy ngƣng kết đƣợc hình thành rõ nét giếng phản ứng chứa virus nồng độ gốc (giếng 2) Trong đó, với mẫu đối chứng âm (giếng A F) mẫu virus pha loãng (giếng C, D, E), không quan sát thấy xuất ngƣng kết Nhƣ vậy, với kết thu đƣợc cho phép khẳng định bào tử-strep gắn kháng thể đơn dịng kháng VP28biotinyl hồn tồn sử dụng đƣợc làm giá thể cho phản ứng ngƣng kết thụ động ngƣợc để phát có mặt WSSV Khóa 2009-2011 59 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y KẾT LUẬN Với kết thu đƣợc trình nghiên cứu nhƣ trên, chúng tơi xin đƣa số kết luận sau: Nhân dịng thành cơng gen streptavidin vào vector pDG364 cotB dung hợp thành công đoạn gen cotB-streptavidin vào ADN hệ gen Bacillus subtilis Biểu thành công protein dung hợp cotB-streptavidin bề mặt bào tử Bacillus subtilis Bào tử-strep gắn kết đặc hiệu bền vững với kháng thể đơn dịng đa dịng kháng VP28 đƣợc biotinyl hóa Bƣớc đầu ứng dụng đƣợc bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28biotinyl để phát có mặt virus gây bệnh đốm trắng nhờ phản ứng ngƣng kết Phƣơng pháp cho phép phát có mặt virus gây bệnh đốm trắng với nồng độ tối thiểu 3,8x104 copies, thấp khoảng 10 lần so với phƣơng pháp PCR HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Tiếp tục nghiên cứu để tối ƣu hóa điều kiện phản ứng ngƣng kết nhƣ giảm thời gian phản ứng ngƣng kết xuống giờ, tăng độ nhạy phản ứng hạn chế xuất kết dƣơng tính giả Khóa 2009-2011 60 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TRONG NƢỚC Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Giáo trình Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Đỗ Ngọc Liên (2008), Miễn dịch học sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Văn Ty (2001), Miễn dich học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội II TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI Argarana, C., Kuntz, I.D., Birken, S., Axel, R., Cantor, C.R (1986), “Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene”, Oxf J., 14, pp 1871-1882 Chaiet, L., Wolf, F.J (1964) “The Properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomycetes”, Arch Biochem Biophys., 106, pp 1-5 Chen, J., Jin, M., Yu, Z., Dan, H., Zhang, A., Song, Y., Chen H (2007), “Latex agglutination test for the rapid detection of avian influenza virus subtype H5N1 and its clinical application” , J Vet Diagn Invest., 19, pp 155–160 Daisuke, I., Ritsuko, K., Hiromu, T., Kazuhito, W (2011), “Proteins Involved in Formation of the Outermost Layer of Bacillus subtilis Spores”, J Bacteriol., 193, pp 4075-4080 Driks, A (1999), “Bacillus subtilis spore coat”, Microbiol Mol Biol Rev., 63, pp 1-20 Guohua, Y., Zhimin, W., Yipeng, Q (2004), “Vp28 of shrimp White Spot Syndrome Virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells”, J Biochem Mol Bio, 37, pp 726-734 10 Howarth, M., Chinnapen, D., Gerrow, K., Dorrestin, P., Grandy, M.R., Kelleher, N.L., El-Husseini, A., Ting, A.Y (2006), “A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site”, Nature methods, 3, pp 267-273 11 Isticato, R., Cangiano, G., Tran, H.T., Ciabattini, A., Medaglini, D., Oggioni, M.R., Felice, M.D., Pozzi, G., Ricca, E (2001), “Surface display of recobinant protein on Bacillus subtilis spore”, J Bacteriol., 183, pp 6294-6301 12 Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Lumlertdacha, B., Sitprija, V (2000), “Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test”, J.Clin Microbiol, 38, pp 3098-3099 Khóa 2009-2011 61 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y 13 Kim, J.H , Lee, C.S , Kim, B.G (2005), “Spore-displayed streptavidin: A live diagnostic tool in biotechnology”, Biochem Biophys Res Commun , 331, pp 210–214 14 Le, D.H., Huynh, H.A., Fairweather, N., Ricca, E., Cutting, S.M (2003), “Bacterial spore as vaccine vehicles”, Infect Immun., 71, pp 2810-2818 15 Ning, D., Leng, X., Li, Q (2011), “Surface-displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome virus in crayfish by oral administration, J Appl Microbiol, 111, pp 1364-5072 16 Ricca, E., Cutting, S.M (2003), “Emerging applications of bacterial spores in nanobiotechnology”, J Nanobiotechnol., 1, pp 6-16 17 Takekazu, O., Fumiko, N., Shuta, Y., Keisuke, Y., Norihisa, O., Kiyoshi, L., Hiroshi, O., Haruji, S (2004), “Detection of white spot syndrome virus from stomach tissue homogenate of the kuruma shrimp (Penaeus japonicus) by reverse passive latex agglutination”, J Virol Methods, 119, pp 11–16 18 Takekazu, O., Fumiko, N., Shuta, Y., Keisuke, Y., Norihisa, O., Kiyoshi, L., Hiroshi, O., Haruji, S (2005), Detection of white spot syndrome virus (WSSV) from hemolymph of Penaeid shrimps Penaeus japonicus by reverse passive latex agglutination assay using high-density latex particles, J Virol Methods, 124, pp 143–148 19 Valimaa, L (2008), Streptavidin- A versatile binding protein for solid-phase immunoassays, University of Turku, Finland 20 Witteveldt, J., Cifuentes Carolina, C., Vlak Just, M (2004), “Protection of Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination ”, J Virology, pp 2057-2061 21 Wu, S., Wong, S (2005), “Engineering soluble monomeric streptavidin with reversible biotin binding capability”, J Biol Chem., 280, pp 23225-23231 22 http://www.astrobio.net/exclusive/3184/wanted-easy-going-martianroommates 23 http://classes.midlandstech.com/carterp/courses/bio225/chap10/lecture3.htm 24 http://en.wikipedia.org/wiki/Biotin 25 http://extramarks.com/ask-exploreanswer/question/45525/science/what-isendospore-formation-expain-it/8/?pn=&prevsh= Khóa 2009-2011 62 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y 26 http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/hydro.htm 27 http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/loops.html 28 http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/trypto.html 29 http://research.ncku.edu.tw/re/articles/e/20110916/3.html 30 http://sciencefilm.de/detail.php?id=215017&rubrik=Bio&lang=en&q=&qrub rik= 31 http://sonongnghiephatinh.gov.vn/vn/Recommendd.aspx?tabid=58 32 http://www.tansaoa.comdoc_viewer.aspxfileNameuploadfiledomtrang.pdf Khóa 2009-2011 63 ... chung bệnh đốm trắng tôm virus gây bệnh đốm trắng 15 1.3.2 Protein vỏ VP28 virus WSSV 17 1.3.3 Các phƣơng pháp phát virus gây bệnh đốm trắng tôm 17 1.3.4 Bào tử B subtilis biểu streptavidin. .. KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bùi Thu Thủy TẠO BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS BIỂU HIỆN STREPTAVIDIN GẮN KHÁNG THỂ BIOTINYL HĨA KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM Chun ngành: Sinh học thực nghiệm Mã... subtilis Bào tử- strep gắn kết đặc hiệu bền vững với kháng thể đơn dịng đa dịng kháng VP28 đƣợc biotinyl hóa Bƣớc đầu ứng dụng đƣợc bào tử- strep gắn kháng thể kháng VP2 8biotinyl để phát có mặt virus gây