Nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định mô ung thư

Đ Ạ I H Ọ C QƯÓC G IA HÀ NỘ I BÁO CÁO TỎNG KÉT K Ế T Q UẢ T H ự C H IỆ N ĐỀ T À I K H & C N CÁ P Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA Tên đề tài: Nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN ARN từ tiêu cố định mẫu mơ ung thư Mã số đề tài: QG.16.22 Chủ trì đề tài: PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh P h ò n g th í n g h iệm trọ n g điểm C ô n g ng h ệ E nzym v P rotein T rư n g Đ ại học K h o a học T ự nh iên ĐẠ! HỌC Q U ỗ C GIA H A Nụ TRUNG TÂM THÒNG TIN THƯ VIEN CCCGCCCO^M Hà Nội , 2017 I PHẦN I THÔNG TIN CHUNG 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN ARN từ tiêu cố định mẫu mô ung thư 1.2 Mã số: QG.16.22 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài Đon vị cơng tác Vai trò thực đề tài PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Trường ĐHKHTN Chủ nhiệm đề tài GS.TS Phan Tuấn Nghĩa Trường ĐHKHTN Thành viên TS Phạm Thị Thu Hường Trường ĐHKHTN Thành viên PGS.TS Nguyễn Hoàng Nam Trường ĐHKHTN Thành viên CN Trần Thị Mỹ Trường ĐHKHTN Thành viên CN Nguyễn Thị Huyền Trường ĐHKHTN Thành viên TS Nguyễn Hòa Anh Cơng ty ANABIO R&D Thành viên TS Hồng Quốc Trường Bệnh viện QĐTƯ108 Thành viên PGS.TS Trần Vân Khánh Trường ĐH Y Hà Nội Thành viên TT Chức danh, hoc vi, ho tên 1.4 Đou vị chủ trì: T rư n g Đại học Khoa học T ự nhiên • o 1.5 Thòi gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: 1.5.2 Gia hạn (nếu có): 1.5.3 Thực thực tế: # • • • từ tháng năm 2016 đến tháng 12 năm 2017 Không từ tháng năm 2014 đến tháng 12 năm 2017 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): ( v ề m ụ c tiê u , n ộ i d u n g , p h n g p h p , k ế t q u ả n g h i ê n c ứ u v t o c h ứ c t h ự c h iệ n ; N g u y ê n n h â n ; Ỷ kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tổng kinh phí đưọ’c phê duyệt đề tài: 665.000.000đ (sáu trăm sáu mươi lăm triệu đồng) PHẦN II TỎNG QUAN KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u Đ ặt vấn đề Sử dụng nến paraíin bảo quản lâu dài mô ung thư phương pháp hiệu giúp cung cấp nguồn mẫu dự trữ dồi có chất lượng ổn định cho nghiên cứu, xét nghiệm thường quy bệnh viện chẩn đoán dịch tễ học phân từ quymơ lớn Trong tách chiết ADN ARN từ tiêu mơ ung thư cố định íòrmalin thể vùi parìn (formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, gọi tắ t mô ung th FFPE) bước giúp phát dấu ấn phân từ liên quan đến ung thư sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử như: giải trình tự gen, Real time PCR nhàm xác định xác đột biến gen hay định lượng mức độ biểu gen thị ung thư giúp bác sỹ lâm sàng tiên lượng bệnh, chân đốn xác định điều trị thuốc hướng đích hiệu (Ahmad-Neiad et al., 2015; Gilbert et al., 2007) Hiện việc tách chiết ADN ARN từ tiêu mô ung thư FFPE gặp nhiều khó khăn, hàm lượng ADN/ARN thấp ADN/ARN bị đứt gãy sau tách chiết, gây trở ngại cho kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân từ sử dụng ADN/ARN tách chiết làm khuôn phản ứng (Masuda et al., 1999; Macabeo-Ong et al., 2002; Shi el al., 2004; McSherry et al., 2007) Dựa - 1- tảng nguyên lý phương pháp Boom (Boom et al., 1990), nhiều công ty sinh phấm giới tạo kit tách chiết ADN/ARN từ mẫu mô ung thư FFPE dựa công nghệ cột màng silica Một số sinh phẩm sử dụng phổ biến khoa xét nghiệm bệnh viện kể đến ReliaPrep™ FFPE DNA Miniprep System, ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep System (Promega), Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (Stratect) Tuy vậy, hạn chế phương pháp thời gian thực nghiệm dài với số lượng mẫu lớn, không tự động hóa quy trình tinh nên có khả nhiễm chéo cao mẫu lần thao tác Để khắc phục nhược điểm này, công ty sinh phẩm hóa chất phát triển kit sử dụng hạt oxit sắt từ tính bọc silica (Fe3 /SiC>2 ) kích thước micromet Các phân tử nucleic acid sau liên kết với hạt micro từ bọc silica giữ lại tách riêng khỏi protein, hợp chất khác nhờ nam châm Nucleic acid thu dạng tinh tách khỏi hạt micro từ bọc silica dung dịch đệm có nồng độ muối thấp nước cất (Stephane et al., 2004) Một số kit thương mại sử dụng hạt micro từ tính bọc silica MagMAX FFPE DNA isolation kit (Thermo Scientiíic, Mỹ), Maxwell 16 FFPE Tissue LEV DNA Puriíication kit (Promega, Mỹ), SaMag™ FFPE DNA Extraction Kit (Sacace, Ý) với quy trình đơn giản thời gian tách chiết rút ngắn khoảng tiếng cho 24-96 mẫu tùy vào số giếng giá nam châm hệ thống tách chiết tự động Ở Việt Nam chưa có cơng ty sản xuất kit tách chiết ADN ARN từ mô ung thư FFPE Vi vậy, khoa xét nghiệm thuộc bệnh viện tuyến Trung ương phải sử dụng kit nhập ngoại với giá thành cao (100-150 nghìn đồng/phản ứng) cho bệnh nhân tự nguyện chi trả xét nghiệm Do vậy, việc chủ động tạo kit cần thiết để chuyển giao công nghệ, sản xuất ứng dụng kit có chất lượng tương đương với kit ngoại nhập, giá thành cạnh tranh, phục vụ việc chẩn đoán bệnh viện Mục tiêu: nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN ARN từ tiêu cố định mẫu mơ ung thư thể vùi parĩn (gọi tắt ]à ADN ARN từ mô ung thư FFPE) công nghệ hạt nano từ bọc silica với ưu điểm: hiệu suất tách chiết cao, thời gian tách chiết ngắn, giá thành giảm khoảng lần so với kit nhập ngoại Phương pháp nghiên cứu Tổng hợp hạt nano từ tỉnh FejŨ 4@ SỈO : Đầu tiên, lỗi hạt nano từ tính Fe3 Ơ4 tổng hợp bàng phương pháp đồng kết tủa cách hòa tan FeCl2 H với FeCỈ3 nước khử ion, khuấy máy khuấy từ (IKA RW 20 digital) nhiệt độ 60°c Sau đó, NH OH 11% tiếp tục thêm vào dung dịch phản ứng khuấy 90 phút để tạo mầm tinh thể Sau đưa nhiệt độ phòng, hỗn dịch chứa mầm tinh thể Fe Ơ4 rửa với cồn ethanol lần với nước khử ion lần Trong bước tạo lớp bọc silica, hỗn dịch hạt nano từ Fe3 đưa vào dung dịch gồm ethanol, nước khử ion, ammonia solution NH 28% TEOS với tỷ lệ khác TE S:Fe3 NPs 1; 8,9 17,8 Hỗn họp rung sóng siêu âm (Elmasonic S15H) với thời gian 5, , 15 30, 45, 60, 90 phút để tạo hạt nano Fe3 Ơ4 @ S 1O2 phân tán tốt nước-cồn có độ dày lóp silica khác nhau, cấu trúc hạt phân tích bàng phổ nhiễu xạ tia X (X Bruker D5005 X-ray), kỹ thuật kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM JEM1010, JEOL), phổ hồng ngoại (FT/IR-6300, JASCO, đo từ độ thông qua thông số đường cong từ trễ (VSM) để chọn lựa loại hạt đại diện: có khác biệt độ dày lớp S1 O2 từ độ (Nguyen et al., 2014; Nguyen et al., 2017) Pha c h ế đệm : Các đệm pha chế tham khảo từ nghiên cứu trước (N guyen et al., 2014) cải tiến, tối ưu cho phù họp cho việc tách chiết ADN/ARN từ mô ung thư FFPE Các muối, acid hữu (Guanidin HC1, Guanidin SCN, Tris-HCl, EDTA, Natricitrat, acid citric, Kali -2- acetat, SDS) muối, acid vô (NaCL CaCỈ2 , HCL.) với nguyên liệu khác Proteinase K, cồn ethanol sừ dụng làm nguyên liệu để pha chế nên đệm gồm: đệm ]y giải mô (Lysis Buffer 1, 2, gọi tắt LB1-01, LB2-01, LB3-01 cho ADN; LB1-02, LB2-02, LB3-02 cho A R N ), đệm gắn lên c ộ t s ilic a ( B in d in g B u ffe r 1, 2, g ọi tắt B B -0 , B B -0 , B B 3-01 cho ADN; BB1-02, BB2-02, BB3-02 cho ARN), đệm rửa mẫu (Washing Buffer 01-1 01-2, 02-1, 02-2 gọi tắt WB01-1, WB01-2 cho ADN, WB02-1, WB02-2 cho ARN), đệm chiết đẩy (Elution Buffer 1, gọi tắt EB1 cho ADN, EB2 cho ARN) Trong đó, hai loại đệm quan trọng Lysis Binding buffer thử nghiệm, so sánh để chọn đệm phù họp cho kit tách chiết ADN ARN từ mô ung thư FFPE Các đệm vvashing elution nhiều thay đổi so với đệm từ nghiên cứu trước nên thừa hường từ nghiên cứu trước nhóm (Nguyen et al., 2014; Nguyen et al., 2017) - Thu thập mẫu mô ung thư FFPE: 10 mẫu mơ FFPE nghi ung thư vòm mũi họng (UTVMH) cung cấp Khoa Sinh lý bệnh,-Học viện Quân Y; 30 mẫu mô FFPE nghi ung thư đại trực tràng (ƯTĐTT) cung cấp Trung tâm nghiên cứu Gen Protein - Đại học Y Hà Nội; 30 mẫu mô FFPE nghi ung thư tuyến giáp (UTTG) cung cấp bời bệnh viện TWQĐ 108 - Tách chiết AD N A R N từ mẫu mô ung thư FFPE sử dụng hạt nano từ bọc silỉca hệ đệm phù họp: việc tách chiết tiến hành giá nam châm 12-giếng 24-giếng (cũng sản phẩm tạo đề tài này), gồm có bước chuẩn bị quy trình tách mẫu, tóm tắt sau: Chia mẫu: Mầu mơ vùi parin cắt thành lát mỏng có độ dày khoảng lmm, dài khoảng 20-50 mm Dùng cân tiểu ly cân lát cắt mô khoảng 10 mg/phản ứng; Xử lý parâíìn: mẫu xử lý với dung dịch dầu khống để loại bỏ lóp parĩn Sau đó, sừ dụng cồn nước để rửa lượng dầu khống sót lại, giữ lại mơ; Quy trình tách ADN ARN từ mẫu mơ vùi parìa: Đầu tiên, 20 |il proteinase K 200 |il LB (là LB1-01, LB2-01, LB3-01 cho ADN; LB102, LB2-02, LB3-02 cho ARN) bổ sung vào 10 mg mẫu mô ung thư loại bỏ parĩn dầu khống Nếu tách chiết ADN , mẫu ủ 60°c đế ly giải mơ giải phóng ADN, tiếp tục ủ 90°c để loại bỏ liên kết chéo Nếu tách chiết ARN, mẫu ủ 60°c 15 để ly giải mơ giải phóng ARN, tiếp tục ủ 80°c 30 phút để loại bỏ liên kết chéo 400 ụ\ BB (BB1-01, BB2-01, BB3-01 cho ADN; BB1-02, BB2-02, BB3-02 cho ARN), 200 ụ\ isopropanol 50 Ịil hạt nano từ bọc silica (hạt MagSi nano) (M l, M2, M3) bổ sung vào mẫu để ADN ARN gắn lên hạt MagSi nano Mầu đặt lên giá nam châm để tập trung phức hệ hạt gắn ADN ARN loại bỏ tạp chất 500 |il WB1-1 500 |il WB2-1 bổ sung vào hạt để rửa bỏ tạp chất sót lại trước chiết đẩy ADN khỏi hạt 50 ụ.1 EB1 500 Ịil WBl-2 500 |il WB2-2 bổ sung vào hạt để rửa bỏ tạp chất sót lại trước chiết đẩy ARN khỏi hạt 50 |il EB2 ADN/ARN bảo quản 20°c sử dụng cho phản ứng PCR, real time PCR, real time RT-PCR Kit thương mại dùng để so sánh MagMAX FFPE DNA isolation kit (Thermo Scientiíĩc, Mỹ), ReliaPrep™ FFPE DNA Miniprep System (Promega), Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (Stratec) ReliaPrep™ FFPE Total ARN Miniprep System (Promega) Đánh giá nồng độ độ tinh ADN/ARN: thực bàng phương pháp đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm 280 nm máy quang phổ kế Nanodrop 2000 Đánh giá mức độ đứt gãy cùa ADN sau tách chiết thực phương pháp điện di ADN tách chiết gel agarose 1,5-2% (Nguyen et al., 2014; Nguyen et al., 2017) - Đánh giá chất lượng A D N sau tách chiết sử dụng cho ứng dụng thực bàng phương pháp kiểm định (assay) sau: -3- • PCR nhân đặc hiệu đoạn gen 252 bp gen dấu chuân ung thư BRAF hỗ trợ xét nghiệm ung thư đại trực tràng sử dụng ADN tinh kit làm khuôn (DeRoock et al., 2010) Trình tự mồi gồm: BRAF-Fw - TCATAATGCTTGCTCTGATAG- 3’ BRAF-Rv 5’CTTTCTAGTAACTCAGCAGC - 3’ Chu trình nhiệt gồm 95°c phút; 35 chu kỳ gồm bước: 95°c 30 giây, 58°c 30 giây, 72°c 30 giây ; 72°c phút • Giải trình tự gen sản phẩm PCR để phát số đột biến gen dấu chuẩn BRAF Sản phẩm PCR nhân đoạn gen đặc hiệu BRAF điện di gel agarose 1,5-2% để kiểm tra độ sáng vị trí băng sau tinh ANAPURE PCR & Gel Purifícation kit (ANABIO R&D), gửi mẫu giải trình tự (IDT, Mỹ) Trình tự ADN phân tích phần mềm ApE (Đại học Uta, Mỹ) kết họp sở liệu tin sinh học NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/') • Real time PCR Taqman probe để phát đột biến gen dấu chuẩn ung thư BRAF (V600E), KRAS-1, KRAS-2 (G12A/D/R/V/C/S; G13D), HRAS (G12V, G13R, G61R), NRAS (Ọ61H/K/R/L) bàng Thyroid Cancer Mutation Analysis Kit (Entrogen), phát virus gây bệnh ung thư Epstein-Barr-EBV kết họp định lượng gen giữ nhà P-globin để đánh giá tính tồn vẹn ADN tách chiết (Niesters et al., 2000) Trình tự mồi probe phát EBV gồm: EBV-Fw 5’- GGAACCTGGTCATCCTTGC- 3’, EBV-Rv 5’- ACGTGCATGGACCGGTTAAT 3’, EBV-Probe ,-(FAM)-********TCGTACTGCTCGCT-(TAMRA)-3 , Chu trình nhiệt gồm 95°c 10 phút; 45 chu kỳ gồm bước: 95°c 30 giây, 60°c 45 giây • Nested real time SYBR kết họp với giải trình tự gen để phát genotype Human Papillomavirus-HPV (DeRoda Husman et al., 1995; Herraez-Henandez et al., 2013) Trình tự mồi probe phát HPV gồm: HPV- Fw l, 5’- TTT AAT AAR CCA TAT TGG YTR CA ’, HPV- R vl, HPV-Fw2 5’- ATT CAT AGT ATG WAT ATA KGY CAT - 3’, HPV- Rv2 5’GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT c - \ - Đánh giá chất lượng A R N sau kh i tách chiết: ARN đánh giá sừ dụng làm khuôn cho ứng dụng thông qua phương pháp kiểm định tiêu chuẩn sở (assay) định lượng mức độ biểu mARN gen dấu chuẩn ung thư (TSHR) kết họp định lượng gen nội chuẩn GAPDH để đánh giá tính tồn vẹn ARN tách chiết Các mồi probe sử dụng nghiên cứu tham khảo theo nghiên cứu trước (Tanaka et al., 2000; Roddiger et aỉ., 2002; Barber et al., 2005) cải tiến để đạt độ nhạy tốt hơn, bao gồm: GAPDH- Fw 5’TCATAATGCTTGCTCTGATAG- ’, GAPDH- Rv 5’- CTTTCTAGTAACTCAGCAGC -3% GAPDH- Probe 5’-HEX-TCCGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-MGBNFQ-3', TSHR- Fw 5'CCTTCACCTCACACGGGCT-3', TSHR- Rv 5'-TGCTCTCATTACACATCAAGGACTC-3', TSHR- Probe 5’-FAM- ********CACTGCTGTGCC-BHQ-3\ Chu trình nhiệt gồm 50°c 30 phút; 95°c 10 phút; 45 chu kỳ gồm bước: 95°c 30 giây, 60°c 45 giây Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Xây dựng quy trình chế tạo sử dụng kit tách chiết DNA từ tiêu cố định mẫu mô ung thư 4.1.1 Tổng họp xác định cấu trúc, tính chất hạt nano từ tính từ bọc silica FeỉƠ 4@ SìOị Quy trình chế tạo hạt phù họp cho việc tách chiết ADN/ARN từ tiêu mô ung thư FFPE mô tả chi tiết Phụ lục Tuy nhiên, trước lựa chọn hạt phù họp, thực tổng họp loại hạt có tính chất khác theo phương pháp mô tả trên, kết phân tích 03 loại hạt nano Fe3 Ơ4 @ S1 O2 đại diện (ký hiệu M l, M2, M3) lựa chọn để sử dụng cho việc thử nghiệm tách chiết ADN/ARN -4- Hình 1A phổ nhiễu xạ mẫu hạt nano Fe3 Ơ (a), Fe3 Ơ4 @Si0 với tỉ lệ mol TEOS:Fe3 Ơ 17,8 thời gian siêu âm 10 phút (b) 60 phút (c) Các đỉnh phổ nhiễu xạ góc 20 = 30,4°, 35,7°, 43,3°, 53,9°, 57,3°, 62,9° tương ứng với mặt (220), (311), (400), (422), (511) (440) Kết hạt nano Fe3 Ơ4 NPs có cấu trúc “cubic spinel” đảo với số mạng a = 8,36 Â so sánh với phổ chuẩn JCPDS Card No (79 - 0417) Vị trí đỉnh góc 20 khoảng 20°-30° hạt nano Fe3 @SiƠ xác định lớp vô định hình silica Kích thước trung bình tinh thể Fe3 tính cơng thức Debye-Sherrer có giá trị 10,7 nm Hình 1B phổ FTIR SĨƠ2 , hạt nano Fe3 Ơ Fe Ơ @Si0 chế tạo với tỉ lệ TEOS:Fe3 Ơ 17,8 điều kiện siêu âm thời gian 10 p h ú t, 30 phút and 60 phút Trong tất phổ, vùng xung quanh 1600 and 3400 ciĩT dao động liên kết H-O-H hấp thụ nước (TLTK) Trong phổ hạt nano Fe3 Fe3 @SiC>2 có vùng hấp thụ 500 Cĩĩf dao động liên kết F e-0 Vùng 1060 cm~' dao động o liên kết Si-O-Si S 1O2 Két chứng tỏ Fe3 NPs bọc thành công S1O Theta (degree) Wavenumber(cm ') (A) (B) Hình 1: Phổ nhiễu xạ tia X phổ FTIR mẫu (A): Phổ nhiễu xạ tia X hạt nano Fe30 tổng hợp (a), Fe3 @ Si với tỷ lệ mol 17,8 thời gian siêu âm 10 phút (b) 60 phút (c), (B): phổ FTIR S i0 2, hạt nano Fe30 Fe30 4@Si02 chế tạo với tỷ lệ mol TE0S:Fe30 17,8 theo phương pháp siêu âm 10 phút, 30 phút 60 phút Hìah ảnh TEM hạt nano Fe3 Ơ4 (a) Fe3 @Si0 với tỉ lệ mol TEOS:Fe3 C>4 17,8 chế tạo với thời gian siêu âm 10 phút, 30 phút and 60 phút Phân bố kích thước hạt Hình (b), (h), (j) and (1) Kích thước trung bình hạt nano Fe 10,7 nm hạt lano Fe3 @SiƠ2 điều kiện siêu âm 10 phút 23,4 nm hai loại hạt cỏ dạng gần hình cầu Khi thời gian siêu âm tăng lên 30 60 phút, kích thước trung bình hạt nano Fe3 (§Si0 tăng 34,9 nm 43,1 nm Tăng thời gian siêu âm làm tăng kích thước hạt nano tăng lượng silica bọc hạt Kết nhiễu xạ tia X bề mặt hạt nano Fe3 bcc thành công nhờ sử dụng sóng siêu âm Điều quan sát ảnh TEM hạt nano Fe;C>4 @Si0 với tỉ lệ mol TEOS:Fe3 C>4 (Hình 2c), 8,9 (Hình 2e) 17.8 (Hình 2i) chế -ạo điều kiện siêu âm 20 phút Phân bố kích thước thể tương ứng trong hình 2d, 2f 2j Khi tỉ lệ mol TEOS:Fe3 Ơ tăng từ đến 8,9 17,8, kích thước hạt trung, bình Fe3 @SiC>2 tăng từ 14,5, 24,4 34,9 nm Có thể kết luận tăng thời gian siêu âm làm tăng kích thước hạt nano tàng lượng silica bọc hạt -5- 55 [— 50 45 40 35 ■ầ 30 (0 (b) =24.4mn 25-ĩ 20 15 10 50 a Sizc distribưtion - G aussian F ittin g d=10.7nm k£'Si Sizc distribution — (iỉussian KỊtting - 20 25 30 35 40 45 50 55 15 20 25 30 35 40 45 Particles si/c(nm) Particlcs size(nin) 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Particles size(nra) 100 nm 55 50 45 40 35 30 25 (h) 23.4nm Size distnbution 20 15 Gaussian Pitting I 10 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Particles sizc(titn) 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Partiđes size(nm) 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Particles size(nm) 1lình 2: Hình ảnh TEM NPN Fei0 (a) Fe3 @ SÌO2 NP với tỷ lệ mol TEOS: Fe3 Ơ4 (c), 8,9 (e) 17.8 (i) chế tạo với thời gian siêu âm 30 phút Sự phân bố kích thước chúng thể tương ứng Hình (b), (d), (í) (j) Fe3 Ơ4 @ SÌO2 NPs với tỷ lộ mo! TEOS: Fe3 NPs 17,8 che tạo với thời gian siêu âm 10 phút (g), 30 phút (i) 60 phút (k) Sự phân bố kích thước chúng thê lương ứng Hình (b), (h), (j) (1) Hình 3A đường cong từ hóa của hạt nano Fe3 Ơ4 Fe3 C>4 @Si0 với ti lệ mol TEOS:Fe3 17,8 thời gian siêu âm 10, 30 60 phút nhiệt độ 300 K Tất đường cong cho thấy tính chất siêu thuận từ với lực kháng từ nhỏ Từ độ bão hòa hạt nano Fe 60,9 emu/g 11 kOe sau giảm xuống lớp silica phủ lên bề mặt hạt Lý giảm hấp thụ bão hòa quan sát giải thích bàng có mặt vỏ silica xung quanh hạt làm suy yếu tính chất từ lõi hạt từ từ bên Hình 3B cho thấy từ độ bão -6- hòa hạt nano Fe3 Ơ4 Fe3 @Si0 với tỷ lệ mol TEOS:Fe3 Ơ , 8,9 17,8 với thời gian siêu âm đến 120 phút 300 K Kết cho thấy từ độ bão hòa mol tỷ số TEOS: Fe3 Ơ NPs có khuynh hướng giảm với thời gian siêu âm gia tăng, sau đạt đến giá trị khơng thay đổi khống 30 phút Time (min) (B) (A) Hình 3: Các đường cong từ hóa từ độ bão hòa cùa hạt nano Fe30 Fe30 @ SĨƠ2 , (A): Các đường cong từ hóa hạt nano Fe30 Fe30 @Si với tỷ lệ mol TE0S:Fe30 17,8 theo với thời gian siêu âm 10, 30 60 phút 300 K Trong hình hình A cho thấy đường từ hóa với từ trường khoảng từ -100 Oe đến 100 Oe (B) Từ độ bão hòa hạt nano Fe30 Fe30 @Si với ti lệ mol TEOS:Fe3 Ơ4 1, 8,9 17,8 với thời gian siêu âm 120 phút nhiệt độ 300 K Từ kết này, chọn hạt nano Fe3 @Si0 (mẫu M l, M2 M3) cho ứng dụng Bảng 1, ừong MI Fe3 Ơ4 @ S 1O2 chế tạo với tỉ lệ mol TEOS: Fe3 NPs với thời gian siêu 30 p h ú t; M2 Fe3 @ S 1O NPs chế tạo với tỷ lệ mol TEOS Fe3 Ơ4 NPs 8,9 với thời gian siêu âm 30 phút; M3 Fe3 Ơ4 @ S 1O2 NPs chế tạo với tỷ lệ mol TEOS: Fe3 Ơ NPs 17,8 với thời gian siêu âm 30 phút Bảng 1: Dặc điểm 03 loại hạt nano từ Fc 30 @Si0 No Tính chất bọc silica Giá trị MI M2 M3 Nồng độ (mg/ml) 25, 50, 75 25 25 Từ độ bão hòa hạt nano lõi Fe30 (emu/g) 60.9 60.9 60.9 Từ độ bão hòa hạt nano Fe30 4@Si02 (emu/g) 50.2 18.6 10.3 Đường kính trung bình hạt nano lõi Fe30 (nm) 10,7 10,7 10,7 Đường kính trung bình hạt nano Fe30 4@Si02 (nm) 14.5 24.4 34.9 4.1.2 Tối ưu đệm Lysis Binding Buffer p h ù hợp với tách chiết A D N từ mô FFPE Trong q trình tối ưu kít tách chiết ADN từ mơ ung thư FFPE, thực tối ưu đệm Lysis Binding buffer đệm quan trọng định thành công kit tách chiết Ba loại đệm Lysis Binding pha chế, có thành phần kí hiệu LB1-01 + BB1-01 (bộ đệm 1-DNA), LB2-01 + BB2-01 (bộ đệm 2-DNA), LB3-01 + BB3-01 (bộ đệm 3-7 - DNA) Để phục vụ cho thí nghiệm này, chúng tơi ngẫu nhiên chọn hạt nano mã số MI đê kết họp với đệm trình tách chiết ADN Thí nghiệm tiến hành mẫu mơ bệnh nhân ung thư đại trực tràng (ký hiệu BN 1-5), sử dụng ba loại đệm khácnhau với loại hạt M l Mỗi thí nghiệm sử dụng 10 mg lát cắt mô FFPE, lặp lại lần Nồng độ ADNcủa bệnh nhân tách chiết ba đệm trinh bày Hình 250 0 - ĩ ơ> c < z Q c ,