Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng hạ acid uric, chống viêm của cao chiết loài dó đất ( balanophora fungosa subsp indica (arn ) b hansen)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG PHƯƠNG LAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC, CHỐNG VIÊM CỦA CAO CHIẾT LỒI DĨ ĐẤT (Balanophora fungosa subsp indica (Arn.) B.Hansen) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG PHƯƠNG LAN MÃ SINH VIÊN: 1501253 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC, CHỐNG VIÊM CỦA CAO CHIẾT LỒI DĨ ĐẤT (Balanophora fungosa subsp indica (Arn.) B.Hansen) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS.NCS Nguyễn Thanh Tùng ThS Ngô Thanh Hoa Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, với tình cảm chân thành nhất, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Dược liệu Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho em có mơi trường học tập tốt suốt thời gian học tập, nghiên cứu trường Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn NCS Nguyễn Thanh Tùng ThS Ngô Thanh Hoa hướng dẫn, bảo động viên giúp em vượt qua khó khăn thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy Đinh Đại Độ, chị Đinh Thị Kiều Giang anh chị kỹ thuật viên, bạn sinh viên nghiên cứu Bộ môn Dược liệu Bộ môn Dược lực giúp đỡ em q trình hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người thầy, cô dạy dỗ em suốt năm năm học tập trường Đại học Dược Hà Nội Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ đưa nhiều góp ý q trình thực đề tài Hà Nội, ngày 19 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Dương Phương Lan MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu Dó đất 1.2.1 Tên khoa học vị trí phân loại 1.2.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.4 Tác dụng sinh học công dụng 1.2 Tổng quan bệnh gút 11 1.2.1 Khái niệm bệnh gút 11 1.2.2 Nguyên nhân sinh gút 11 1.2.3 Thuốc sử dụng điều trị gút 12 1.2.4 Dược liệu có tác dụng điều trị gút 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 17 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Định tính thành phần hóa học, xác định hàm lượng polyphenol toàn phần 20 2.2.2 Đánh giá số tác dụng sinh học cao chiết Dó đất 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Định tính thành phần hóa học, xác định hàm lượng polyphenol toàn phần 20 2.3.2 Đánh giá số tác dụng sinh học cao chiết Dó đất 23 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 29 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 30 3.1 Kết nghiên cứu thành phần hóa học 30 3.1.1 Kết định tính thành phần hóa học 30 3.1.2 Kết định lượng polyphenol toàn phần cao chiết 30 3.2 Kết đánh giá số tác dụng sinh học cao chiết Dó đất 35 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết mơ hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm kali oxonat 35 3.2.2 Kết đánh giá tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan 36 3.2.3 Kết đánh giá tác dụng chống viêm mơ hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối 37 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 39 4.1 Về nghiên cứu thành phần hóa học cao chiết 39 4.2 Về đánh giá số tác dụng sinh học 40 4.2.1 Về tác dụng hạ acid uric mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat 40 4.2.2 Về tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan 41 4.2.3 Về tác dụng chống viêm mơ hình gây viêm màng hoạt dịch tinh thể natri urat 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT HHPD Hexahydroxydiphenyl NO Nitric oxid TNF-α Tumor necrosis factor α – Yếu tố hoại tử khối u IC50 Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%) DPPH α, α-diphenyl-β-picryhydrazyl NOS Nitric oxid synthase SC50 Nồng độ (µg/ml) chất chống oxy hóa trung hòa 50% gốc tự RAW 264.7 Dòng tế bào đại thực bào chuột COX Cyclo-oxygenase ADN Acid deoxyribonucleic H2 O2 Hydrogen peroxid HIV Human immunodeficiency virus HepG-2 Liver hepatocellular carcinoma LU-1 Lung carcinoma MCF -7 Breast carcinoma HL-60 Promyelocytic leukemia PRPP HGPRT Phosphoribosyl pyrophosphatase URAT-1 Urate Transporter NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drug Hypoxanthine-guanin phosphoribosyltransferase HPLC - DAD High-performance liquid chromatography–diode array detector Na-CMC Natri carboxymethyl cellulose NP/PEG 2-Aminoethyl diphenyl borinat Poly ethylen glycol HPTLC High-performance thin layer chromatography DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Chương trình dung môi cho chế độ rửa giải gradient 22 Bảng 2.2 Thang điểm đánh giá mức độ viêm khớp chân chuột dựa triệu chứng 29 Bảng 3.1 Kết định tính số nhóm chất có cao chiết Dó đất 30 Bảng 3.2 Tóm tắt kết thẩm định phương pháp 34 Bảng 3.3 Kết định lượng polyphenol toàn phần cao dược liệu 34 Bảng 3.4 Ảnh hưởng cao chiết Dó đất đến nồng độ acid uric chuột thực nghiệm 35 Bảng 3.5 Ảnh hưởng cao chiết Dó đất lên mức độ phù bàn chân chuột 36 Bảng 3.6 Ảnh hưởng cao chiết Dó đất lên mức độ viêm khớp dựa triệu chứng 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Trang Hình 2.1 Mẫu nghiên cứu toàn mang hoa Balanophora fungosa subsp indica (Arn.) B.Hansen 17 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu 20 Hình 2.3 Quy trình tiến hành thí nghiệm mô gây tăng acid uric cấp 24 Hình 2.4 Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan 26 Hình 2.5 Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm mơ hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối 28 Hình 3.1 Sắc ký đồ HPTLC cao chiết lồi Dó đất– Hệ 31 Hình 3.2 Sắc ký đồ HPTLC cao chiết lồi Dó đất– Hệ 32 Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC cao chiết Dó đất bước sóng 280 nm phổ UV-VIS hợp chất đối chiếu 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong trình nghiên cứu phát triển sản phẩm thuốc từ dược liệu, vốn tri thức địa kinh nghiệm sử dụng thuốc đồng bào dân tộc giữ vai trò quan trọng, giúp làm giảm chi phí sàng lọc ban đầu tác dụng dược lý phần chứng minh kinh nghiệm sử dụng thuốc cộng đồng địa phương qua nhiều hệ Qua tìm hiểu kinh nghiệm sử dụng thuốc số đồng bào dân tộc miền núi cho thấy lồi thuộc họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) sử dụng thuốc chữa bệnh liên quan đến kháng viêm, kháng ung thư, chống oxy hóa, bổ máu, tăng cường sức khỏe, tăng cường sinh lực, phục hồi sức khỏe cho phụ nữ sau sinh, kích thích tiêu hóa Lồi Dó đất có tên khoa học Balanophora fungosa subsp indica (Arn.) B.Hansen, tên đồng nghĩa Balanophora indica (Arn.) Griff từ lâu đồng bào dân tộc sử dụng sắc nước uống để trị đau bụng đau toàn thân, làm thuốc ngâm rượu bổ tinh, cường tráng, mạnh gân cốt vị Tỏa dương [3] Đây lồi có trữ lượng lớn họ Dó đất Việt Nam với khu vực phân bố rộng, từ tỉnh miền núi phía Bắc đến Khánh Hịa, Ninh Thuận [2] Tổng quan nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học Dó đất bao gồm: tanin thủy phân, acid phenolic, phenylpropanoid, sterol… Những năm gần đây, loài thuộc họ Dó đất nói chung lồi B fungosa subsp indica nói riêng bị khai thác với số lượng lớn dẫn đến nguy cạn kiệt nguồn dược liệu Trong đó, nghiên cứu khoa học thành phần hóa học tác dụng sinh học lồi hạn chế với đa số nghiên cứu tập trung lồi Dó đất hoa thưa (Balanophora laxiflora Hemsl.) Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng hạ acid uric, chống viêm cao chiết loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp indica (Arn.) B.Hansen)” nhằm cung cấp thơng tin thành phần hóa học đánh giá số tác dụng sinh học cao chiết ethanol loài B fungosa subsp indica, làm sở đề xuất giải pháp cho việc khai thác sử dụng loài Đề tài gồm hai mục tiêu sau: (9) Acid gallic (10) Acid cinnamic (11) Acid coumaric (12) Methyl cinnamat (13) (14) p-hydroxycinnamoyl-β-Dglucopyranose Cinnamoyl-β-Dglucopyranose 4-hydroxy-3- (15) (16) R R1 methoxycinnamoyl-β-D- 13 OH H glucopyranose 14 H H Caffeoyl-β-D- 15 OH OCH3 glucopyranose 16 OH OH (18) Acid caffeic (17) Coniferin (19) Methylconiferin (20) (21) Butylconiferin Pinoresinol 7,9’:7’,9-Diepoxy-3(22) methoxy-3-methoxy-4,4’lignandiol (23) Balanophonin (24) β-amyrin palmitate R 17 H 19 CH3 20 (CH2)3CH3 (25) Lupeol (26) Lupeol acetat R (27) (28) Lupeol palmitat β–sitosterol Balanoindicosid A (29) (9β,10α,11trihydroxymuurol-4-en 11O-β-D-glucopyranosid) Balanoindicosid B ((12R)(30) 10β,11,13trihydroxymuurol-4-en 13O-β-D-glucopyranosid) 25 H 26 COCH3 27 COC15H31 Balanoindicosid C ((12S)11,13,15(31) trihydroxymuurola1(10),4-dien glucopyranosid) (32) Balanolid A (33) Balanolid B 13-O-β-D- Phụ lục Định tính nhóm chất phản ứng hóa học  Định tính coumarin, flavonoid Cân khoảng 1,5 g cao EB vào cốc có mỏ, thêm 30 ml ethanol 90%, đun cách thủy đến sôi 2-3 phút Lọc nóng dịch chiết vào ống nghiệm Cơ cách thủy ống nghiệm đến ống ml dịch chiết tiến hành phản ứng  Định tính coumarin: phản ứng đóng mở vịng lacton Tiến hành phản ứng với ống nghiệm sau: - Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% vào ống 1, ống giữ nguyên Đun ống đến sôi, để nguội quan sát - Thêm vào ống khoảng ml nước, lắc quan sát - Acid hóa ống vài giọt acid clohydric đặc, quan sát Phản ứng dương tính ống tủa đục ống  Định tính flavonoid: phản ứng cyanidin, với dung dịch NaOH 10%, với dung dich FeCl3 5%, phản ứng diazo hóa Cách tiến hành cụ thể sau: - Ống thứ nhất: Thêm bội magnesi kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ giọt HCl đậm đặc - Ống thứ hai: Thêm vài giọt NaOH 10% - Ống thứ ba: Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% - Ống thứ tư: Kiềm hóa dung dịch kiềm (dung dịch NaOH 10%) thêm vài giọt thuốc thử diazo pha, lắc  Định tính saponin: phản ứng tạo bọt Cân khoảng 0,5 g cao EB vào cố có mỏ, thêm ml nước Đun sôi để nguội, lọc dịch chiết vào1 ống nghiệm lớn, thêm ml nước lắc mạnh phút Để yên quan sát tượng tạo bọt  Định tính tanin: phản ứng dung dịch gelatin 1%, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch chì acetat 10% Cách tiến hành cụ thể sau: Cân khoảng 0,5 g cao dược liệu, thêm 10 ml nước cất, đun sôi phút Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp thu lấy dịch lọc Chia dịch lọc vào ống nghiệm, ống ml - Ống thứ nhất: Thêm giọt gelatin 1% - Ống thứ hai: Thêm giọt dung dịch FeCl3 5% - Ống thứ ba: Thêm giọt chì acetat 10%  Định tính alcaloid: phản ứng với thuốc thử Bouchardat, thuốc thử Mayer thuốc thử Dragendorff Cách tiến hành cụ thể sau: Cân khoảng 0,5 g cao EB vào cốc có mỏ Hịa tan vào khoảng 10 ml nước cất, chuyển dịch hòa tan vào bình gạn Kiềm hóa amoniac đặc đến pH 8-9 Thêm 10 ml CH2Cl2 lắc nhẹ khoảng phút để yên cho tách lớp Gạn lấy lớp dưới, loại nước Na2SO4 khan, chia vào ống nghiệm nhỏ Đun cách thủy để bay hết dung mội Thêm vào ống nghiệm ml H2SO4 1% - Ống nghiệm thứ nhất: Thêm giọt thuốc thử Bouchardat - Ống nghiệm thứ hai: Thêm giọt thuốc thử Mayer - Ống nghiệm thứ ba: Thêm giọt thuốc thử Dragendorff  Định tính acid hữu Cân khoảng 0,5 g cao EB, thêm 10 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội lọc qua giấy lọc gấp nếp thu lấy dịch lọc Cho vào ống nghiệm khoảng ml dịch lọc, thêm Na2CO3 tinh thể Phản ứng dương tính xuất bọt khí  Định tính sterol Cân khoảng 0,5 g cao EB, thêm ml ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm Lọc qua giấy lọc gấp nếp thu lấy dịch lọc vào ống nghiệm, cô cách thủy đến cắn Thêm vào ống nghiệm khoảng ml anhydrid acetic lắc kỹ cho tan hết cắn Để nghiêng ống nghiệm 45o, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống Phản ứng dương tính mặt phân cách lớp chất lỏng có màu Phụ lục Quy trình thẩm định phương pháp định lượng Khảo sát cực đại hấp thụ quang Do polyphenol có nối đơi, nối đôi liên hợp nên hấp thụ tử ngoại vùng sóng ngắn 195-210 nm Vì để định lượng polyphenol phương pháp đo quang, chúng tơi tiến hành phản ứng oxy hóa polyphenol thuốc thử Folin-Ciocalteau dung dịch Na2CO3 cho sản phẩm màu xanh lam Cách tiến hành: Lấy xác ml dung dịch chuẩn gốc nồng độ 60 µg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm 2,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% để phản ứng phút Sau thêm vào ml dung dịch Na2CO3 2%, định mức nước cất hai lần Sau 60 phút phản ứng nhiệt độ phòng tiến hành quét phổ máy đo quang phổ từ bước sóng 200 đến 800 nm Cuvet thạch anh l = cm Dung dịch so sánh mẫu trắng làm song song với mẫu chuẩn, không chứa chất nghiên cứu Thẩm định đánh giá phương pháp Phương pháp định lượng polyphenol toàn phần cao đặc Dó đất thẩm định theo hướng dẫn Hội nghị quốc tế hài hòa thủ tục đăng ký dược phẩm – International Conference of Harmonization (ICH) văn hướng dẫn Q2B – Thẩm định quy trình phân tích (Validation of Analytical Procedure: Methoddology)  Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống đánh giá khả hoạt động quy trình phân tích bao gồm thiết bị, dụng cụ, mẫu thử phương pháp thử Cách tiến hành: Lấy xác ml dung dịch mẫu thử vào bình định mức 10 ml, thêm 2,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% để phản ứng phút Sau thêm vào ml dung dịch Na2CO3 2%, định mức nước cất hai lần Sau 60 phút phản ứng nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng 754,5 nm Mẫu trắng làm song song với mẫu thử Tiến hành đo mẫu thử lặp lại lần  Xác định khoảng nồng độ tuyến tính Độ tuyến tính phương pháp phân tích phụ thuộc tuyến tính đại lượng đo (y) nồng độ chất cần phân tích (x) khoảng xác định, biểu thị phương trình y = ax + b hệ số tương quan r2 - Cách xác định: + Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 20 μg/ml, 40 μg/ml, 60 μg/ml, 80 μg/ml, 100 μg/ml + Lần lượt cho ml dung dịch acid gallic chuẩn vào bình định mức 10 ml, thêm 2,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% để phản ứng phút Sau thêm vào ml dung dịch Na2CO3 2%, định mức nước cất hai lần Sau 60 phút phản ứng nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng 754,5 nm Mỗi mẫu lặp lại lần, lấy giá trị trung bình + Mẫu trắng chuẩn bị song song, không chứa chất chuẩn  Độ lặp lại phương pháp Độ lặp lại phương pháp khả cho kết tương đồng thực phép thử đối tượng điều kiện phân tích Độ lặp lại đánh giá phân bố giá trị đo phép thử quanh giá trị trung bình, biểu thị giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD Tiến hành định lượng lặp lại lần mẫu thử theo quy trình: - Cân xác khoảng 0,1 g cao, hịa tan methanol bình định mức 50 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch Hút ml dịch thêm vào bình định mức 10 ml, thêm methanol đến vạch - Lấy xác ml dung dịch vào bình định mức 10 ml , thêm 2,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% để phản ứng phút Sau thêm vào ml dung dịch Na2CO3 2%, định mức nước cất hai lần Sau 60 phút phản ứng nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng 754,5 nm - Mẫu trắng chuẩn bị song song, không chứa dung dịch thử Xác định độ lệch chuẩn giá trị Độ (độ thu hồi) Độ phương pháp thể mức độ phù hợp kết trung bình phép phân tích với giá trị thực mẫu phân tích Độ đánh giá dựa tỷ lệ thu hồi R% lượng chất chuẩn biết thêm vào mẫu phân tích Giá trị R% tính theo cơng thức: R% = Mm+c − Mm Mc x 100 Trong đó: Mm+c: lượng acid gallic dung dịch thử thêm chuẩn (µg); Mm: lượng acid gallic dung dịch thử (µg); Mc: lượng acid gallic dung dịch chuẩn thêm vào (lý thuyết) (µg) Tiến hành đánh giá độ phương pháp thêm chuẩn Tạo mẫu thử thêm chuẩn với nồng độ tương ứng 80%, 100% 120% lượng acid gallic có mẫu thử, kí hiệu mẫu thử A, B, C Với nồng độ thêm chuẩn, tiến hành tạo mẫu thử thêm chuẩn  Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Để xác định LOD LOQ, tiến hành chuẩn bị dung dịch mẫu trắng cách lấy 10 bình định mức cỡ 10 ml, cho vào bình chứa sẵn ml methanol Sau thêm 2,5 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% để phản ứng phút Thêm ml dung dịch Na2CO3 2%, định mức nước cất hai lần Sau 60 phút phản ứng nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng 754,5 nm LOD = 3,3 x LOQ = 10 x SD a SD a Trong đó: SD: độ lệch chuẩn phép phân tích mẫu trắng; a : độ dốc đường tuyến tính  Độ vững Độ vững phương pháp mức độ lặp lại kết phân tích có thay đổi nhỏ số thông số phương pháp Cách tiến hành: Đo mẫu thử ba bước sóng 752,5 nm, 754,5 nm, 756,5 nm Phụ lục Kết thẩm định phương pháp định lượng  Độ phù hợp hệ thống Để xác định độ phù hợp hệ thống tiến hành mục 2.3.1.3 Kết trình bày bảng 4.1 Bảng Kết xác định độ phù hợp hệ thống STT A (Asb) Kết 0,408 0,408 0,409 0,409 0,409 0,410 A = 0,408 RSD = 0,17% Nhận xét: Kết cho thấy quy trình đo có độ phù hợp hệ thống với RSD = 0,17% đảm bảo yêu cầu (RSD < 2%)  Xác định khoảng nồng độ tuyến tính Tiến hành thí nghiệm mục 2.3.1.3 Kết khảo sát trình bày bảng 3.2 Bảng Độ hấp thụ quang dãy dung dịch chuẩn Nồng độ acid gallic dung dịch đo quang (μg/ml) Mật độ quang Phương trình hồi qui tuyến tính Hệ số tương quan 10 0,183 0,381 0,543 0,76 0,917 y = 0,0923x + 0,0027 r2 = 0,9979 Từ Bảng 2, tiến hành phân tích hồi quy Microsoft Excel ta được: Mật độ hấp thụ quang 0.9 y = 0.0923x + 0.0027 R² = 0.9979 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 12 Nồng độ acid gallic (µg/ml) Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn bước sóng 754,5 nm Từ kết bảng hình cho thấy với nồng độ acid gallic dung dịch đo quang từ 2-10 µg/ml có tương quan tuyến tính độ hấp thụ quang nồng độ acid gallic theo phương trình y = 0,0923x + 0,0027 với hệ số tương quan r2 = 0,9979  Độ lặp lại phương pháp Để xác định độ lặp lại phương pháp, tiến hành thí nghiệm mục 2.3.1.3 Kết thu bảng Bảng Kết xác định độ lặp lại phương pháp STT m (g) 0,1051 0,1057 0,1048 0,1044 0,1050 0,1053 A(Abs) 0,409 0,412 0,408 0,396 0,408 0,409 Kết A= 0,407, RSD = 1,25% Nhận xét: Kết cho thấy phương pháp có độ lặp lại với RSD = 1,25% đảm bảo yêu cầu (RSD < 2%)  Độ (Độ thu hồi) Để xác định độ hay độ thu hồi, chuẩn bị ba mẫu dung dịch thử thêm chuẩn có nồng độ acid gallic tương ứng với 80%, 100%, 120% nồng độ acid gallic có dung dịch thử Với nồng độ chuản bị ba mẫu tiến hành mục 2.3.1.3 Kết thu bảng Bảng Kết xác định độ thu hồi phương pháp Lượng chuẩn Lượng chuẩn tìm thêm vào (µg) lại (µg) 12,58 12,50 99,4 12,58 12,71 101,0 12,58 12,60 100,2 20,97 21,10 100,6 20,97 21,10 100,6 20,97 21,31 101,6 29,35 29,80 101,5 29,35 29,59 100,8 29,35 30,12 102,6 STT Kết R = 100,9%, RSD = 0,57% Khoảng tin cậy 95% 100,3% - 101,5% R% Trung bình 100,2 100,9 101,6 Nhận xét: Kết cho thấy thêm lượng acid gallic chuẩn khác nhau, phương pháp cho độ thu hồi nằm khoảng 98-102% độ lệch chuẩn tương đối