Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác ĐÁNH GIÁ MỘT THỬ NGHIỆM DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT TÁC NHÂN GÂY BỆNH Mục tiêu • Đònh nghóa chuẩn vàng để dùng làm chuẩn đánh giá xét nghiệm dùng hay triển khai phòng thí nghiệm • Tính độ nhạy cảm (Se) độ đặc hiệu (Sp) xét nghiệm để tính toán, phân tích, biết ý nghóa hai trò số đánh giá xét nghiệm dùng hay triển khai dùng • Tính giá trò tiên đoán dương (PPV) giá trò tiên đoán âm (NPV) để giúp nhà lâm sàng đánh giá hữu dụng lâm sàng kết xét nghiệm đồng thời cho đònh xét nghiệm có hiệu chẩn đoán bệnh • Tính hệ số kappa để ứng dụng đánh giá độ phù hợp hai thử nghiệm khác dùng cho mục đích phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh • Tính hệ số biến thiên (CV) để phân tích độ lặp lại xét nghiệm dùng hay triển khai phòng thí nghiệm Chuẩn vàng gì? Để đánh giá thử nghiệm nghiên cứu dùng phát tác nhân gây bệnh, người ta phải so sánh thử nghiệm với chuẩn vàng (gold standard) Chuẩn vàng tiêu chuẩn dùng để xác đònh bệnh thật không bệnh thật Chuẩn vàng cần dựa vào xét nghiệm, dấu chứng lâm sàng, hay phải dựa vào kết hợp nhiều dấu hiệu xét nghiệm dấu chứng lâm sàng; quan trọng phải nhiều người thừa nhận y văn Độ nhạy cảm độ đặc hiệu thử nghiệm Đối với nhà nghiên cứu sản xuất thử nghiệm hay phòng thí nghiệm áp dụng thử nghiệm, có hai thông số cần phải đánh giá, độ nhạy cảm độ đặc hiệu thử nghiệm 155 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác • Độ nhạy cảm (sensitivity = Se) thử nghiệm tỷ lệ phần trăm cho kết [+] số mẫu bệnh thật • Độ đặc hiệu (specificity = Sp) thử nghiệm tỷ lệ phần trăm cho kết [-] số mẫu không bệnh thật Ví dụ: Để nghiên cứu Se Sp thử nghiệm ELISA phát kháng thể đặc hiệu chẩn đoán lao phổi, nhà nghiên cứu thử 100 mẫu huyết bệnh nhân bò lao (xác đònh chuẩn vàng nuôi cấy đàm [+] vi khuẩn M tuberculosis hay phết nhuộm kháng acid mẫu đàm [+] kèm X quang phổi thấy tổn thương thâm nhiễm đỉnh phổi điển hình lao); 100 mẫu huyết bệnh nhân xác đònh bò viêm phổi tác nhân vi khuẩn khác loại trừ nhiễm lao Kết trình bày bảng sau: Bảng 11: Ví dụ kết thử nghiệm ELISA phát kháng thể đặc hiệu để chẩn đoán lao • Bệnh nhân lao phổi [+] Bệnh nhân lao phổi [-] Tổng ELISA [+] a = 75 b = 30 a+b = 105 ELISA [-] c = 25 d = 70 c+d = 95 Tổng a+c = 100 b+d = 100 a+b+c+d = 200 Độ nhạy cảm thử nghiệm ELISA là: Se = • a = a+c 75 = 75% 75 + 25 Độ đặc hiệu thử nghiệm ELISA là: Sp = d 70 = = 70% b+d 30 + 70 Giá trò tiên đoán dương giá trò tiên đoán âm thử nghiệm Đối với nhà lâm sàng hay điều trò giá sử dụng thử nghiệm phải trả lời hai câu hỏi: (1) Nếu thử nghiệm có kết [+] tỷ lệ xác để kết luận bệnh nhân bò bệnh phần trăm? Thông số gọi giá trò tiên đoán dương (PPV = Positive predictive value) (2) Nếu kết thử ngiệm [-] tỷ lệ xác để kết luận bệnh nhân không bò bệnh phần trăm? Thông số gọi giá trò tiên 156 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác đoán âm (NPV = Negative predictive value) Nếu dựa vào kết trình bày bảng 12 giá trò tiên đóan dương (PPV) giá trò tiên đoán âm (NPV) thử nghiệm ELISA phát kháng thể đặc hiệu M tuberculosis để chẩn đoán lao là: PPV = a 75 = = 71% a+b 75 + 30 NPV = 70 d = = 74% 25 + 70 c+d Tuy nhiên, tính PPV NPV thử nghiệm ELISA dựa kết nghiên cứu số lượng mẫu âm hay mẫu dương biết trước không nói xét nghiệm ELISA hữu dụng đem áp dụng thực tế Lấy ví dụ, dùng thử nghiệm ELISA để tầm soát lao khu vực dân cư có tỷ lệ mắc bệnh lao 1/10.000 kết ELISA [+], độ xác để xác đònh nhiễm lao người làm thử nghiệm (tức PPV); kết ELISA [-] độ xác để xác đònh không bò nhiễm lao người làm thử nghiệm (tức NPV) bao nhiêu? Sau cách tính: Nếu khu vực dân cư có 1.000.000 người, số người mắc bệnh lao 100 người, số người không mắc lao 999.900 người Vì độ nhạy thử nghiệm 75% nên trên 100 người mắc lao này, thử nghiệm cho kết [+] 75 người, độ đặc hiệu thử nghiệm 70% nên 999.900 người không bò nhiễm lao có 699.930 người cho kết ELISA [-], và 299.970 cho kết ELISA [+] Các số liệu trình bày vào bảng đây: Bảng 12: Ví dụ kết thử nghiệm ELISA tầm soát lao, giả đònh thực tất 1.000.000 người quần thể có tỷ lệ mắc lao 1/10.000 Bệnh nhân lao phổi [+] Bệnh nhân lao phổi [-] Tổng ELISA [+] a = 75 b = 299.970 a+b = 300.045 ELISA [-] c = 25 d = 699.930 c+d = 699.955 Tổng 100 999.900 1.000.000 157 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác PPV NPV thử nghiệm ELISA phát lao ứng dụng đối tượng là: PPV = a a+b = 75 300.045 = 0.02% NPV = d c+d = 699.930 699.955 = 99.99% Tính toán chứng minh kết ELISA [+], khả xác đònh bò nhiễm lao người thử nghiệm 0.02%, kết ELISA [-] khả xác đònh không bò nhiễm lao người thử nghiệm đến 99.99% Có nghóa với độ nhạy 75% độ đặc hiệu 70% ELISA cho kết [-] có giá trò nhiều so với ELISA cho kết [+] mục đích sử dụng để tầm soát lao người bình thường quần thể dân cư Như vậy, hữu dụng xét nghiệm bác só lâm sàng hay nhà điều trò tuỳ thuộc nhiều vào xác suất chẩn đoán trước cho xét nghiệm Trong trường hợp ELISA chẩn đoán lao nêu trên, bác só nghi ngờ bệnh nhân bò lao (xác suất 50%) PPV NPV 71% 74% thiết kế thí nghiệm tìm Se Sp với 50% mẫu nhiễm lao 50% mẫu không nhiễm lao, cho xét nghiệm cầu may PPV thấp 0.02% lúc xác suất chẩn đoán lao tiền xét nghiệm thấp trường hợp cho xét nghiệm ELISA để tầm soát lao đại trà quần thể dân cư ví dụ Tóm lại nhà lâm sàng hay điều trò thường hay đặt câu hỏi độ nhạy cảm độ đặc hiệu thử nghiệm mà hai thông số có giá trò hữu dụng họ Thông số thật hữu dụng nhà lâm sàng hay điều trò PPV NPV Hai giá trò bò ảnh hưởng phần độ nhạy độ đặc hiệu thử nghiệm, lại bò ảnh hưởng lớn xác suất chẩn đoán bác só trước đặt bút yêu cầu xét nghiệm Nếu độ nghi ngờ bệnh nhân bò mắc bệnh cần chẩn đoán cao, kết xét nghiệm hữu dụng cho lâm sàng Còn cho xét nghiệm cầu may, hữu dụng lâm sàng kết xét nghiệm thấp 158 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác So sánh hai thử nghiệm khác cho mục đích phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh Để so sánh hai xét nghiệm, thông số sau cần phân tích, là: Độ tương đồng độ khác biệt hay gọi độ phù hợp độ không phù hợp Cách tính toán dựa vào bảng trình bày sau đây: Bảng 13: Ví dụ so sánh kết thử nghiệm ELISA thử nghiệm tụ latex (LAT) phát kháng thể đặc hiệu M tuberculosis 100 mẫu huyết lấy thử nghiệm Thử nghiệm ELISA Tổng + - Thử nghiệm + a = 65 c = 10 a+c = 75 LAT - b = 10 d = 15 b+d = 25 a+b = 75 c+d = 25 n = 100 Tổng Độ phù hợp quan sát (agreement degree) tỷ lệ % kết mà hai thử nghiệm cho kết giống Độ không phù hợp quan sát (disagreement degree) tỷ lệ % kết mà hai thử nghiệm cho kết khác Phân tích bảng thấy: • Độ phù hợp quan sát là: a+d a+b+c+d • = 65+15 65+10+10+15 = 80% Độ không phù hợp quan sát là: c+b a+b+c+d = 10+10 65+10+10+15 = 20% Tuy độ phù hợp quan sát được, dựa vào trò số để đánh giá mức độ phù hợp hai xét nghiệm Các nhà dòch tễ học lâm sàng nghiên cứu đưa thông số, gọi hệ số kappa, dựa vào giá trò hệ số kappa, phòng thí nghiệm hay nhà lâm sàng đánh giá độ phù hợp hai thử nghiệm dựa theo bảng sau: 159 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Bảng 14: Bảng đánh giá mức độ phù hợp hai thử nghiệm dựa theo hệ số kappa Hệ số kappa Mức độ phù hợp Hệ số kappa Mức độ phù hợp 0.0 – 0.2 Quá thấp 0.6 – 0.8 Khá 0.2 – 0.4 Thấp 0.8 – 1.0 Cao 0.4 – 0.6 Vừa Sau cách tìm hệ số kappa: • Phù hợp quan sát được, tính sau: (a+d) x 100 n • Phù hợp ngẫu nhiên, tính sau: (a+b) (a+c) (c+d) (b+d) x x 100 + x x 100 n n n n • Phù hợp hoàn toàn, giả đònh hai phù hợp hoàn toàn với nhau, trò số 100 • Phù hợp thực tại, tính sau: Phù hợp quan sát – Phù hợp ngẫu nhiên • Phù hợp tiềm ẩn, tính sau: Phù hợp hoàn toàn – Phù hợp ngẫu nhiên Từ giá trò trên, hệ số kappa tính theo công thức sau: Hệ số kappa = Phù hợp thực Phù hợp tiềm ẩn Trong ví dụ trình bày bảng 14, sau có giá trò phù hợp ngẫu nhiên (62.5), phù hợp quan sát (100), phù hợp thực (17.5), phù hợp tiềm ẩn (37.5); hệ số kappa là: Kappa = 17.5 37.5 = 0.47 Với giá trò hệ số kappa tính được, kết luận ELISA LAT phát kháng thể đặc hiệu M tuberculosis có độ phù hợp mức độ vừa 160 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Ngoài ra, phân tích độ phù hợp dương, tức tỷ lệ % hai thử nghiệm cho kết [+] tổng số kết giống hai xét nghiệm; độ phù hợp âm tỷ lệ % hai thử nghiệm cho kết [-] tổng số kết giống cà hai xét nghiệm Trong ví dụ trên, thấy: • Độ phù hợp dương ELISA LAT là: a a+d • 65 65+15 = = 81% Độ phù hợp âm ELISA LAT là: d a+d 15 65+15 = = 19% Độ lặp lại xét nghiệm Độ lặp lại kết đònh lượng xét nghiệm làm nhiều lần môt mẫu bệnh phẩm gọi độ lặp lại xét nghiệm Thông số nói lên độ lặp lại xét nghiệm gọi hệ số biến thiên (CV = Coefficient of variation) kết xét nghiệm Trên mẫu bệnh phẩm, chia để làm xét nghiệm, kết qua đònh lượng A1, A2, A3, A4 An Chúng ta tính kết trung bình độ lệch chuẩn σ sau: = σ= A1+A2+A3+A4+ +An N Σ (A- )2 N Hệ số biến thiên tỷ lệ phần trăm độ lệch chuẩn so với số trung bình, tính theo công thức sau: CV = 100x σ % Hệ số biến thiên gọi hệ số phân tán, cho biết độ lặp lại thử nghiệm có tốt hay không Thường thử nghiệm đánh giá có độ lặp lại tốt CV ≤ 10% 161 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Câu hỏi ôn tập Cho biết chuẩn vàng gì? Ý nghóa chuẩn vàng đánh giá xét nghiệm Hãy cho biết cách tính độ nhạy cảm độ đặc hiệu xét nghiệm Ý nghóa hai thông số đánh giá xét nghiệm Với xét nghiệm sử dụng, làm để nâng cao độ nhạy cảm hay độ đặc hiệu xét nghiệm đó? Hãy cho biết cách tính giá trò tiên đoán dương giá trò tiên đoán âm xét nghiệm Đối với bác só điều trò phải làm để giá trò tiên đoán dương giá trò tiên đoán âm xét nghiệm có giá trò cao nghóa xét nghiệm hữu dụng cao lâm sàng? Cho biết cách để tìm độ phù hợp hai xét nghiệm sử dụng cho mục đích phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh? Cho biết cách để đánh gía độ lặp lại xét nghiệm? 162