Chế tạo và thử nghiệm bộ kit tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư để phát hiện một số virus gây bệnh

Chế tạo và thử nghiệm bộ kit tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư để phát hiện một số virus gây bệnh Chế tạo và thử nghiệm bộ kit tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư để phát hiện một số virus gây bệnh luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Huyền CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA TỪ CÁC TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH MẪU MÔ UNG THƢ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ VIRUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Huyền CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA TỪ CÁC TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH MẪU MÔ UNG THƢ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ VIRUS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Giáo viên hƣớng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn thạc sĩ khoa học PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực luận văn tốt nghiệp, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ dẫn tận tình Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, TS Phạm Thị Thu Hường tư vấn góp ý cho kết nghiên cứu luận văn Qua đây, xin chân thành cảm ơn cán tập thể nhóm nghiên cứu phịng Sinh học Nano Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzyme & Protein Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, người giúp đỡ, động viên khích lệ nhiều suốt thời gian thực luận văn thạc sĩ; thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội mang đến kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu trường Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Lĩnh Toàn thuộc Khoa Sinh lý Bệnh, Học viện Quân Y, cảm ơn Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện TƯQĐ 108, PGS.TS Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein - Đại học Y Hà Nội, PGS.TS Nguyễn Hoàng Nam, Trung tâm Nano Năng lượng - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp mẫu cho chúng tơi q trình nghiên cứu Luận văn thực tài trợ kinh phí đề tài mã số QG.16.22 ĐHQGHN tài trợ, PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh làm chủ nhiệm Sau cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè ln sát cánh động viên, khích lệ giúp đỡ tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quí báu đó! Hà Nội, tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Huyền DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ BB Binding Buffer (Đệm gắn kết) bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid EB Elution Buffer (Đệm chiết đẩy) EBV Epstein - Barr virus EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr Ethidium bromide GuHCl Guanidine hydrochloride GuSCN Guanidine Thiocyanate HPV Human Papilloma virus kb Kilo base pair KoAc Kali acetate LB Lysis Buffer (Đệm ly giải) Formalin Fixed and Paraffin Embedded Mô FFPE Tissue (Mô cố định formalin đúc thể vùi parafin) PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate UTĐTT Ung thƣ đại trực tràng UTVMH Ung thƣ vòm mũi họng WB Washing Buffer (Đệm rửa) MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƢ VÕM MŨI HỌNG (UTVMH) VÀ VIRUS GÂY UTVMH 1.1.1 Giới thiệu chung UTVMH 1.1.2 Epstein-Barr virus (EBV) tác nhân gây UTVMH 1.1.3 Human Papilloma virus (HPV) tác nhân gây UTVMH 1.2 TÁCH CHIẾT DNA TỪ MÔ FFPE 13 1.2.1 Vai trò quan trọng việc tách chiết DNA từ mẫu mô FFPE 13 1.2.2 Tách chiết DNA từ mẫu mô FFPE 14 1.3 SỰ CẦN THIẾT PHẢI TRIỂN KHAI VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 19 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 NGUYÊN LIỆU 20 2.1.1 Mẫu mô đúc thể FFPE 20 2.1.2 Hạt nano từ bọc silica 20 2.1.3 Các kit thƣơng mại tách chiết DNA từ mẫu mô FFPE 21 2.1.4 Các cặp mồi, probe 21 2.1.5 Các hóa chất nguyên liệu khác 22 2.1.6 Máy móc thiết bị 23 2.2 PHƢƠNG PHÁP 23 2.2.1 Chế tạo đệm cho kit tách chiết 23 2.2.2 Tách chiết DNA từ tiêu cố định mẫu mô ung thƣ hạt nano từ bọc silica đệm pha chế 24 2.2.3 Tách chiết DNA từ tiêu cố định mẫu mô ung thƣ hạt nano từ bọc silica kit thƣơng mại MagMAX FFPE DNA Isolation kit (Thermo Scientific) 25 2.2.4 Đánh giá nồng độ độ tinh nucleic acid tách chiết đƣợc dựa quang phổ kế 27 2.2.5 Nhân đoạn gen đặc hiệu Braf 27 2.2.6 Real-time PCR phát EBV 28 2.2.7 Real-time nested PCR phát HPV 29 2.2.8 Giải trình tự gen 30 2.2.9 Phƣơng pháp phân tích gen 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ 31 3.1 CHẾ TẠO BỘ KIT TÁCH DNA TỪ MÔ FFPE SỬ DỤNG HẠT TỪ BỌC SILICA 31 3.1.1 Đệm Lysis Buffer, Binding Buffer phù hợp với tách chiết DNA từ mô FFPE 31 3.1.2 Hạt Magsi nano phù hợp với tách chiết DNA từ mô FFPE 34 3.1.3 DNA tách chiết từ mô FFPE phù hợp làm khn cho PCR giải trình tự gen 36 3.1.4 Xây dựng kit tách chiết từ mô FFPE hoàn chỉnh 38 3.2 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TÁCH DNA TỪ MÔ FFPE CỦA BỘ KIT TRÊN CÁC MẪU MÔ FFPE Ở BỆNH NHÂN UTVMH ĐỂ PHÁT HIỆN EBV-DNA VÀ HPV-DNA 42 3.2.1 Bƣớc đầu so sánh chất lƣợng kit với kit thƣơng mại đánh giá khả tách chiết DNA virus EBV HPV từ mẫu mô FFPE UTVMH 42 3.2.2 Thử nghiệm phát EBV HPV từ mẫu cố định mô UTVMH 46 KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Ảnh chụp vịm họng bênh nhân ung thƣ vịm mũi họng [43] Hình 1.2: Hình ảnh Epstein Barr Virus dƣới kính hiển vi điện tử [44] Hình 1.3: Cấu trúc EBV [53] Hình 1.4: Sơ đồ minh họa trình tiến triển Epstein Barr virus thể ngƣời bị nhiễm [45] Hình 1.5: Hạt virus cấu trúc gen HPV [54] 10 Hình 1.6: Hình ảnh minh họa mẫu mơ đúc khối nến [47] 14 Hình 1.7 : Liên kết chéo mẫu mô FFPE [38] 15 Hình 1.8: DNA liên kết với silica mơi trƣờng có nồng độ muối cao chất diện hoạt sức căng bề mặt thấp [55] 16 Hình 2.1: Ảnh chụp hạt nano từ bọc silica dƣới kính hiển vi điện tử (Transmission Electron Microscope, TEM) 21 Hình 3.1: So sánh nồng độ DNA bệnh nhân tách chiết đệm (n=3) 32 Hình 3.2: Kết điện di PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu DNA Bệnh nhân tách ba đệm tƣơng ứng 33 Hình 3.3 : Đồ thị nồng độ DNA bệnh nhân tách chiết ba loại hạt Magsi nano khác (n=3) 34 Hình 3.4: Ảnh điện di kết PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu DNA bệnh nhân tách ba loại hạt nano từ bọc silica 36 Hình 3.5: Các peak trình tự acid nucleic đoạn gen Braf tách từ bệnh nhân số bệnh nhân số (B) 37 Hình 3.6: So sánh kết giải trình tự đoạn gen Braf hai bệnh nhân với sở liệu NCBI 38 Hình 3.7: Sơ đồ tách chiết DNA từ mô FFPE từ hạt magsi nano đệm pha chế 40 Hình 3.8 : Hình ảnh kit Magpure FFPE DNA mini kit 41 Hình 3.9: Hàm lƣợng DNA 10 bệnh nhân tách kit Magpure MagMAX 43 Hình 3.10: Tín hiệu real-time PCR phát EBV real-time nested PCR phát HPV sử dụng DNA khuôn tác từ kit Magpure MagMAX BN7 BN 45 Hình 3.11: Tín hiệu chạy real-time PCR phát EBV sử dụng khuôn DNA tách từ mơ bệnh phẩm bệnh nhân ung thƣ vịm họng FFPE kit Magpure 48 Hình 3.12: Tín hiệu chạy Real-time nested PCR SYBR Green phát HPV sử dụng khuôn DNA tách từ mô FFPE bệnh nhân UTVMH kit Magpure 50 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Đặc diểm loại hạt nano từ bọc silica 20 Bảng 2.2: Trình tự cặp mồi, probe 22 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen Braf 27 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng Real-time PCR phát EBV 29 Bảng 3.1: Kí hiệu thành phần đệm 31 Bảng 3.2: Kết đo độ tinh DNA bệnh nhân tách đệm khác 33 Bảng 3.3: Kết đo độ tinh DNA bệnh nhân tách loại hạt khác 35 Bảng 3.4: Các thành phần Magpure FFPE DNA nano kit (100 pứ) 42 Bảng 3.5: Kết đo độ tinh DNA tách chiết từ 10 mẫu mô FFPE bệnh nhân UTVMH tách kit Magpure MagMAX 43 Bảng 3.6: Kết real-time PCR phát EBV 26 mẫu dƣơng tính EBV real-time nested PCR phát HPV sử dụng DNA khuôn tách từ kit Magpure MagMAX 10 bệnh nhân UTVMH 44 Bảng 3.7: Kết real-time PCR 26 bệnh nhân dƣơng tính virus EBV 35 bệnh nhân nghi UTVMH 47 Bảng 3.8: Kết real-time nested PCR 16 bệnh nhân dƣơng tính virus HPV 35 bệnh nhân nghi UTVMH 49 MỞ ĐẦU Ung thƣ bệnh nguy hiểm gây tử vong hàng đầu giới Có nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thƣ nhƣ: yếu tố di truyền, tác nhân hóa học, tác nhân vật lý, lây nhiễm virus … Một số bệnh ung thƣ có liên quan tới nhiễm virus đƣợc nghiên cứu nhiều ung thƣ vòm mũi họng (UTVMH) Nguyên nhân gây UTVMH chƣa đƣợc xác định rõ ràng, có nhiều giả thuyết, giả thuyết đƣợc đề cập nhiều Epstein Barr virus (EBV) Human Papilloma virus (HPV) Nhiều nghiên cứu tác giả giới cho thấy UTVMH có liên quan đến có mặt virus EBV, HPV máu niêm mạc họng [4, 27, 36] Để phát có mặt EBV HPV bệnh nhân nghi UTVMH, kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc áp dụng độ xác đặc hiệu cao cho phép định tính, định lƣợng số lƣợng virus mô UTVMH [6, 34] Việc tách chiết DNA từ mô ngƣời bƣớc thiếu để phục vụ cho thí nghiệm nhƣ PCR real time PCR phát EBV, HPV, giải trình tự, xác định đột biến hay chẩn đoán ung thƣ, bệnh học Hiện nay, mẫu mô cố định formalin đúc thể vùi parafin (Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue- FFPE Tissue; mô FFPE) đƣợc lƣu trữ nhiều khoa bệnh học bệnh viện cho mục đích chẩn đốn, nghiên cứu hồi cứu mơ bệnh học di truyền phân tử Do ƣu điểm bảo quản đƣợc tồn vẹn cấu trúc mơ thời gian dài từ vài năm đến hàng chục năm, mẫu mô FFPE giải pháp đƣợc nhiều bệnh viện, phòng xét nghiệm lựa chọn để giữ lại mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ung thƣ, có UTVMH [8] Tuy nhiên, việc sử dụng formalin, tác nhân vùi nhƣ nhiệt độ làm xuất liên kết chéo nucleic acid với protein nucleic acid với gây khó khăn cho q trình tách chiết đồng thời DNA tách chiết đƣợc bị đứt gãy nhiều [23, 30, 38] Hiện nay, hãng tiếng sinh học phân tử giới nhƣ Thermo Scientific Promega phát triển thƣơng mại hóa kit tách chiết DNA từ mô FFPE sử dụng cột màng silica hạt micro từ tính bọc silica với đệm Theo nguyên lý Boom cộng sự, DNA đƣợc bám bề mặt màng silica hạt micro từ tính thơng qua cầu nối Na+ để liên kết với silica giữ lại nam châm, tạp chất khác đƣợc loại bỏ [9-11, 28] Hiện chƣa có nhóm nghiên cứu nƣớc phát triển kit tách chiết DNA từ mô FFPE sử dụng màng/cột silica hay hạt từ tính bọc silica, hầu hết bệnh viện phịng thí nghiệm sử dụng kit ngoại nhập với giá thành cao Trong công bố gần nhóm nghiên cứu thuộc phịng Sinh học Nano Ứng dụng, PTNTĐ Công nghệ Enzym Protein phối hợp với Trung tâm Nano Năng lƣợng, hạt oxit sắt từ tính bọc silica (Fe3O4@SiO2) kích thƣớc nano đƣợc chế tạo thử nghiệm cho việc tách chiết DNA từ virus, tế bào máu, mơ tƣơi ƣu điểm có tổng diện tích bề mặt tƣơng tác với DNA lớn nên có khả gắn kết hiệu với DNA dạng cột/màng silica hay hạt micro từ tính bọc silica [5, 35, 40] Xuất phát từ thực tế nhu cầu sử dụng kit tách chiết DNA từ mô FFPE cho phát tác nhân virus gây bệnh ung thƣ, tiến hành nghiên cứu “Chế tạo thử nghiệm kit tách chiết DNA từ mẫu tiêu mô ung thư sử dụng hạt nano từ bọc silica đệm phù hợp để phát số virus gây bệnh” với mục tiêu sau:  Chế tạo kit tách DNA từ mô FFPE sử dụng hạt từ bọc silica  Thử nghiệm khả tách DNA từ mô FFPE kit mẫu mô FFPE bệnh nhân UTVMH để phát EBV-DNA HPV-DNA BN13 31,5 33,7 33 35,6 NA NA BN14 NA NA 30 32,4 25 32 BN15 NA NA 31,5 32,7 NA NA 10 BN16 34,26 NA 27,84 29,5 NA NA Hình 3.10: Tín hiệu real-time PCR phát EBV real-time nested PCR phát HPV sử dụng DNA khuôn tác từ kit Magpure MagMAX BN7 BN8 (A1) Tín hiệu FAM biễu thị gen đích EBV; (A2) Tín hiệu HEX biễu thị gen nội chuẩn (+):đối chứng dương chứa đoạn gen EBV-74 gen nội chuẩn betaglobin; (-): đối chứng âm có chứa đoạn gen nội chuẩn betaglobin; No.7-M1, No.8-M1: tín hiệu chạy BN BN sử dụng DNA tách kit Magpure; No.7-MagMAX, No.8- MagMAX: tín hiệu chạy BN BN sử dụng DNA tách kit hãng Thermo Scientific (B1) Tín hiệu SYBR Green biểu thị gen đích HPV; (B2) Hình ảnh điện di sản phẩm real-time nested PCR (+):đối chứng dương mẫu HPV dương tính; (-): đối chứng âm nước; No.7-M1, No.8-M1: tín hiệu chạy BN BN sử dụng DNA tách kit Magpure; No.7-MagMAX, No.8- MagMAX: tín hiệu chạy BN BN sử dụng DNA tách kit hãng Thermo Scientific 45 Từ kết trình bày trên, kết luận kit Magpure MagMAX tách thành công DNA từ mẫu mô FFPE với hàm lƣợng độ tinh cao kit MagPure cho phép tách chiết DNA với hàm lƣợng cao so với MagMAX kit DNA tách chiết DNA tổng số, bao gồm DNA ngƣời DNA virus nhiễm mơ ung thƣ, mẫu sử dụng cho nhiều ứng dụng khác nhƣ phát đột biến gen thị ung thƣ nhƣ phát virus gây bệnh mẫu chứa virus với nồng độ cao nồng độ thấp Điều có ý nghĩa quan trọng chẩn đoán điều trị bệnh 3.2.2 Thử nghiệm phát EBV HPV từ mẫu cố định mô UTVMH Sau so sánh, đánh giá chất lƣợng MagPure kit đạt tiêu chuẩn tƣơng đƣơng chí tốt với kit ngoại nhập, tiến hành thử nghiệm sử dụng kit để tách chiết DNA phát có mặt EBV HPV 35 mẫu bệnh nhân FFPE đƣợc chẩn đoán UTVMH dựa xét nghiệm mô bệnh học Kết phản ứng real-time PCR đƣợc sử dụng để đánh giá khả tách chiết DNA kit Magpure FFPE DNA nano kit, thể giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) tín hiệu huỳnh quang phản ứng Real-time PCR 3.2.2.1 Phát tỷ lệ dƣơng tính EBV mẫu FFPE UTVMH phản ứng real-time PCR Taqman probe Kết chạy real-time PCR 35 mẫu bệnh phẩm nghi UTVMH với khuôn sử dụng kit tách chiết MagPure cho thấy có tới 26/35 mẫu dƣơng tính (chiếm tỷ lệ 74,29%) Trong đó, mẫu chạy kèm gen nội chuẩn beta-globin cho tín hiệu chu kỹ ngƣỡng khoảng 23,5- 32,0 Chúng tổng hợp số liệu chu kỳ ngƣỡng tín hiệu huỳnh quang FAM phản ánh có mặt EBV tín hiệu huỳnh quang HEX phản ánh có mặt gen nội chuẩn Bảng 3.7 nhƣ sau: 46 Bảng 3.7: Kết real-time PCR 26 mẫu dƣơng tính với EBV 35 bệnh nhân nghi UTVMH STT Mã BN FAM-EBV HEX-nội chuẩn beta-globin Kết luận 108 25 26 Dƣơng tính 114 27 26,5 Dƣơng tính 117 28 28,5 Dƣơng tính 161 24 26 Dƣơng tính 185 35 31 Dƣơng tính 219 31 25 Dƣơng tính 277 28 26 Dƣơng tính 291 28,5 27 Dƣơng tính 298-2 26 24 Dƣơng tính 10 310 27 29 Dƣơng tính 11 325 26 28 Dƣơng tính 12 346 28 30,5 Dƣơng tính 13 360 25,5 27,5 Dƣơng tính 14 398 36 32 Dƣơng tính 15 431 26,5 25 Dƣơng tính 16 480 35 33 Dƣơng tính 17 483 33,5 29,5 Dƣơng tính 18 794 25 23,5 Dƣơng tính 19 761 26 26 Dƣơng tính 20 928 36 31,5 Dƣơng tính 21 5527 27,5 27 Dƣơng tính 22 5393 26 26 Dƣơng tính 23 5648 33 29,5 Dƣơng tính 24 109 25 23,5 Dƣơng tính 25 164 25 24,5 Dƣơng tính 26 204 26,5 27 Dƣơng tính 47 Hình 3.11: Tín hiệu chạy real-time PCR phát EBV sử dụng khuôn DNA tách từ mô bệnh phẩm bệnh nhân UTVMH FFPE kit Magpure NC: đối chứng âm; PC: đối chứng dương; 108,114,11.: mã bệnh nhân UTVMH Hình (A):Kênh FAM đường biểu diễn tín hiệu gen đích EBV Hình (B): Kênh HEX đường biểu diễn tín hiệu gen nội chuẩn Hình 3.11 thể kết phản ứng real-time PCR bệnh nhân dƣơng tính với EBV mang mã 108, 114, 117; phản ứng có chạy kèm chứng âm chứa gen nội chuẩn beta-globin chứng dƣơng chứa plasmid mang gen đích EBV Trong đó, tín hiệu huỳnh quang kênh FAM gen đích kênh HEX gen nội chuẩn lên rõ ràng (giá trị chu kỳ ngƣỡng mẫu 108, 114, 117 lần lƣợt 25, 27, 28 kênh gen đích phát EBV, giá trị chu kỳ ngƣỡng gen nội chuẩn tƣơng ứng 26, 26,5, 28,5) Qua đây, khẳng định kit Magpure hồn tồn tách đƣợc DNA từ mẫu mơ FFPE bệnh nhân UTVMH DNA tách đƣợc hoàn toàn phù hợp cho phản ứng real-time PCR Taqman probe phát EBV 3.2.2.2 Phát tỷ lệ dƣơng tính HPV mô FFPE UTVMH phản ứng real-time nested PCR SYBR kết hợp giải trình tự xác định type Tƣơng tự với HPV, tiến hành phân tích có mặt HPV 35 mẫu bệnh nhân UTVMH, đồng thời đánh giá khả tách DNA MagPure thông qua giá trị Ct phản ứng real-time nested PCR Kết Bảng 3.6 cho thấy 35 mẫu DNA tách sử dụng MagPure, phát đƣợc 16 mẫu dƣơng tính với HPV (45,71%), mẫu có tín hiệu huỳnh quang xuất sớm, có chu kỳ 48 ngƣỡng nhỏ, đặc biệt mẫu có số thứ tự 2, 31, 32 lên chu kỳ ngƣỡng 11, mẫu lại lên chu kỳ ngƣỡng khoảng 16-30 Bảng 3.8: Kết real-time nested PCR phát 16 bệnh nhân dƣơng tính virus HPV 35 bệnh nhân nghi UTVMH Chu kỳ ngƣỡng STT Tên mẫu 108 22,5 Dƣơng tính 114 11 Dƣơng tính 117 30 Dƣơng tính 219 18 Dƣơng tính 377 22 Dƣơng tính 398 30 Dƣơng tính 431 20 Dƣơng tính 436 22 Dƣơng tính 483 21 Dƣơng tính 10 794 23 Dƣơng tính 11 761 17 Dƣơng tính 12 5393 16 Dƣơng tính 13 5648 11 Dƣơng tính 14 109 11 Dƣơng tính 15 164 19 Dƣơng tính 16 204 21 Dƣơng tính (Ct) 49 Kết luận Hình 3.12: Tín hiệu chạy Real-time nested PCR SYBR Green phát HPV sử dụng khuôn DNA tách từ mô FFPE bệnh nhân UTVMH kit Magpure Hình (A): Tín hiệu chạy Real-time nested PCR SYBR Green phát HPV; Hình(B): Hình ảnh điện di sản phẩm Real-time nested PCR SYBR Green phát HPV NC: đối chứng âm, mẫu PC: đối chứng dương, 108,114,117.: mã bệnh nhân UTVMH 100bp: 100bp ladder, (+):đối chứng dương với kích thước gen đích 252bp Kết Hình 3.12 cho thấy, đƣờng tín hiệu real-time nested PCR SBYR green bệnh nhân lên rõ ràng tƣơng quan với kết điện di sản phẩm PCR độ sáng nhƣ kích thƣớc băng Chứng tỏ, DNA tách đƣợc từ mẫu mơ FFPE bệnh nhân UTVMH có hàm lƣợng độ tinh tốt, hoàn toàn phù hợp cho phản ứng real-time nested PCR SYBR phát HPV Tiến hành giải trình tự DNA 16 mẫu để định type HPV, thu đƣợc 16 mẫu thuộc HPV type 11 gây bệnh u nhú đƣờng hô hấp, u nhú liên kết số bệnh phụ khoa khác (số liệu chi tiết giải trình tự xin phép khơng trình bày thuộc đề tài nghiên cứu khác chƣa nghiệm thu) Từ kết phản ứng real-time PCR phát EBV real-time nested PCR SBYR phát HPV trên, nhận định Magpure kit có khả tách đƣợc DNA mẫu mô FFPE bệnh nhân UTVMH với chất lƣợng tốt hàm lƣợng DNA thu đƣợc cao, cho phép làm khuôn cho phản ứng real-time phát virus EBV, HPV Thông qua việc thử nghiệm 35 mẫu mô FFPE bệnh 50 nhân UTVMH, chúng tơi đánh giá đƣợc tỷ lệ có mặt virus EBV lên tới 74,29%, chứng tỏ mối liên quan chặt chẽ EBV nhƣ virus đóng vai trị hay tham gia vào q trình gây bệnh UTVMH Trong số 35 mẫu khảo sát nghiên cứu này, có 14 mẫu nhiễm đồng thời EBV HPV chiếm 40%, 12 mẫu (34,3%) nhiễm EBV mẫu (5,71%) nhiễm HPV Trong đó, có mẫu (14,35%) khơng phát thấy có mặt EBV HPV, nguyên nhân gây bệnh UTVMH lây nhiễm virus nhiều yếu tố khác nhƣ yếu tố di truyền, tác nhân hóa học, tác nhân vật lý Tuy nhiên, dựa theo số liệu nghiên cứu thu đƣợc tác động virus EBV HPV tới UTVMH không nhỏ Đây số liệu đặc thù cho tỷ lệ EBV HPV bệnh nhân UTVMH khảo sát Việt Nam, đƣợc thực khuôn khổ hợp tác với nhóm nghiên cứu PGS TS Nguyễn Lĩnh Toàn, Khoa Sinh lý Bệnh Học viện Quân Y Kết cần đƣợc khảo sát cỡ mẫu lớn nữa, nhiên đóng góp phần quan trọng việc đánh giá mối liên quan loài virus tới bệnh UTVMH sở khoa học để khuyến cáo cho xét nghiệm EBV, HPV hỗ trợ chuẩn đoán sớm bệnh UTVMH 51 KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO KẾT LUẬN Từ kết thu đƣợc q trình nghiên cứu chúng tơi đến kết luận sau: Đã chế tạo thành công kit tách chiết DNA từ mô ung thƣ FFPE (gồm thành phần đệm hạt magsi nano M1) quy trình tách thành cơng DNA từ mơ FFPE với nồng độ khoảng 35- 500 ng/µl từ 10 mg mẫu DNA tách từ kit có độ tinh cao (giá trị đo OD A260/A280: 1,8 -2,2) sử dụng tốt để làm khuôn cho phản ứng PCR, real-time PCR giải trình tự gen So sánh bƣớc đầu 10 mẫu mô FFPE bệnh nhân UTVMH cho thấy kit Magpure tách chiết DNA với hàm lƣợng cao 2-5 lần so với kit MagMAX (Thermo) Kết real-time PCR phát EBV cho thấy tỷ lệ dƣơng tính với EBV 8/10 mẫu kit MagMAX phát đƣợc 7/10 mẫu dƣơng tính tín hiệu Magpure xuất sớm từ 3-5 chu kỳ Kết real-time nested PCR phát HPV cho thấy tín hiệu Magpure xuất sớm MagMAX từ 3-13 chu kỳ Thử nghiệm thành công kit Magpure để tách DNA từ mẫu mô FFPE 35 bệnh nhân UTVMH để phát có mặt lồi virus EBV HPV Qua đó, bƣớc đầu khảo sát đƣợc tỷ lệ % dƣơng tính EBV HPV bệnh nhân UTVMH tƣơng ứng 74,29% 45,71% Các kết nghiên cứu luận văn đóng góp phần cơng bố tạp chí đăng ký sở hữu trí tuệ dƣới đây: Nguyen MH, Nguyen HN, Nguyen TH, Nguyen TVA, Phan TN, Nguyen BK, Nguyen LT, Nguyen HL (2017) Synthesis of SiO 2-Coated Fe3O4 Nanoparticles Using Ultrasound and Its Application in DNA Extraction from Formalin-Fixed, Parafin-Embedded Human Cancer Tissues Journal of Elec Material, doi:10.1007/s11664-017-5282-6 (tạp chí ISI, IF = 1,29) 52 Nguyen Thi Huyen, Le Duc Linh, Pham Thi Thu Huong, Nguyen Minh Hieu, Nguyen Hoang Nam, Tran Thi My, Nguyen Hoa Anh, Phan Tuan Nghia, Nguyen Thi Van Anh (2016) Development of DNA Extraction Kit Based on Silica-Coated Magnetic Nanoparticles for Formalin-Fixed and Parafin-Embedded Cancer Tissues VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 32, 277-285 Giải pháp hữu ích “Kit tách chiết DNA và/hoặc RNA từ tiêu mô cố định formalin vùi parafin quy trình sản xuất kit này” Đã đƣợc chấp nhận đơn hợp lệ ngày 23/10/2017, số đơn 2017-2-00303 Các tác giả: Nguyễn Thị Vân Anh, Nguyễn Hoàng Nam, Nguyễn Thị Huyền, Chu Văn Sơn, Nguyễn Minh Hiếu, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Hòa Anh HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Tiếp tục tách chiết DNA từ mẫu mô FFPE UTVMH với lƣợng mẫu lớn để đánh giá xác tỷ lệ HPV EBV bệnh nhân UTVMH Tiếp tục tối ƣu thời gian tách chiết hồn thiện quy trình để nâng cao hiệu tách chiết, tối ƣu hóa hệ thống tự động để đƣa kit vào sử dụng bệnh viện phục vụ tách chiết lƣợng mẫu FFPE lớn 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đái Duy Ban (2002), Sinh học phân tử ung thư vòm họng, NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Vũ Quốc Huy (2014), "Xét nghiệm HPV sàng lọc ung thƣ cổ tử cung: Cập nhật 2014", Tạp chí Phụ Sản tập 12, 2, 08-14 Nghiêm Đức Thuận (2013), “Liên quan số gen Epstein Barr Virus với thể mơ bệnh ung thƣ vịm họng”, Tạp chí nghiên cứu Y học 15, 22-27 Phạm Huy Tần, Trần Huy Thịnh, Trần Thị Thúy Hằng, Nguyễn Đình Phúc, Trần Vân Khánh (2015), “Nồng độ EBV-DNA huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng mối tƣơng quan với chẩn đoán giai đoạn NTM (Tumoer Nodes Metastasis)”, Tạp chí nghiên cứu Y học 95, 24-31 Phạm Thị Trà, Đào Văn Quý, Nguyễn Đức Hiếu, Nguyễn Thái Sơn, Nguyễn Hoàng Nam, Nguyễn Thị Vân Anh, Nguyễn Hoàng Hải, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Hoàng Lƣơng (2012), “Tách chiết ADN Epstein Barr Virus hạt nano từ bọc silica : ứng dụng phát virus phƣơng pháp PCR”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 28, 195-202 Phạm Hùng Vân (2009), “PCR real-time PCR vấn đề áp dụng thƣờng gặp”, NXB Y học TÀI LIỆU TIẾNG ANH A.-M de Roda Husman., P J F Snijders., H V Stel., A J C van den Brule., C J L M Meijer., and J M M Walboomers (1995), “Processing of long-stored archival cervical smears for human papillomavirus detection by the polymerase chain reaction”, British Journal of Cancer 72, pp 412-417 Ahmad-Neiad P., Duda A., Sucker A., Werner M., et al (2015), “Assessing quality and functionality of DNA isolated from FFPE tissues through external quality assessment in tissue banks”, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 53(12), pp 1972-34 54 Boom R., Sol C J A., Beld M., Weel J., Goudsmit J., Dillen P W V (1999), “Improved Silica- Guanidiniumthiocyanate DNA Isolation Procedure Base on Selective Binding of Bovine Alpha-Casein to Silica Particles”, J Clinic Microbiol, 37 pp 615-619 10 Boom R., Sol C J A., R, Heijtink R Wertheim- van Dillen P M E., Van Der Noordaa J (1991), “Rapid purification of Hepatitis B virus DNA from serum”, J Clinic Microbiol 29, pp 1804-1811 11 Boom R., Sol C J A., Salimans M M M., Jansen C L., Wertheim P M E (1990), “Rapid and simple method for purification of nucleic acids”, J Clinic Microbiol 28, pp 495-503 12 Burchell A.N., Winer R.L., De Sanjos S., Franco Eduardo L (2006), "Chapter 6: Epidemiology and transmission dymanics of genital HPV infection", Vaccine 24S3, pp 52- 61 13 Burggraf S., Olgemoller B (2004), “Simple Technique for Internal Control of Real-Time Amplication Assays” Clinic Chem 50, pp 819-825 14 Clark D (2005), “Understanding Genetic Revolution, Elsevier Academic Press, California, USA” Molecular Biology, pp 567-599 15 Clifford Gy.M., Franceschi S., Diaz M., Munoz N., Villa L.L (2006), "Chapter 3: HPV týp- Distribution in Women with and without Cervical Neoplastic Diseases ", Vaccine 24S3, pp 26-34 16 Cohen JI (2006), “Virology AND molecular biology of Epstein bar virus” pp 21-37 17 Crosbie EJ., Einstrein MH., Franceschi S., Kichener H.C (2013), “Human Papilloma virus and cervical cancer”, Lancet 382, pp 889- 899 18 De Roda Husman, A.M., Walboomers, J.M., Van den Brul, A.J., Meijer, C.J., Snijders, C.J (1995) The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3' ends with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR J Gen Virol 76, pp 1057-1062 55 19 Dermott AL., Dutt SN., Watkinson JC (2001), “The aetoology of nasopharyngenl carcinomar”, Clin Otolaryngol Appllie Sci 26, pp 82-92 20 Asante DB., Asmah RH., Adjei AA., Kyei F., Simpong DL., Brown CA., Gyasi RK (2017), “Detection of Human Papillomavirus Genotypes and Epstein-Barr Virus in Nasopharyngeal Carcinomas at the Korle-Bu Teaching Hospital, Ghan a”, The Scientific World Journal 2721367 21 Epstein S., Barr YM., Achong BG (1964), “Virus particles in cultrured lymphoblasts from Burkitt’s lymphoma”, The Lancet pp 702-703 22 Gerstein S A (2001), Molecular Biology Problem Solver, Wiley- Liss Inc, New York, USA pp 167-197 23 Gilbert M T P., Haselkorn T., Bunce M., Sanchez J J., Lucas S B., Jewell L D., Van Marck E., Worobey M (2007), “The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-which methods are useful when?”, PLoS ONE 2, 537 24 Goelz S E., Hamilton S R., Vogelstein B (1985), “Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue”, Biochemical and Biophysical Research Communications 130(1), pp 118-26 25 Henle G., Henle W., Horowitz C A (1997), “Epstein-Barr Virus Spesific diagnosis: Test in Infectious Mononucleosis”, Huma Patholo 5, pp 551-558 26 Herraez-Hernandez E., Preda O., Alonso S., Pardo R S., Olmo A (2013), “Detection and Genotyping of Human Papillomavirus DNA in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens with the HPV Direct Flow CHIP System”, Open Virol J 7, pp 91-5 27 Hording U., Winther Nielsen H., Daugaard S., et al (1994) Human papillomavirus types 11 and 16 detected in nasopharyngeal carcinomas by the polymerase chain reaction Laryngoscope 104, pp 99-102 28 Kathryn A., Chris M., Sherwood S., Turner R F B., Haynes C A (1996), “Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions”, J Colloid Interface Science 181, pp 635-644 56 29 K Sotlar., D Diemer., A Dethleffs et al (2004), “Detection and typing of human papillomavirus by E6 nested multiplex PCR” Journal of Clinical Microbiology vol 42, 7, pp 3176-3184 30 McSherry E A., McGoldrick A., Kay E W., Hopkins A M., Gallagher W M., Dervan P A (2007), “Formalin-Fixed Paran-Embedded Clinical Tissues Show Spurious Copy Number Changes in Array-CGH Proles”, Clin Genetics 72, pp 441-447 31 Middeldrop JM., Brink AA., Van den Brule AJ., Meijer CJ (2003), “Phathogenic role for Epstein Barr virus (EBV) gene products in EbV-associated proliferactive disorders”, Crit Rev Oncol Hematol 4, pp.1-36 32 Moller K., Rinke J., Ross A., Buddle G., Brimacombe R (1977), “The use of formaldehyde in RNA-protein cross-linking studies with ribosomal subunits from Escherichia coli” European Journal of Biochemistry 76, pp 175-187 33 Munoz N., Castellsagué X., De González Amy B., Gissmann L (2006), "Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer", Vaccine 24S3, pp 1- 10 34 Niesters HG., Van Esser J., Fries E., Wolthers KC., Cornelissen J., Osterhaus AD (2000), “Development of a real-time quantitative assay for detection of Epstein-Barr virus”, J Microbiol 38, pp 712-715 35 Nguyen T H., Dao V Q., Nguyen H N., Nguyen H L., Tran T V K., Nguyen T V A (2014), “Efficient purification of DNA from blood cells using silicacoated magnetic nanoparticles and suitable buffers”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 30 (3S), pp 158-166 36 Rassekh CH, Rady PL, Arany I, et al (1998) “Combined Epstein-Barr virus and human papillomavirus infection in nasopharyngeal carcinoma Laryngoscope 108, pp.362-367 37 Sambrook J., Russel D (2003), Molecular Cloning 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA 57 38 Shi S R., Datar R., Liu C., Wu L., Zhang Z., Cote R J., Taylor C R (2004), “DNA extraction from archival formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: heat induced retrieval in alkaline solution”, Histochem Cell Biol 122, pp 211- 218 39 Stéphane M., Sébastien V., Fabie G and Etienne D (2004), “Magnetic nanoparticle design for medical diagnosis and therapy”, J Mat Chem 14, pp 2161-2175 40 Vu M H., Dao V Q., Chu T N M., Phan T N., Nguyen T V A (2014), “Development and evaluation of DNA purification kit based on silica-coated magnetic nanoparticles for PCR product and DNA separated on agarose-gel”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 30 (3S), pp 175183 41 Vaughan, T.L., Shapiro, J.A., Burt, R.D., et al (1996) Nasopharyngeal cancer in a low-risk population—defining risk factors by histological type Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 5, pp 587-593 42 William T Seaman E A., Marion Couch., Erna M Kojic., Susan Cu- Uvin., Joel Palefsky., Allison M Deal., Jenifer Webster-Cyriaque (2010), “ Detection and quantitation of HPV in genital and oral tissues and fluids by real time PCR” Virology Journal 194 43 World Health Organization/ICO Information Centre (HPV Information Centre), (2010), “Human Papilloma virus and Related Cancers in World”, Summary Report 2010, Data sccessed, WHO Press Genva, Switzerland TÀI LIỆU INTERNET 44 http://throatcancer3000.blogspot.com/2013/01/head-and-throat-cancer.html 45 www.celebrities-with-diseases.com/heath-conditions/what-is-epstein-barr-virus6795.html 46 http://complementaryoncology.com/reports/breast-cancer/detection-of-epsteinbarr-virus-in-invasive-breast-cancers 58 47 WHO, Human papillomavirus laboratory manual, first edition 2009 http://www.who.int/immunization/hpv/learn/hpv- laboratory- manual-who-ivb2009-2010.pdf (20/12/2015) 48 http://www.clpmag.com/2015/05/may-2015-product-spotlight-moleculardiagnostics 49 https://www.qiagen.com/vn/shop/sample-technologies/dna/dnapreparation/qiaamp-dna-ffpe-tissue-kit/ 50 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4463578 51 https://lifescience.roche.com/shop/products/high-pure-ffpet-dna-isolation-kit 52 https://www.fishersci.com/shop/products/mgmx-ffpe-tot-nuc-acid-isokit/4463365 53 http://www.google.com/patents/US5705628 54 http://cullenlab.duhs.duke.edu/research/ebv 55 https://voer.edu.vn/m/virus-va-ung-thu/ca163929 56 http://photoscience.la.asu.edu/ 57 http://www.omicsonline.org/JCSTimages/JCST-06-177-t002.html 59 ... 2.2.1 Chế tạo đệm cho kit tách chiết 23 2.2.2 Tách chiết DNA từ tiêu cố định mẫu mô ung thƣ hạt nano từ bọc silica đệm pha chế 24 2.2.3 Tách chiết DNA từ tiêu cố định mẫu mô ung. .. - Nguyễn Thị Huyền CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA TỪ CÁC TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH MẪU MÔ UNG THƢ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ VIRUS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC... nhân virus gây bệnh ung thƣ, tiến hành nghiên cứu ? ?Chế tạo thử nghiệm kit tách chiết DNA từ mẫu tiêu mô ung thư sử dụng hạt nano từ bọc silica đệm phù hợp để phát số virus gây bệnh? ?? với mục tiêu