Nghiên cứu quy trình tách chiết beta glucan (β – glucan) từ bã men bia thu nhận tại công ty TNHH nhà máy bia heineken việt nam – đà nẵng bằng phương pháp sinh học

β-glucan từ thành tế bào nấm men dùng để sử dụng như một yếu tố kích thích hệ miễn dịch và tác động tích cực đến hệ thống bảo vệ vật chủ, tăng tính đề kháng của vật chủ đến hầu hết các l

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH

CHIẾT BETA-GLUCAN (Β – GLUCAN)

TỪ BÃ MEN BIA THU NHẬN TẠI

CÔNG TY TNHH NHÀ MÁY BIA

HEINEKEN VIỆT NAM – ĐÀ NẴNG

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

Đà Nẵng – Năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH

CHIẾT BETA-GLUCAN (Β – GLUCAN)

TỪ BÃ MEN BIA THU NHẬN TẠI

CÔNG TY TNHH NHÀ MÁY BIA

HEINEKEN VIỆT NAM – ĐÀ NẴNG

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

Ngành: Công Nghệ Sinh Học

Người hướng dẫn: Ths Lê Vũ Khánh Trang

Đà Nẵng – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố

Đà Nẵng, tháng 4 năm 2018

Tác giả khóa luận

NGUYỄN THỊ THẢO

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khóa luận này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn

bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Th.S Lê

Vũ Khánh Trang – giảng viên Khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suất quá trình hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học, cũng như các thầy cô thuộc Khoa Sinh – Môi Trường đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cảm ơn Công ty TNHH Nhà Máy Bia Heineken Việt Nam – Đà Nẵng

đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi làm nghiên cứu trong suốt thời gian qua

Đồng thời, tôi xin gửi lời tri ân tới gia đình tôi và bạn bè sinh viên làm việc tại phòng thí nghiệm thuộc Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã tạo điều kiện, quan tâm và động viên, góp phần cho tôi trong suất quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này thật tốt đẹp

Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THỊ THẢO

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Số hiệu

bảng

Bảng 1.1 Nguồn nguyên liệu chứa β-glucan 9

Bảng 1.3 Thành phần và trọng lượng các chất của thành tế bào

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của chế phẩm β-glucan lên tỉ lệ sống sót

của cá sau 16 ngày

37

Bảng 3.6 Đánh giá sự tăng trưởng của cá 39 Bảng 3.7 Đánh giá tỉ lệ sống sót của cá 40

Hình 1.5 Cấu trúc thành ngoài của nấm men 15

Hình 2.1 Bã nấm men được lấy từ nhà máy 19

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC BẢNG BIỂU iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH iv

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ BETA-GLUCAN (β-GLUCAN) 3

1.1.1 Cấu trúc 3

1.1.2 Tính chất 3

1.1.3 Vai trò của β-glucan 4

1.1.4 Ứng dụng chế phẩm β – glucan trong chăn nuôi 6

1.1.5 Một số nguồn thu nhận β-glucan 8

1.2 GIỚI THIỆU VỀ BÃ THẢI MEN BIA 9

1.2.1 Quy trình sản xuất men bia 10

1.2.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae [7],[26] 11

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ β-GLUCAN 15

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước 15

1.3.2 Các nghiên cứu nước ngoài 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Bã thải nấm men bia 18

2.2.2 Cá rô phi đầu vuông (Anabas Testudinus) 19

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 20

2.3.2 Phương pháp xác định độ ẩm [8] 21

2.3.3 Phương pháp thu nhận β-glucan bằng phương pháp sinh học 22

2.3.4 Phương pháp khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình tách chiết β-glucan bằng phương pháp sinh học 22

2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng β-glucan 23

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 27

3.1 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT β-GLUCAN 27

3.1.1 Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng tới quá trình tách chiết β-glucan 28

3.1.2 Khảo sát nồng độ enzyme ảnh hưởng tới quá trình tách chiết β-glucan 29

3.2.3 Khảo sát thời gian ủ enzyme protease tới quá trình tách chiết β-glucan 30

3.3 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT β –GLUCAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC 32

3.3.1 Xây dựng quy trình tách chiết β-glucan 32

3.3.2 Thuyết minh quy trình 33

3.2 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM β-GLUCAN VÀO KHẨU PHẦN ĂN CỦA CÁ RÔ PHI ĐẦU VUÔNG 35

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm β-glucan lên khối lượng của cá sau 16 ngày 35

3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm β-glucan ảnh hưởng tới tỉ lệ sống sót của cá sau 16 ngày 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

1 KẾT LUẬN 38

2 KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam, các nhà máy sản xuất bia ngày càng phát triển mạnh cả về số lượng và quy mô, mang lại giá trị kinh tế cho đất nước Tuy nhiên, cùng với sự phát triển này thì lượng bã thả men bia khổng

lồ được thải ra ngoài môi trường Tính trung bình cứ sản xuất 1000 lít bia thì

10 kg men bia thải với độ ẩm trung bình khoảng 85% [39] Trong đó lượng bã men này chủ yếu để chế biến thức ăn cho vật nuôi hoặc được dùng như một nguồn nguyên liệu rẻ tiền cho quá trình làm dịch chiết nấm men tự phân, còn lại thì thải trực tiếp ra ngoài môi trường Thành tế bào nấm men chiếm khoảng 20% trọng lượng khô của tế bào, β-gluan chiếm khoảng 50-60% lượng chất khô của thành tế bào nấm men [24],[19],[20] Chính vì thế, việc sản xuất các sản phẩm có giá trị kinh tế cao như β-gluan có thể mang lại lợi nhuận cho các nhà máy đồng thời giảm thiểu tác động về mặt môi trường

Đã có nhiều nghiên cứu tách chiết β-gluan từ tế bào nấm men, tuy nhiên nguồn nguyên liệu đầu vào ở mỗi loại bia, mỗi nhà máy là khác nhau Tại Công ty TNHH Nhà Máy Bia Heiniken Việt Nam - Đà Nẵng sử dụng nguồn nguyên liệu thay thế là gạo với độ ẩm thích hợp 13-14% Tùy thuộc vào từng loại bia mà sử dụng nguyên liệu thay thế khác nhau, việc sử dụng nguyên liệu thay thế làm cho tỉ lệ tiếp men bia giống, thời gian ủ men ở mỗi công ty cũng khác nhau Mặt khác, có nhiều nghiên cứu về tách chiết β – glucan sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, do đó ảnh hưởng tới quá trình tách chiết β–glucan Trong đó, phương pháp sử dụng enzyme được nghiên cứu nhiều, đa

số các nghiên cứu sử dụng enzyme protease tinh sạch Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào sử dụng enzyme protease công nghiệp

Nhà máy Heiniken Đà Nẵng sản xuất chủ yếu loại bia Larue, Tiger, sản lượng bình quân năm 2015 là 150 triệu lít/1 năm, thải ra tương đương 10% bã

thải men bia [41] Để tận dụng nguồn nguyên liệu này tốt hơn, đó chính là tách chiết các hợp chất sinh học từ bã men bia này thành một chế phẩm hữu ích hơn cho ngành chăn nuôi β-glucan từ thành tế bào nấm men dùng để sử dụng như một yếu tố kích thích hệ miễn dịch và tác động tích cực đến hệ thống bảo vệ vật chủ, tăng tính đề kháng của vật chủ đến hầu hết các loại bệnh nhiễm khuẩn, nấm, virus cùng nhiều loại kí sinh vật khác Ngoài ra, nó còn được biết đến như một yếu tố miễn dịch hiệu quả trong điều trị ung thư và là chất chống oxy hóa, tái tạo da, làm mờ nếp nhăn nên được dùng để sản xuất mỹ phẩm [8][15].

Trước những thực trạng như vậy, đề tài “Nghiên cứu quy trình tách

chiết beta-glucan (β – glucan) từ bã men bia thu nhận tại Công ty TNHH Nhà Máy Bia Heineken Việt Nam – Đà Nẵng bằng phương pháp sinh học ”

được thực hiện với mục đích thu nhận được nguồn β-glucan tự nhiên ứng dụng

sản xuất thức ăn gia súc

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

- Từ kết quả nghiên cứu của đề tài này là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo về tách chiết các chất từ vi sinh vật

- Nghiên cứu góp phần ứng dụng vào quá trình xử lý bã men bia tại Công

ty TNHH Heineken Việt Nam - Đà Nẵng

- Chế phẩm giàu β-glucan ứng dụng tại các trang trại nuôi cá giống và nuôi gia cầm gia súc

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 TỔNG QUAN VỀ BETA-GLUCAN (β-GLUCAN)

1.1.1 Cấu trúc

Glucan là một biopolymer của 1,3-D-glucose (hoặc 1,6-D-glucose) được tìm thấy trên vách tế bào vi khuẩn, thực vật và nấm Glucan bao gồm những liên kết không phân nhánh của liên kết β-1,3 và liên kết β-1,4-glucopyranose tạo nên các chuỗi polysaccharide, chưa khoảng 250000 phân tử glucose [8] [29]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của β- lucan

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của β-glucan

1.1.2 Tính chất

β - glucan không tan trong ethanol, aceton nhưng tan trong NaOH ( trừ β-glucan và từ nấm ) và (CH3)2SO4 Sự hòa tan này làm giảm bậc cấu trúc hóa

học dưới tác động của chất oxy hóa mạnh

β–glucan có nguồn gốc sinh học, thường tác động đến sự tăng cường đáp ứng miễn dịch tế bào từ các kháng nguyên, nhiễm trùng, ung bướu [30],[37]

1.1.3 Vai trò của β-glucan

a β-glucan giúp tăng cường hệ miễn dịch [8],[26]

β – glucan có khả năng kích thích hệ miễn dịch chống lại mầm bệnh rất hiệu quả Một số nghiên cứu chỉ ra rằng: β-glucan có khả năng tăng cường mạnh mẽ quá trình sản xuất đại thực bào và tăng tính kháng không đặc hiệu của vật chủ đối với vi khuẩn, các loại nấm và bệnh nhiễm kí sinh trùng

β –glucan kết hợp với các thụ thể bên ngoài màng của đại thực bào và những

tế bào bạch cầu khác (bao gồm cả những tế bào tự nhiên và những tế bào tạo độc tố của cơ thể) Với sự kết hợp đặc hiệu giữa những thụ thể trên bề mặt đại thực bào các tác nhận lạ, β-glucan có tác dụng phát hiện sự xâm nhập hoặc bám vào cơ thể của các nhân tố bất lợi và cảnh báo cho cơ thể biết

β – glucan kết hợp rất đặc hiệu với các bạch cầu và gây ra những phản ứng chuỗi dẫn đến làm tăng hoạt tính miễn dịch như:

- Sản xuất ra những thế bào bạch cầu từ tủy xương, bao gồm: đại thực bào, bạch cầu trung tính và hồng cầu

- Huy động các tế bào bạch cầu máu có khả năng nhận diện “kẻ thù” và di chuyển đến nơi có tác nhân lạ

- Hoạt tính thực bào của bạch cầu cần tiêu diệt các tế bào bên ngoài xâm nhập vào

- Sản xuất ra các tác nhân kháng vi sinh vật tăng cường sự đặc hiệu của hệ thống miễn dịch

β-glucan có thể kích thích đại thực bào, vì vậy làm tăng quá trình sản xuất interleukins, cytokines và kháng thể đặc hiệu cho quá trình kích hoạt toàn bộ

hệ thống miễn dịch của cơ thể Sau đó, cơ thể đã sẵn sàng chống lại và trung hòa mầm bệnh xâm nhập được gây ra bởi các vi sinh vật Ngoài ra, β – glucan còn giúp tăng tốc độ phục hồi của các mô bị tổn thương và kích hoạt các thành phần khác của hệ thống miễn dịch

β – glucan cũng kích hoạt sản xuất các tế bào bạch cầu ở trong tủy xương Quá trình sản xuất tủy xương bị suy giảm, có nghĩa là giảm số lượng bạch cầu

và gia tăng nguy cơ nhiễm bệnh và ung thư

β – glucan có thể gia tăng sức đề kháng của chuột với bệnh bạch cầu

lympho do sự lây nhiễm Staphylococcus aureus β – glucan có ảnh hưởng đến

tất cả các động vật có vú, chim, cá và đặc biệt miễn dịch gia tăng trên một số loài cá [9]

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác còn cho thấy hiệu quả tích cực của β – glucan trong việc điều trị các khối u nhọt ác tính, bệnh HIV, sự biến chứng của các vết thương [16] Đồng thời, β – glucan còn tăng cường đặc hiệu của các loại thuốc kháng sinh và kháng virus

b β – glucan tác động lên tế bào ung thư [29],[33]

Các nghiên cứu trên động vật cho thấy rằng, β – glucan ngăn cản sự phát triển của ung thư ruột già, phổi, dạ dày, tuyến tiền liệt cổ, bang quang và não cũng như các bệnh bạch cầu Tín hiệu của sự ức chế này trên động vật ở điều kiện sống không có thời điểm rõ ràng, nhưng nó cung cấp một ý tưởng mới về tiềm năng của β – glucan Ngoài ra, β – glucan còn ngăn cản dấu hiệu của ung thư thông qua sự tăng cường quá trình lão hóa tế bào ung thư

Cơ chế chống ung thư gồm các con đường cơ bản sau:

- Bảo vệ những tế bào khỏe mạnh khỏi tế bào ung thư

- Tăng cường khả năng hoạt động của hệ thống miễn dịch để tìm và tiêu diệt những tế bào ung thư

- Giúp kiểm soát lại quá trình phân chia và lão hóa tế bào

- Giúp ngăn cản sự di căn của tế bào ung thư

1.1.4 Ứng dụng chế phẩm β – glucan trong chăn nuôi

Đã có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng β glucan trong chăn nuôi thủy sản,

gia cầm và gia súc Các nghiên cứu chỉ ra rằng khi cho sinh vật ăn thức ăn có

trộn với β - glucan cho tỷ lệ sống cao hơn, khỏe mạnh và tăng sức đề kháng

a Đối với nuôi trồng thủy sản

- Đối với cá [9] [20]

β – glucan có hiệu quả kích thích miễn dịch không đặc hiệu trên một số

loài cá Sự kích thích miễn dịch được nghiên cứu trên nhiều loại cá Tác nhân kích thích miễn dịch gắn với các thụ thể một cách đặc hiệu trên bề mặt của thể thực bào và lympho bào Nhờ hoạt động này của tế bào sẽ đưa các kết quả làm gia tăng sản xuất enzyme có thể tiêu diệt cơ chế gây bệnh, các thông tin hóa học (interferon, interleukine và các protein bổ trợ) mà kích hoạt các yếu tốt cảnh báo của hệ thống miễn dịch và tăng cường hoạt động của tế bào lympho

“B” và “T”

β – glucan có độ nhớt cao giúp cho sinh vật ăn ngon miệng hơn β – glucan

bổ sung vào thức ăn của cá hoặc cá nuôi, ngâm phôi hoặc tôm bột của cá biển với β – glucan sẽ giúp cá đề kháng tốt hơn với các độc tốt và cải thiện mức độ tăng trưởng

Nó cần thiết cho sự vận chuyển cá nhằm gia tăng sức đề kháng, tránh cá vận chuyển bị stress, vì stress sẽ làm hạn chế khả năng miễn dịch β – glucan giúp làm giảm bớt ảnh hưởng của stress và ngăn ngừa cá bị bệnh Nó làm lành vết thương mau hơn, hạn chế sự tiếp xúc bề mặc với độc tố có trong nước Không những thế nó còn tích cực chống lại các khối u, bướu và trường hợp cá bị dị thường

Khi bổ sung β – glucan vào khẩu phần ăn cùng với vitamin và acid béo không bão hòa β – glucan như một vật mang chất bổ dung vào dinh dưỡng, nó

là tiềm năng làm tăng chất lượng thức ăn, giúp cá khỏe hơn cũng như giúp cho

cá sống lâu hơn β – glucan kích thích vi khuẩn có lợi trong đường tiêu hóa như

là một trong những yếu tố của men tiêu hóa, xem như là một nguồn “vitamin”,

bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ đun và không chịu ảnh hưởng của nhiệt độ cao hay quá trình kết viên thức ăn

- Đối với tôm [6],[12]

Cho đến nay, β – glucan được sử dụng rất thành công như là tác nhân kích thích miễn dịch để tăng sức đề kháng chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và virus

Khi sử dụng β –1,3 và β – 1,6- glucan chiết xuất từ nấm men giúp tăng tính kháng đối với vi khuẩn Vibrio và sự nhiễm virus gây trên bệnh đốm trắng β –1,3-glucan làm tăng hoạt động đại thực bào, sự kết dính tế bào và sinh ra anion supeixide khi thêm vào thức ăn Peptidoglycan là những phân đoạn của vách tế bào vi sinh vật có thể giúp tăng tính kháng thể khi nhiễm vi khuẩn Thức ăn tôm bổ sung peptidoglycan đáp ứng kích thích miễn dịch chống lại sự xâm nhập virus Hệ thống miễn dịch của tôm có chỉ số protein cao Protein liên quan đến

sự nhận biết β – glucan bên ngoài thông qua liên kết giữa protein và lipopolysaccharide và protein liên kết với β – glucan Vỏ protein có tác dụng lấy tác nhân lạ xâm nhập vào và sự ngăn cản mất máu từ những vết thương

β – glucan và vitamin C được duy trì hoặc bổ sung với thức ăn khi so sánh với đối chứng cho thấy tăng cường tốc độ sinh trưởng của tôm Cơ chế hấp thu qua hệ tiêu hóa của β – glucan đã được xác định Nếu β – glucan được hấp thu bởi tôm và tạo ra nguồn năng lượng, nó có thể được xem như tốc độ tăng trưởng

do nguồn năng lương có ích thu được từ β – glucan Trong điều kiện này, β – glucan có thể bị mất đi trong suốt quá trình tiêu hóa, sự ảnh hưởng hàm lượng

β – glucan có ích khi kích thích miễn dịch, nhưng nó không giống như một nguồn năng lượng [16] Điều này không quan trọng vì đối với tôm có thể phản ứng với môt lượng rất nhỏ β – glucan

Hàm lượng đường glucose trong máu của tôm với thức ăn bổ sung β – glucan và vitamin C đã giảm nhiều so với đối chứng, ngược lại hàm lượng

glycogen của tuyến tiêu hóa lại cao hơn đối chừng Do vậy, sự trao đổi chất của protein và tổng hợp glycogen có thể liên quan đến hiệu quả của β – glucan đối với hệ thống miễn dịch β – glucan bị phân hủy trong tuyến tiêu hóa bởi enzyme-glucanase để tạo năng lượng và tạo glucose từ glycogen qua con đường UDP-glucose Trong điều kiện này, phần lớn protein có thể hấp thụ qua tuyến tiêu hóa vào máu mà không được sử dụng như một nguồn năng lượng [16] Một số nghiên cứu khác, khi bổ sung 0.2% β-glucan vào thức ăn ương của

cá lóc bông giúp tăng tỉ lệ sống sót, tốc đọ tăng trưởng chiều dài, khối lượng và

hệ số miễn dịch của cá [17]

b Đối với chăn nuôi gia cầm, gia súc

Một nghiên cứu chỉ ra rằng khi bổ sung β-glucan với tỉ lệ 0.1% vào thức

ăn của gà sẽ hạn chế sự xâm nhập, phát triển của Salmonella trong gan và lá

lách [18], với tỉ lệ 0.05%, 0.1%, 0.15% trong khẩu phần ăn của gà đều có tác đông tốt đến khổi lượng tăng trọng, hệ số chuyển hóa thức ăn của gà [37] β-glucan có tác động tích cực đối với heo, ông đề xuất bổ sung β-glucan vào khẩu phần ăn của heo con sau khi cai sữa với hàm lượng 0.025% cải thiện

tốc độ tăng trưởng và khả năng chống lại Streptococcus suis Tuy nhiên, nghiên

cứu này chỉ ra, β-glucan sản xuất bằng các phương pháp khác nhau có thể có hiệu ứng khác nhau về hiệu suất tăng trưởng và chức năng miễn dịch ở heo

1.1.5 Một số nguồn thu nhận β-glucan

β-glucan thu được từ các nguồn khác nhau như vi khuẩn, nấm men, tảo, nấm ăn, yến mạch Cấu trúc β-glucan phụ thuộc vào một số nguồn được tách khác nhau, thông thường β-glucan phụ thuốc vào một số nguồn tách từ mỗi nguyên liệu có những cấu trúc đặc trưng và được liên kết bởi các phân từ glucose theo nhiều cách khác nhau Cấu trúc hóa học của β-glucan từ một số nguồn được miêu tả như sau:

Bảng 1.1 Nguồn nguyên liệu chứa β-glucan [8]

Cấu trúc β-glucan Nguồn chứa β-glucan

(1,3) - β-glucan Vi khuẩn Alcaligenes faecalis curdlan

Tảo Euglena gracilis – paramylon

Poria cocos – pachyman

Vitis vinifera – callose

Thông ( Larix laricina ) – laricinan

(1,3),(1,6)- β-glucan Tảo Laminaria sp – laminarin

Claviceps purpurea – glucan thành tế bào Sclerotinia sclerotiorum – glucan thành tế bào

Địa y Cetraria islandica lichenin

đã được chiết từ thành tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae và có đặc điểm

quan trọng thích hợp như một chất phụ gia thực phẩm Glucan tự nhiên, rất sạch

có dung tích giữ nước cao và không tạo gel, chúng gồm các đơn vị glucan liêu kêt với nhau qua các cầu nối β – 1,3 và β – 1,6 [25],[27]

1.2 GIỚI THIỆU VỀ BÃ THẢI MEN BIA

1.2.1 Quy trình sản xuất men bia

Hình 1.3 Sơ đồ sản xuất bia

Quy trình sản xuất bia gồm 7 công đoạn chính: (1) Quá trình đường hóa

là một quá trình trộn lẫn ngũ cốc đã nghiền (thường là ngũ cốc đã trải qua quá trình malt hóa) và đun nóng hỗn hợp này và chờ ở các vọng nhiệt độ nhất định

để các enzymes trong malt phá vỡ tinh bột trong đó ngũ cốc thành đường chủ yếu là maltose (2) Bước tiếp theo là quá trình lọc, đây là quá tình phân tách chất chiết được thu được trong quá trình đường hóa và loại bỏ bã bia ra ngoài (3) Đun sôi là quá tình đun các chất được chiết gọi là dịch nha, nhằm giúp dịch nha trở nên vô trùng tránh sự nhiễm khuẩn Ở công đoạn này có bổ sung thêm hoa bia (hoa houblon) để tạo độ đắng và hương bị của bia, giúp các protein trong nha kết tụ và pH của dịch nha giảm xuống Cuối của quá trình này giúp bay hơi các chất không mong muốn ví dụ như tiền chất dimethyl sulfide Lắng xoáy là quá trình sôi hoa, nha được bơm vào các nồi lắng xoáy theo phương tiếp tuyến nhằm kết tủa các protein và lượng sinh khối từ hoa vào phần giữa nồi lắng xoáy Phần cặn này sẽ được loại bỏ Làm lạnh nha là sau quá trình lọc hoa, dịch nha được hạ lạnh xuống nhiệt độ lên men trước khi tiếp giống men bia.(4) Giai đoạn lên men được thực hiện trong các tank lên men và được bắt đầu ngay khi nấm men được định lượng vào dịch nha lạnh Trong suốt quá trình này nấm men chuyển hóa các loại đường trong dịch nha thành cồn và CO2 Cuối mỗi quá trình lên men, nấm men và các chất rắn khác lắng xuống đáy và được rút khỏi các tank (5) Ủ bia chín bia, khi các loại đường được sử dụng gần

hết trong quá trình lên men bia, quá trình lên men chậm dần và nấm men bắt đầu lắng xuống đáy tank Trong giai đoạn này, bia được làm lạnh xuống nhiệt

độ quanh điểm đóng bang, nhằm kích thích quá trình kết lắng của nấm men và các protein, các hương không mong muốn như phenilic trở nên không tan trong bia lạnh và hương vị bia trở nên hài hào hơn.(6) Lọc bia là quá trình loại bỏ nấm men, cặn, giúp ổn định hương và vị bia mang đến cho bia sự trong sáng Lên men thứ cấp là lên men sau quá trình lên men chính.(7) Sau đó là đóng chai

và thành phẩm [40],[41]

Bã nấm men bia dạng sệt thu được từ nhà máy bia, nằm lại trong các thùng lên men và các hầm chứa sau khi lên men chính và lên men phụ Khi thu về có màu hơi vàng, lỏng lẻo, độ ẩm từ 85-90% Trong đó tế bào nấm men chiếm khoảng 56-60% Thành phần của nấm men trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Thành phần cơ bản của nấm men [26]

1.2.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae [7],[26]

a Đặc điểm của tế bào nấm men

Tế bào Saccharomyces cerevisiae có dạng cầu hay hình trứng, có kích

thước trung bình 3-5x5-10nm , sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng glucose, galactose, sacchraose, maltose như nguồn cacbon, chúng sử dụng acid amin và muối amon như nguồn nitơ

Phân loại khoa học [40]

Giới (regnum) : Fungi

Chi (genus) : Saccharomyces Hình 1.4.Tế bào S cerevisiae

Loài (species) : S cerevisiae

Đặc điểm chung

- Là nấm đơn bào: hình cầu, hình trứng hoặc hình elip

- Sinh sản điển hình bằng nảy chồi Trong canh trường lỏng thường thấy

tế bào nảy chồi, có thể tạo hậu bào tử ascus

- Hô hấp tùy tiện, rất phổ biến trong thiên nhiên

- Được ứng dụng rất sớm trong đời sống, có ý nghĩa to lớn trong công nghệ sinh học

b Cấu tạo tế bào

Thành tế bào nấm men (Cell Wall)

Bao quanh thành tế báo nấm men là một lớp mỏng dày đặc, mềm mại và

có thế đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác nhân bên ngoài và chất độc

Thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae khá dày khoảng (100 –

200nm) chiếm khoảng 10-25% trọng lượng chất khô của tế bào nấm men Nó bao gồm một lớp polysaccharides bên trong đóng vai trò như một khung để đỡ lớp ngoài cùng manoprotein Chứa từ 80-90% polysaccharides (β-glucan và manna sugar polymer), còn lại là protein, lipid và một lượng chất nhỏ chitin (N – Axetyl Glucosamin) Hầu hết protein trong vách tế bào liên kết với Manna- Oligo-Saccharide (MOS) và tạo thành phức Manoprotein

Thành tế bào nấm men là nguồn chủ yếu chứa β – glucan, β- glucan trong thành tế bào nấm men chủ yếu là các liên kết mạch thẳng (1,3) beta-glucosyl

và liên kết 1,6 Những phân tử này được xen lẫn một cách phức tạp với những polysaccharides khác và các protein

Màng tế bào (Plastma membrane)

- Lớp màng photpholipid có chiều dày khoảng 7nm, màng kép bao bọc toàn bộ các thành phần bên trong tế bào, có phân bố đan xen các phần tử protein

- Giữ vai trò quan trọng, điều tiết quá trình trao đổi chất giữa tế bào và môi trường bên ngoài

- Lơ lứng trong tế bào chất có hệ thống nhiều lớp màng kép nối thông với nhau các ống trụ rỗng và liên kết với nhiều vị trí màng tế bào chất, phân chia tế bào chất thành nhiều vùng

Nhân tế bào (Nucleus)

Nấm men là sinh vật nhân thực, đường kính có nhân có chiều dài khoảng 1.5 um, hình cầu hay ống dài, gồm màng nhân bao bọc nhiễm sắc thế

- Màng nhân 2 lớp nhiễu lỗ xuyên qua Nhiễm sắc thể có cấu trúc điển hình ( thể bắt chéo với cách lớn và cánh nhỏ)

- Mỗi tế bào nấm men thường có một nhân

- Là cơ quan dự trưc thông tin di truyền tế bào

- Một số loài nấm men trong tế bào có plasmid

Một số các bào quan khác

- Ty thể (Mitochodrion): Cấu trúc dạng túi màng kép gấp nhiều nếp, dạng

lỗ lưới (có thể dạng ống) Hình dạng và cấu trúc thay đổi phụ thuộc và loài theo trạng thái sinh trưởng của tế bào, phân bố trên mạng lưới nội tế bào chất (hay nối qua ống nhỏ dạng ống trụ rỗng) Thành phần chủ yếu là protein (80%) và lipid, ngoài ra còn có DNA), là cơ quan tổng hợp năng lượng cho tế bào

- Túi golgi: Dạng túi rỗng gấp nhiều nếp, tham gia vào quá trình đào thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào

Một số thể dự trữ

- Glucogen: nguồn dự trữ năng lượng tích lũy glucid

- Votulin: nguồn dự trữ năng lượng tích lũy photphat

- Giọt chất béo: nguồn dự trữ năng lượng tích lũy lipid

- Không bào: hình cầu hay hình trứng, chỉ xuất hiện trong tế bào trưởng thành hay tế bào già, mỗi tế bào có thể có nhiều không bào Trong không bào, chủ yếu là nước, một vài enzyme thủy phân và một số sản phẩm trao đổi chất

a Cấu trúc β-glucan trong nấm men[15],[16],[18],[26]

β –glucan là một trong những polysaccharide phong phú nhất trong thành

tế bào nấm men và tồn tại như chất trùng hợp của đường glucose liên kết qua

β-1,3-D-glucosidic hoặc β-1,6-D-glucosidic Trong nấm men Saccharomyces

cerevisiae, thành tế bào chủ yếu chứa β-1,3-glucan, β-1,6-glucan, chitin và

manoprotein, chúng liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị Mannoprotein liên kết với β-1,6-D-glucan qua gốc glycosyl-phosphatidyl-inositol chứa 5 gốc

manosyl liên kết α Đầu khử của 1,6-D-glucan liên kết với đầu khử của

β-1,3-glucan Chitin gắn thẳng vào nhánh β-1,6-D-glucan Mối liên kết này có vai trò trung tâm trong cấu trúc thành tế bào nấm men Phần lớn β-1,3-glucan

có cấu trúc xoắn, những sợi xoắn này gồm chuỗi polysaccharide đơn hoặc ba chuỗi liên kết với nhau bằng liên kết hydro Dưới kính hiển vi điện tử, các sợi

có đường kính từ 10-30nm, luôn gắn với các chuỗi bên, mỗi chuỗi có đường

kính 0.5-1nm Cho đến nay, vẫn chưa có số liệu trực tiếp về chiều dài của chuỗi bên Các chuỗi bên dài tạo ra các “polysaccharide” với các đầu khử cuối Đặc điểm của β-glucan nấm không tan trong kiềm [22]

Hình 1.5 Cấu trúc thành ngoài của nấm men [26]

Bảng 1.3 Thành phần và trọng lượng các chất của thành tế bào nấm men

Đã có rất nhiều nghiên cứu về tách chiết β-glucan tại Việt Nam Một trong những nghiên cứu khởi đầu của việc tách chiết này là đề tài cấp nhà nước năm

2005 về “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất β-glucan từ thành tế bào nấm men dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm” [3] Đề tài cũng đã nghiên cứu tác dụng phục hồi đáp ứng miễn dịch của chế phẩm β-glucan trên thực nghiệm Đối tượng nghiên cứu là chú chuột nhắt trắng đực 4 tuần tuổi (trọng lượng 22-25g) Chế phẩm β-glucan có tác dụng phục hồi tế bào bạch cầu máu ngoại vi và khả năng thực bào của đại thực bào ổ bụng của động vật gây giảm suy giảm miễn dịch thực nghiệm bằng chiếu xạ và có tác dụng tốt đối với hệ thống miễn dịch không đặc hiệu ở nồng độ nghiên cứu Tuy nhiên,

đề tài này chưa nghiên cứu một cách kỹ lưỡng đối với loại nấm men thải trong ngành công nghiệp và tận dụng thu β-glucan và song song nó với các mục đích giảm thiểu ô nhiễm môi trường [9]

Đến năm 2014, đề tài nghiên cứu quy trình tách chiết β-glucan từ tế bào

saccharomyces cerevisiae trong bã men bia Nghiên cứu này đã khảo sát các

phương pháp tách chiết và các điều kiện tách chiết β-glucan Nghiên cứu này

đã chỉ ra rằng: phương pháp tốt nhất để tách chiết β-glucan là phương pháp sinh học, nhiệt độ rửa bã nấm men bia là 900C/10 phút, nồng độ enzyme protease tham gia phản ứng là 0.5%, thời gian xử lý là 6h, nồng độ NaOH là 1M, nhiệt

độ và thời gian xử lý NaOH: 90 độ trong 1,5h; tỉ lệ aceton/cặn nấm men là 4:1

Từ 1000g bã men bia tươi thu nhận được 23.12g sản phẩm giàu β-glucan với hàm lượng β-glucan lên đến 85% [4]

Ngoài ra, một số nghiên cứu về tách chiết β- glucan trên một số nguyên liệu khác như: nấm thái dương Agaricus blazei và thử nghiệm khả năng tăng cường hệ miễn dịch trên động vật [13]

1.3.2 Các nghiên cứu nước ngoài

β-glucan là một hợp chất có khả năng tương tác với hệ miễn dịch và điều chỉnh một số khía cạnh nhất định của hệ thống miễn dịch của vật chủ Việc sử

dụng β-glucan cho phép vật chủ tự bảo vệ mình chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật một cách hiệu quả mà không liên quan đến việc sử dụng thuốc kháng sinh đặc hiệu để kháng vi sinh vật, gần đây đang trở thành mối quan tâm lớn

do ngày càng xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật kháng thuốc [14], [20]

Báo cáo đầu tiên về hoạt tính kháng U của polysaccharides mà hỗn hợp này được tách từ năm 1943 Nhưng polysaccharide tách từ vi khuẩn có những tác dụng không mong muốn Những nghiên cứu tiếp theo về polysaccharide với nguồn gốc khác vi khuẩn chỉ ra rằng glucan hoạt động bằng cách kính thích hệ miễn dịch và không độc với tế bào [16],[21]

Trong những năm qua, có nhiều nhà khoa học và viện nghiên cứu trên thế giới đã góp phần to lớn vào việc định loại, tách chiết, làm sạch và định tính các thành phần khác nhau của 1,3- β -glucan Những nghiên cứu này chỉ ra rằng hợp chất kích thích các thế bào khác nhau trong hệ miễn dịch và điều hòa miễn dịch rất lớn, bao gồm kháng khối u, kháng nhiễm và làm lành vết thương 1,3-

β -glucan trong nhiều năm qua được các bác sỹ trong nhiều lĩnh vực chú ý để giải quyết nhiều vấn đề như bệnh nhân dị ứng với thuốc, nhiễm nấm và ung thư Khi bổ sung β - glucan có thể tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể bệnh nhân [19]

Có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học của β-glucan nhưng có kết quả trái ngược nhau Điều này chủ yếu là do sử dụng β-glucan với trọng lượng phân từ khác nhau và sự thay đổi hóa học do β - glucan được nhận từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm các loại nấm nói chung và nấm men Hiệu quả điều hòa miễn dịch của β-glucan phụ thuộc vào mức độ phân nhánh của phân tử, độ dài polymer và cấu trúc bậc ba của nó

Các phương pháp nghiên cứu tách chiết β-glucan được nghiên cứu khá nhiều, phương pháp cổ điển nhất sử dụng lượng lớn acid và bazơ rồi rửa nhiều lần trong ethanol [26], [36], phương pháp này tốn lượng lớn hóa chất và gây ô nhiễm môi trường, đồng thời bậc cấu trúc β-glucan giảm Phương pháp sử dụng

enzyme protease được áp dụng nhưng sau quá trình tự phân người ta mới cho enzyme protease để loại bỏ protein dư thừa [23], ưu điểm của phương pháp này

là giữ được cấu trúc của β-glucan Trong nghiên cứu của Artūras Javmen và cộng sự, ông đã sử dụng men Actinomyces rutgersensis 88 phức hợp men làm giảm men cho tế bào nấm men tách chiết β-glucan kiềm, phương pháp này mang lại hiệu quả cao [33], tuy nhiên mua men để tách chiết tốn kém thường được áp dụng trong ngành dược và mỹ phẩm

Các nghiên cứu về β –glucan từ nấm men mang lại hiệu quả cao từ hoạt lực cao và dễ dàng tách chiết và tinh sạch Ứng dụng chủ đạo vào ngành y và dược phẩm

Năm 2013, Trần Minh Tâm và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tách chiết β-glucan bã thải men bằng phương pháp enzyme, sử dụng sóng siêu âm và kết hơp cả hai phương pháp này cho kết quả cao nhất, β-glucan được tách chiết có hàm lượng cao và không bị mất bậc cấu trúc [29]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Bã thải nấm men bia

- Bã men bia Saccharomyces cerevisiae được sử dụng trong nghiên cứu này

là bã nấm men thải từ Công ty TNHH nhà máy bia Heineken Việt Nam – Đà Nẵng chứa hàm lượng nước khoảng 85-90%

- Bã men bia được sử dụng có hàm lượng nước trung bình là 85-90 % có lẫn nhiều tạp chất Nhiệt độ trung bình của nấm men sau khi rút khỏi thiết bị lên men khoảng 40C, pH trung bình khoảng 4,0-5,0

Hình 2.1 Bã nấm men được lấy từ nhà máy

2.2.2 Cá rô phi đầu vuông (Anabas Testudinus)

- Cá rô phi đầu vuông mua tại trại giống thủy sản nước ngọt tại Hòa Khương

- Cá có độ tuổi 30 ngày, chọn cá đồng đều về kích thước trung bình 5 cm, trọng lượng (5.2 ±0.02g/con), sạch bệnh, khỏe mạnh

- Vào thời gian giao mùa cá rô phi dễ bị bệnh do nhiễm vi sinh vật gây bệnh xuất huyết (do vi khuẩn), bệnh nấm nhớt (do nấm), bệnh do kí sinh trùng Thực trạng tại trại cá Hòa Khương mỗi ngày cá bị chết do bệnh khoảng 10% Việc phòng tránh chủ động trên loài cá này mang lại hiệu quả kinh tế cao cho quá trình ương giống

Hình 2.2 Cá rô phi đầu vuông

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Khảo sát phương pháp ảnh hưởng đến quy trình tách chiết β-glucan

- Khảo sát nhiệt độ rửa bã nấm men đến quy trình tách chiết β-glucan

- Khảo sát nồng độ enzyme tới quy trình tách chiết β-glucan

- Khảo sát thời gian ủ enzyme tới quy trình tách chiết β-glucan

- Quy trình tách chiết β-glucan áp dụng tại phòng thí nghiệm

- Ứng dụng chế phầm giàu β-glucan bổ sung vào khẩu phần ăn của cá rô phi đầu vuông

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

Ly tâm 4000vòng/10phút Xử lý mẫu

Thu mẫu

Sấy t0= 500C, t=5h

Phương pháp xác định

hàm lượng β – glucan

Tính hiệu suất thu hồi

Khảo sát tỉ lệ sống cá rô phi

Khảo sát tỉ trọng cá rô phi

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.3.2 Phương pháp xác định độ ẩm [8]

Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hơi nước trong sản phẩm mong muốn

cân trọng nước trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phầm trăm nước có trong thực phẩm

Tính kết quả:

Trong đó: %X-độ ẩm nguyên liệu (phần trăm khối lượng)

Tách chiết glucan

β-Tạo chế phẩm

Thử nghiệm chế phẩm

mo: khối lượng cốc

m1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy

m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy Ghi chú: m= mo+1-2g

2.3.3 Phương pháp thu nhận β-glucan bằng phương pháp sinh học

Bã nấm men bia → Rửa bã với nước vô khuẩn → bổ sung enzyme→ Xử

lý NaOH 1M → Ly tâm thu cặn → Xử lý acetone → Rửa ethanol → Thu glucan [4], [8], [26]

β-Việc sử dụng enzyme phá hủy thành tế bào và màng tế bào giải phóng các chất hòa tan ra khỏi dung môi hòa tan tạo điều kiện thu nhận β-glucan

2.3.4 Phương pháp khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình tách chiết β-glucan bằng phương pháp sinh học

a Phương pháp xác định nhiệt độ rửa bã nấm men

Rửa bã nấm men là khâu quan trọng trong quá trình tách chiết, giúp phá

vỡ thành tế bào một phần giúp cho quá sử dụng enzyme tốt hơn Thay đổi nhiệt

độ ở các điều kiện khác nhau: 30oC; 60oC; 90oCđể lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình xử lý các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần Đánh giá bằng phương pháp định lượng β-glucan trong mẫu và tính hiệu suất thu hồi để so sánh kết quả

b Phương pháp xác định nồng độ enzyme

Các mamnoprotein trong thành tế bào nấm men không chỉ giới hạn tính thấm của màng tế bào mà còn góp phần để độ bền cơ học của thành tế bào chống lại tác nhân bên ngoài Để loại bỏ hoàn toàn bức tường bọc bảo vệ thành

tế bào của nấm men và loại bỏ mannoprotein, một phần protein có trong thành

tế bào nhằm thu được sản phầm có hàm lượng β-glucan cao Tiến hành cân 2g nguyên liệu bã men bia khô cho mỗi ống thí nghiệm, tiến hành các bước giữ ở một điều kiện nhất định chỉ thay đổi nống độ enzyme bổ sung vào quá trình ở

5 mức độ: 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.9% Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Đánh giá

bằng phương pháp định lượng β-glucan trong mẫu thí nghiệm và tính hiệu suất thu hồi để so sánh kết quả

c Phương pháp xác định thời gian xử lý bằng enzyme

Thời gian xử lý bằng enzyme protease cũng ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết β –glucan Thí nghiệm bố trí ở ba mức độ thời gian là 6 giờ, 12 giờ

và 24 giờ Các thí nghiệm lặp lại 3 lần Đánh giá bằng phương pháp định lượng

đường tổng và tính hiệu suất thu hồi để so sánh kết quả

2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng β-glucan

a Phương pháp xác định hàm lượng β-glucan [7]

Nguyên tắc: Sự đinh phân này căn bản dựa vào phản ứng đặc trưng cho bởi

đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của acid sulfuric

Cách tiến hành:

- Trích đường: cần chính xác 1-2 g mẫu vật tươi đã nghiền nhỏ (nếu ở dạng khô thì cân ít hơn) cho vào cốc thủy tinh 50ml và thêm 10ml cồn 900 vào Sau

đó, để cốc đun trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần Khuấy đều bằng que thủy tinh,

sau khi để nguội, lọc qua giấy loc không tro (khi lọc chỉ nên gạn lấy phần rượu)

- Sau đó lại cho 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã, khuấy đều đun 2 lần tới sôi trên nồi cách thủy Để nguội lại lọc tiếp tục Chiết rút như vậy khoảng 2 lần Xong đưa bã lên giấy lọc và rửa sạch 2-3 lần bằng rượu nóng 800 ( rửa từng ít

một)

- Rượu qua lọc được cho bay hơn ở trong phòng hay trên nồi cách thủy đun nhẹ Sau khi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút ấm Cặn khô trong cốc đựng pha thành 50ml với nước cất Nếu có cặn thì để cho lắng qua đêm Dung dịch này có thể tiếp tục pha loãng tùy thuộc vào nồng độ đường

có trong mẫu

- Thực hiện phản ứng màu

+ Hút 1ml dung dịch đường từ mỗi bình định mức cho vào 2 ống nghiệm riêng biệt có ký hiệu rõ ràng, rồi thêm 1ml dung dịch phenol 5% Sau đó, chính