Xây dựng CSDL hai gene 16S và 23S rRNA ở vi khuẩn - Ứng dụng CSDL này để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ

Xây dựng CSDL hai gene 16S và 23S rRNA ở vi khuẩn - Ứng dụng CSDL này để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

LÊ VĂN TÁM

XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN – ỨNG DỤNG CƠ SỞ DỮ LIỆU

HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN ĐỂ

PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ (Bacterial Meningitis)

Luận văn kỹ sư

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Thành phố Hồ Chí Minh

-2006-

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN – ỨNG DỤNG CƠ SỞ DỮ LIỆU

HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN ĐỂ

PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ (Bacterial Meningitis)

Luận văn Kỹ sư

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LƯU PHÚC LỢI

Thành phố Hồ Chí Minh

-2006-

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAININGNONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

************

CONSTRUCT DATABASE OF 16S AND 23S RIBOSAMAL RNA

GENE IN BACTERIA – APPLICATION THE DATABASE FOR DETECTION BACTERIAL MENINGITIS

Graduation thesis Major: Biotechnology

LUU PHUC LOI

Ho Chi Minh City -2006-

iii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

TS Trần Thị Dung và Cử Nhân Lưu Phúc Lợi đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp

Xin gởi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã động viên, giúp đỡ và luôn ở bên cạnh tôi trong những lúc vui buồn

Cha mẹ kính yêu đã nuôi nấng, dạy dỗ và động viên để con có thể đạt được thành quả như ngày hôm nay

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006 Sinh viên

LÊ VĂN TÁM

iv

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

LÊ VĂN TÁM, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “XÂY

DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN – ỨNG DỤNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI

KHUẨN ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ (Bacterial Meningitidis)”

Hội đồng hướng dẫn:

– TS Trần Thị Dung – Cử nhân Lưu Phúc Lợi

Khóa luận được thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, từ tháng 1/2006 đến 8/2006

Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, một số lượng lớn các gene 16S và 23S rRNA đã được giải trình tự Những trình tự gene này được lưu trữ trong CSDL

sinh học lớn như NCBI, EMBL, DDBj…Vì các CSDL này quá lớn và chứa rất nhiều thông tin khác nhau, không tập trung cho một đối tượng cụ thể nên khó có thể thực hiện việc truy xuất các thông tin phục vụ trực tiếp cho một nghiên cứu chuyên biệt Do

vậy, mục tiêu của đề tài là tiến hành xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene 16S và 23S rRNA

ở vi khuẩn và ứng dụng CSDL này để phát hiện các loài vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ

Để đạt được mục tiêu trên, khóa luận cần đảm bảo thực hiện những nội dung như sau:

Dùng Perl script để thu nhận các mẫu tin của hai gene từ trang CSDL GenBank (CSDL nucleotide của NCBI) Tiếp tục sử dụng Perl script tách các mẫu tin thu nhận được thành từng phần riêng biệt như accession number (mã số truy cập), gi, definition, sequence (trình tự của gene)…

Thiết kế CSDL dựa vào mô hình dữ liệu quan hệ Dùng Perl script để chuyển tự động các thông tin tách được ở bước trên vào CSDL

Sử dụng giao thức CGI kết hợp với ngôn ngữ lập trình Perl để thiết kế trang

web CSDL về hai gene 16S và 23S rRNA ở các loài vi khuẩn

v

Sử dụng trình tự của hai gene 16S và 23S rRNA trong CSDL để thiết kế mồi cho

phản ứng PCR phát hiện và phân biệt các tác nhân gây bệnh viêm màng não mủ

Đề tài đã đạt được những kết quả như sau:

Đã thu thập được 2825 mẫu tin về gene 16S rRNA và 305 mẫu tin về gene 23S

rRNA từ cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI)

Tạo được CSDL của hai gene 16S và 23S rRNA tích hợp với web

Trang web CSDL của hai gene và gồm có 5 trang chính: HOME, SEARCH, TOOL, LINK, ABOUT Từ các trang web này, người sử dụng có thể truy xuất thông tin, tìm kiếm trình tự, so sánh một trình tự quan tâm với các trình tự trong

CSDL (alignment, BLAST)… Ngoài ra, những trang web chính này còn kết nối

đến những trang phụ khác để cung cấp các tiện ích cho người dùng

Thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện các tác nhân gây bệnh viêm màng não mủ bằng chương trình thiết kế mồi Primrose

vi

MỤC LỤC

Nội dung Trang

LỜI CẢM ƠN iii

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 SƠ LƯỢC VỀ CƠ SỞ DỮ LIỆU 3

2.2.1.3 Một số module của Perl thường được sử dụng 4

2.2.2 Giới thiệu về mạng Internet 5

2.2.3 Tích hợp CSDL với web dùng CGI 5

2.3 CƠ SỞ DỮ LIỆU SINH HỌC 6

2.3.1 NCBI (National Center for Bioinformatic Information) 6

2.3.1.1 Vài nét về NCBI 6

2.3.1.2 Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI 7

2.3.1.3 Một số công cụ trong NCBI 7

2.3.2 EBI (European Bioinformatics Institute) 8

vii

2.3.2.1 Vài nét về EBI 8

2.3.2.2 Một số cơ sở dữ liệu trong EBI 8

2.3.2.3 Một số công cụ hỗ trợ phân tích trình tự sinh học 9

2.3.3 SIB (Swiss Institute of Bioinformatics) 9

2.3.4 DDBJ (DNA Data Bank Japan) và PDBj (Protein Database Japan) 10

2.4 BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 12

2.4.1 Sơ lược về bệnh viêm màng não mủ 12

2.4.1.1 Định nghĩa 12

2.4.1.2 Bệnh theo lứa tuổi 12

2.4.1.3 Các con đường xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh 13

2.4.2 Các triệu chứng biểu hiện lâm sàng của bệnh 13

2.4.2.1 Những triệu chứng giai đoạn khởi phát 13

2.4.2.2 Biểu hiện lâm sàng của viêm màng não mủ 13

2.4.3 Hậu quả của bệnh trên những đối tượng bị lây nhiễm 15

2.4.4 Tình hình bệnh viêm màng não mủ trên thế giới và Việt Nam 15

2.5 VI KHUẨN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 16

2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 18

2.6.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng 18

2.6.2 Phương pháp xét nghiệm vi khuẩn học 18

2.6.3 Phương pháp miễn dịch học 19

2.6.4 Phương pháp tế bào học 19

2.6.5 Phương pháp sinh hoá 19

2.6.5.1 Đường trong dịch não tủy 19

2.6.5.2 Đạm trong dịch não tủy 19

2.6.5.3 Phương pháp khảo sát nồng độ lactate 20

2.6.6 Phương pháp chụp cắt lớp – CT (computer tomography) 20

2.6.7 Phương pháp xét nghiệm dựa vào kỹ thuật PCR 20

2.7 KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 20

2.7.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 20

2.7.2 Quy trình của phản ứng PCR 21

2.7.3 Seminested PCR/ Multiplex PCR 22

2.8 GENE 16S rRNA VÀ 23S rRNA 24

2.8.1 RNA ribosome (rRNA) – Cấu trúc ribosome 24

2.8.2 Gene 16S rRNA thước đo tiến hóa 25

2.8.3 Gene 23S rRNA 28

2.9 ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ BẰNG KHÁNG SINH 28

PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP VÀ CÁC CHƯƠNG TRÌNH SỬ DỤNG 29

3.1 CÁC CHƯƠNG TRÌNH VÀ NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH ĐƯỢC SỬ DỤNG 29 3.1.1 Hệ điều hành 29

3.1.2 Các chương trình phân tích trình tự 29

3.1.2.1 Chương trình so sánh trình tự ClustalW 29

3.1.2.2 Chương trình tìm kiếm các trình tự tương đồng – BLAST 30

3.1.3 Hệ quản trị CSDL quan hệ MySQL 30

3.1.4 Apache web server 31

3.1.5 Ngôn ngữ lập trình Perl và các gói sử dụng 31

3.1.6 Chương trình thiết kế mồi Primrose 2.17 32

3.2.3.3 Lưu trữ các thông tin vào CSDL 41

3.2.4 Tích hợp CSDL gene 16S rRNA và 23S rRNA với trang web 42

3.3 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn viêm màng não 42

3.3.1 Thiết kế mồi dựa trên trình tự gene 16S rRNA 43

3.3.2 Thiết kế mồi dựa trên trình gene 23S rRNA 47

3.3.3 Nhiệt độ nóng chảy của mồi 51

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

ix

4.1 Kết quả thu nhận các mẫu tin chứa trình tự và thông tin liên quan của hai

gene 16S và 23S rRNA 52

4.2 CSDL gene 16S và 23S rRNA 52

4.3 Trang web thể hiện thông tin CSDL gene 16S và 23S rRNA 52

4.3.1 Trang thông tin chung về CSDL gene 16S và 23S rRNA (Home Page) 54

4.3.2 Trang tìm kiếm (Search Page) 55

4.3.3 Trang công cụ (Tool Page) 58

x

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Trang

Bảng 2.1 Tóm tắt tác nhân gây bệnh theo lứa tuổi 12

Bảng 2.2 Dấu hiệu và triệu chứng của bệnh viêm màng não mủ 14

Bảng 2.3 Các nhóm kháng sinh đặc trị vi khuẩn viêm màng não mủ 28

Bảng 3.1 Các đối tƣợng phụ dựa trên đối tƣợng chính sinh vật 38

Bảng 3.2 Các đối tƣợng phụ dựa trên đối tƣợng chính trình tự 39

Sơ đồ tóm tắt quá trình thu nhận mẫu tin của hai gene 16S và 23S rRNA 33

Sơ đồ các đối tƣợng chính trong CSDL hai gene 16S và 23S rRNA 38

Sơ đồ chi tiết các bảng quan hệ 40

Sơ đồ cấu trúc các trang web thể hiện thông tin CSDL gene 16S và 23S rRNA 53

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Tương tác giữa Perl script-DBI-DBD và RBDMS 5

Hình 2.2 Tương quan giữa NCBI, NLM (National Library of Medicine) và NIH 6

Hình 2.3 Một số cơ sở dữ liệu trong EBI 9

Hình 2.4 Ba cơ sở dữ liệu nucleotide (GenBank – EMBL – DDB) và công cụ tìm kiếm tương ứng 11

Hình 2.5 Sự hợp nhất của ba cơ sở dữ liệu MSD, PDBj, PDB 11

Hình 2.6 Quy trình phản ứng PCR 21

Hình 2.7 Thành phần cấu tạo của ribosome ở prokaryote 25

Hinh 2.8 Vị trí và kích thước của 16S và 23S rRNA trong bộ gene vi khuẩn 27

Hình 3.1 Tìm kiếm bằng từ khóa trong trang Home Page của NCBI 34

Hình 3.2 Trang kết quả tìm kiếm bằng từ khóa cho gene 16S rRNA 34

Hình 3.3 Kết quả tìm kiếm thể hiện ở dạng text 35

Hình 3.4 File text chứa mã số truy cập 35

Hình 3.5 Tất cả mẫu tin của gene 16S rRNA 36

Hình 3.6 Một mẫu tin của gene 16S rRNA có mã số truy cập AB016268 37

Hình 3.7 Thiết kế CSDL ở mức vật lý 41

Hình 3.8 Tiến trình lấy thông tin từ CSDL hai gene ở vi khuẩn 42

Hình 3.9 Tạo CSDL trình tự gene 16S rRNA ở các vi khuẩn viêm màng não mủ 43

Hình 3.10 Chọn trình tự đích trong thiết kế mồi phát hiện Streptococcus pneumoniae dựa trên gene 16S rRNA 43

Hình 3.11 Xác định các thông số cho mồi và số lượng mồi được tạo ra trên trình tự đích 16S rRNA 44

Hinh 3.12 Danh sách các mồi thiết kế được trên 16S rRNA 44

Hình 3.13 Vị trí bắt cặp của mồi xuôi trên trình tự đích 16S rRNA 45

Hình 3.14 Vị trí bắt cặp của mồi ngược trên trình tự đích 16S rRNA 46

Hinh 3.15 Kiểm tra lại sự bắt cặp của mồi ngược và mồi xuôi trên trình tự đích 16S rRNA 46

Hình 3.16 Kết quả kiểm tra sự bắt cặp mồi xuôi và mồi ngược trên trình tự đích gene 16S rRNA 47

xii

Hình 3.17 Danh sách các mồi thiết kế đƣợc cho trình tự gene 23S rRNA ở

Streptococcus pneumoniae 48

Hình 3.18 Vị trí bắt cặp của mồi xuôi trên trình tự đích 23S rRNA 49

Hình 3.19 Vị trí bắt cặp của mồi ngƣợc trên trình tự đích 23S rRNA 49

Hình 3.20 Kiểm tra lại sự bắt cặp của mồi ngƣợc và mồi xuôi trên trình tự đích 23S rRNA 50

Hình 3.21 Kết quả kiểm tra sự bắt cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc trên trình tự đích gene 23S rRNA 50

Hình 3.22 Tính nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi 16S 51

Hình 4.1 Trang Home Page 54

Hình 4.2 Trang tìm kiếm theo mã số truy cập (accession number) 55

Hình 4.3 Trang kết quả tìm kiếm bằng mã số truy cập 56

Hình 4.4 Trang tìm kiếm theo tên loài (species name) 57

Hình 4.5 Trang kết quả tìm kiếm theo tên loài (species name) 57

Hình 4.6 Trang công cụ sắp gióng cột (Alignment) 58

Hình 4.7 Trang kết quả sắp gióng cột hai trình tự 59

Hình 4.8 Trang công cụ BLAST 59

HTML Hypertext Markup Language HTTP Hypertext Transfer Protocol

NCBI Center for Bioinformatic Information BLAST Basic Local Alignment Search Tool EBI European Bioinformatics Institute

EMBL European Molecular Biology Laboratory SIB Swiss Institute of Bioiformatics

DDBJ DNA Data Bank Japan PDBj Protein Database Japan PCR Polymerase Chain Reaction rRNA ribosomal RNA

PHẦN 1:MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự phát triển của ngành công nghệ thông tin trong những thập kỷ qua đã góp phần cải thiện chất lượng cuộc sống con người Máy tính đã có mặt trong hầu hết các ngành khoa học, hỗ trợ con người giải quyết những công việc khó khăn và nhiều thời gian

Công nghệ sinh học được xem là ngành khoa học mũi nhọn của thế kỷ XXI Với sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự, nhiều bộ gene của sinh vật đã được giải mã, tạo ra một lượng dữ liệu sinh học khổng lồ Điều này đòi hỏi có sự lưu trữ, quản lí và khai thác các dữ liệu một cách hiệu quả Với khả năng xử lí và truy xuất lượng thông tin lớn và nhanh chóng, máy tính đã trở thành công cụ hữu ích trong nghiên cứu sinh học Sự kết hợp giữa ngành sinh học và tin học đã cho ra đời một công cụ mới đó là Tin – Sinh học (Bioinformatics) Tin – Sinh học giúp giải quyết hàng loạt những nghiên cứu trong sinh học mà đòi hỏi thời gian dài hay khó có thể thực hiện bằng tay được

Cho đến nay, Tin – Sinh học đạt được nhiều thành tựu to lớn Nhiều CSDL sinh học đã được thiết lập như NCBI, EMBL, DDBJ…Các CSDL này chứa lượng lớn thông tin phục vụ đắc lực cho các nhà nghiên cứu sinh học

Gene 16S và 23S rRNA là 2 gene có chức năng cần thiết cho sự sống của vi

khuẩn, vừa có vùng bảo tồn và vừa có vùng biến động ở các cấp độ khác nhau, giúp cho việc định danh hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn Các gene này đã được giải trình tự và lưu trữ trong các CSDL sinh học trực tuyến Tuy nhiên, việc tìm kiếm các thông tin trình tự của hai gene trong các CSDL lớn thường tốn nhiều thời gian do thông tin không tập trung cho một đối tượng cụ thể

Hiện nay, rất nhiều bệnh nguy hiểm do vi khuẩn gây ra trong đó có bệnh viêm màng não mủ Bệnh xảy ra thường xuyên và để lại di chứng nặng nề nếu không điều trị kịp thời Việc chẩn đoán bệnh bằng các phương pháp truyền thống thường hạn chế về mặt thời gian Phương pháp PCR hiện nay được sử dụng rộng rãi do tính đơn giản,

nhanh và chính xác Gene 16S và 23S rRNA là hai gene thích hợp cho việc thiết kế mồi

đặc hiệu để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não

Với các lý do trên cùng với sự đồng ý hướng dẫn của TS Trần Thị Dung và Cử

nhân Lưu Phúc Lợi, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng CSDL hai gene 16S và 23S

rRNA ở vi khuẩn - Ứng dụng CSDL này để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm

màng não mủ”

1.2 MỤC ĐÍCH

– Thu thập trình tự và thông tin liên quan về hai gene 16S và 23S rRNA ở vi

khuẩn, tổ chức thành một CSDL riêng biệt

– Ứng dụng trình tự hai gene trong CSDL để thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ Từ đó chứng minh khả năng sử dụng

của gene 23S rRNA có nhiều ưu điểm hơn so với gene 16S rRNA

– Tìm hiểu khả năng ứng dụng trong phát hiện tác nhân gây bệnh của phần mềm Primrose 2.17 (trước đó phần mềm này ra đời với mục đích phân loại phả hệ bằng

gene 16S rRNA)

1.3 YÊU CẦU

– CSDL phải chứa một lượng lớn trình tự của hai gene 16S và 23S rRNA ở các

loài vi khuẩn khác nhau trong đó có vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ

– CSDL phải được tích hợp với web, tạo giao diện thân thiện với người sử dụng – Thông qua các trang web, người dùng có thể truy cập CSDL để tìm kiếm các thông tin về hai gene như tên của vi khuẩn, tên của trình tự, chiều dài trình tự, tác giả giải trình tự…

– Tích hợp các công cụ phân tích trình tự vào trang web như BLAST, Alignment…

– Thiết kế mồi đặc hiệu phân biệt được các vi khuẩn trong nhóm vi khuẩn viêm màng não mủ thông qua chương trình thiết kế mồi Primrose 2.17

PHẦN 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 SƠ LƯỢC VỀ CƠ SỞ DỮ LIỆU 2.1.1 Định nghĩa

Cơ sở dữ liệu (CSDL) là một tập hợp dữ liệu được tổ chức theo một cấu trúc chặt chẽ nhằm phục vụ cho nhiều mục tiêu khác nhau một cách có chọn lọc Tập hợp dữ liệu sẽ được lưu trữ trên các thiết bị lưu trữ thông tin thứ cấp như băng từ, đĩa từ… để thỏa mãn nhu cầu khai thác thông tin đồng thời của nhiều người sử dụng hay nhiều chương trình ứng dụng với nhiều mục đích khác nhau

2.1.2 Hệ quản trị CSDL (Database Management System – DBMS)

Là một hệ thống phần mềm cho phép các nhà phân tích và thiết kế CSDL cũng như người khai thác CSDL được thuận lợi trong quá trình thiết kế, thao tác, truy xuất và quản lý dữ liệu

Hiện nay, một số hệ quản trị CSDL mạnh đang được đưa ra thị trường như Visual FoxPro, SQL-Server, Oracle…

2.1.3 Các mô hình dữ liệu

Mô hình dữ liệu là sự trừu tượng hóa thế giới thực, là sự biểu diễn dữ liệu ở mức quan niệm Hiện nay, có năm loại mô hình dữ liệu chính Đó là:

Mô hình dữ liệu mạng Mô hình dữ liệu phân cấp Mô hình dữ liệu quan hệ

Mô hình dữ liệu thực thể kết hợp Mô hình dữ liệu hướng đối tượng

2.2 NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH PERL, MẠNG INTERNET VÀ WEB 2.2.1 Perl

2.2.1.1 Tóm tắt lịch sử phát triển

Perl (Practical Extraction and Report Language) do Larry Wall tạo ra vào năm 1986 nhằm quản trị các mạng máy tính lớn Ngôn ngữ này phát sinh từ ngôn ngữ lập trình C và bị ảnh hưởng bởi ngôn ngữ khác như BASIC, Awk, Sed và UNIX shell

Năm 2000, phiên bản 5.6 xuất hiện Phiên bản này đã chuyển sang định dạng tiêu chuẩn và có sự hỗ trợ cả Unicode và UTF-8

Năm 2002, phiên bản Perl 5.8 ra đời cùng với nhiều cải tiến mới được bổ sung

2.2.1.2 Ứng dụng

Perl được dùng để xử lý tập tin, truy cập dữ liệu và được dùng cho giao diện cổng chung (Common Gateway Interface – CGI), tiến hành tạo script của Microsoft Windows, tạo giao diện người dùng đồ họa (Graphical User Interface – GUI)

Ưu điểm: là ngôn ngữ dễ nắm bắt, thích hợp cho xử lý chuỗi và văn bản thuần túy, được sự hỗ trợ của nhiều hệ điều hành Vì vậy, Perl là ngôn ngữ lập trình thích hợp cho các nhà tin – sinh học vì nó có thể giúp cho việc thao tác trên các chuỗi trình tự sinh học, tạo CSDL sinh học dễ dàng hơn Ngoài ra, Perl còn được hỗ trợ bởi các module (tập các hàm) giúp kết nối, truy xuất CSDL với trang web, tạo ra trang web động

Nhược điểm: chỉ có thể dùng để viết các chương trình, script nhỏ

2.2.1.3 Một số module của Perl thường được sử dụng

Module CGI (Common Gateway Interface): Module này gồm các hàm giúp

viết kịch bản Perl theo giao thức CGI Các script này giúp lấy thông tin từ trình duyệt khách gởi đến máy chủ, đưa vào chương trình xử lý và trả thông tin kết quả đến máy khách

Module DBI (Database Interface): là tập các hàm, biến và những qui ước

cần thiết cho việc tương tác với một CSDL nhất định thông qua Perl script, hoàn toàn độc lập với hệ quản trị CSDL (Tim Bunce) Những tương tác có thể nhập, nâng cấp, xử lý, rút trích…dữ liệu vào hay ra khỏi CSDL

Module DBD (Database Driver): là một module phụ thuộc loại hệ quản trị

CSDL và liên kết với module DBI để truy cập vào một loại hệ quản trị CSDL nhất định Như vậy tương ứng với một hệ quản trị CSDL có một loại DBD Ví dụ như hệ quản trị MySQL có Database Driver là DBD::MySQL

Hình 2.1 Tương tác giữa Perl script-DBI-DBD và RBDMS

2.2.2 Giới thiệu về mạng Internet

Năm 1957, Bộ quốc phòng Mỹ thành lập cơ quan nghiên cứu các dự án kỹ thuật cao ARPA (Advanced Research Projects Agency), thuộc một bộ phận trong bộ quốc phòng Chỉ một thập niên sau, năm 1969, ARPA thiết lập mạng ARPANET – tiền thân của Internet ngày nay ARPANET là một mạng máy tính nối bốn máy chủ tại các trường đại học California – Los Angeles, đại học California – Santa Barbara, viện nghiên cứu Standford và đại học Utah lại với nhau

Đến năm 1973, mạng xuyên quốc gia đầu tiên được thiết lập giữa hai nước Anh và Na Uy

Năm 1982, giao thức TCP/IP ra đời và nhanh chóng trở thành giao thức chuẩn

Internet dần dần được phát triển và đột phá từ khi có sự ra đời của dịch vụ WWW (World Wide Web) Và từ đây, Internet được mở rộng sử dụng cho các ngành

nghiên cứu khác và trở thành một công cụ có mục đích thương mại

2.2.3 Tích hợp CSDL với web dùng CGI

Gồm ba bước:

Bước 1: từ trình duyệt web (trên máy client) gởi đi những yêu cầu của

người dùng đến máy server Ở máy server, thông qua trình ứng dụng CGI chuyển những yêu cầu đó thành những câu truy vấn SQL

Bước 2: kết nối CSDL, thực hiện những câu truy vấn đó P

ERL SCRIPT

DBI Swi t ch

NLM NCBI NIH

Bước 3: thu lấy kết quả truy vấn, thông qua trình ứng dụng CGI chuyển kết

quả thu được từ CSDL thành định dạng HTML, rồi trả về máy client

2.3 CƠ SỞ DỮ LIỆU SINH HỌC

Sự phát triển của kỹ thuật và thiết bị thí nghiệm như kỹ thuật DNA Microarray, kỹ thuật giải trình tự tự động cho phép tạo ra hàng ngàn dữ liệu sinh học trong chốc lát Như vậy vấn đề đặt ra là cần phải có biện pháp lưu trữ, quản lý, sử dụng và chia sẻ nguồn dữ liệu này Do đó cần xây dựng các dữ liệu này thành một CSDL hoàn chỉnh để có thể thực hiện được mục đích trên Hơn thế nữa, với việc hệ thống hóa toàn bộ dữ liệu trên, chúng ta dễ dàng thực hiện việc chia sẻ những thông tin ấy qua mạng Internet hay kết nối thêm vào những tập dữ liệu ở nơi khác

Một số CSDL lớn, trực tuyến đã được xây dựng để cung cấp thông tin cho các nhà nghiên cứu sinh học như NCBI, EBI, SIB, DDBJ…

2.3.1 NCBI (National Center for Bioinformatic Information) 2.3.1.1 Vài nét về NCBI

NCBI là chữ viết tắt của “National Center for Bioinformatic Information” Đây là trung tâm quốc gia về Công nghệ sinh học, thuộc viện sức khỏe quốc gia của Hoa Kỳ (NIH – National Institute of Health) NCBI chính thức được thành lập vào ngày 4/10/1988 Đến năm 1991, NCBI đảm nhiệm việc quản lý CSDL trình tự DNA và từ đó NCBI còn được gọi là GenBank

Hình 2.2 Tương quan giữa NCBI, NLM (National Library of Medicine) và NIH

NCBI là nơi cung cấp, trao đổi thông tin về sinh học phân tử của Mỹ, thông qua những CSDL trực tuyến Ngoài ra, NCBI còn tham gia những nghiên cứu về “sinh học tính toán” (computation biology), phát triển những công cụ phân tích dữ liệu bộ gene, protein…

2.3.1.2 Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI

Nucleotide (GenBank): là CSDL về trình tự nucleotide Protein: là CSDL về trình tự amino acid

Genome: trình tự toàn bộ genome của một số sinh vật

Structure: hay còn có tên gọi là MMDB (Molecular Modeling Database)

chứa cấu trúc ba chiều của những đại phân tử bao gồm cả protein lẫn những chuỗi nucleotide

Ngoài ra, NCBI còn một số CSDL khác Chúng là các CSDL trung gian, được tạo thành từ sự kết hợp của hai hay nhiều CSDL trên, hay do liên kết đến các CSDL khác

2.3.1.3 Một số công cụ trong NCBI

– Công cụ khai thác dữ liệu

Tìm kiếm thông tin sinh học dựa trên từ khóa có dạng văn bản: Entrez: chứa các phương thức tìm kiếm như tìm kiếm dựa trên accession

number hay dựa theo tên sinh vật, tên gene, tên protein…

Tìm kiếm trình tự tương đồng: có phần mềm điển hình như:

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Thông tin hướng dẫn về

BLAST có ở trang BLAST Homepage

Stand-alone BLAST: là phần mềm có thể tải về từ NCBI Phần mềm này

thực hiện việc tìm kiếm các trình tự tương đồng trên CSDL trình tự cục bộ

Phân loại sinh vật:

Taxonomy Browser: công cụ thực hiện việc tìm kiếm trên CSDL Taxonomy Taxonomy BLAST: nhóm lại những kết quả có tỉ lệ tương đồng khi thực hiện

BLAST, tùy thuộc vào sự phân loại của chúng trong CSDL Taxonomy

TaxTable: tóm tắt kết quả sau khi thực hiện BLAST với CSDL Taxonomy và

hiển thị mối quan hệ giữa sinh vật này với sinh vật khác bằng các biểu đồ màu

– Công cụ phục vụ cho việc góp trình tự protein, DNA, EST, STS lên

NCBI

Sequin: phần mềm này có thể tải về từ NCBI, hỗ trợ cho việc tạo ra những

file văn bản (chứa trình tự, tên tác giả, bài báo…) có cấu trúc theo khuôn mẫu Trong phần mềm này còn kèm theo một số công cụ nhỏ như công cụ tìm khung đọc mở, công

cụ gióng cột trình tự… phần mềm này thích hợp cho việc góp nhiều trình tự cùng một lúc

– NCBI còn tích hợp khá nhiều những công cụ, phần mềm phân tích trình tự DNA, protein như:

ORF Finder, Electronic-PCR (e-PCR), VecScreen, Homologene, COGs, COGnitor, GEO, MGC, Clone Registry, CDD, LocusLink…

2.3.2 EBI (European Bioinformatics Institute) 2.3.2.1 Vài nét về EBI

EBI là viện Tin - sinh học của Cộng đồng chung Châu Âu, EBI đặt tại Welcome Trust Genome Campus nước Anh, thành lập năm 1992 EBI bắt nguồn từ EMBL (European Molecular Biology Laboratory) EMBL được thành lập năm 1980 tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử Heidelberg của Đức và đây là CSDL trình tự nucleotide đầu tiên của thế giới

EBI phục vụ cho việc nghiên cứu trong các lĩnh vực như sinh học phân tử, di truyền, y học, nông nghiệp… bằng cách xây dựng, duy trì những CSDL chia sẻ trực tuyến thông tin cần thiết Bên cạnh đó, EBI còn thực hiện những nghiên cứu trong lĩnh vực Tin-sinh học và sinh học phân tử tính toán

2.3.2.2 Một số cơ sở dữ liệu trong EBI

EMBL (European Molecular Biology Laboratory): còn được gọi là

EMBL-BANK chứa CSDL về trình tự DNA, RNA

MSD (Macromolecular Structure Database): chứa thông tin cấu trúc của các

đại phân tử sinh học như protein, DNA, RNA…

ArrayExpress: tích trữ nguồn dữ liệu về sự biểu hiện của gene dựa trên kỹ

thuật Microarray

TrEMBL (Translate EMBL): là cơ sở dữ liệu về protein Do lượng trình tự

này ngày càng nhiều và để quản lý tốt hơn, TrEMBL đã kết hợp với Swiss-Prot (CSDL về trình tự protein của Thụy Sỹ), PIR (CSDL về protein của trường đại học Y Georgetown, Hoa Kỳ) tạo thành CSDL UniProt

Ngoài ra, EBI còn một số CSDL khác Chúng là các CSDL trung gian, được tạo thành từ sự kết hợp của hai hay nhiều CSDL trên hay do liên kết đến CSDL khác

Cơ sở dữ liệu về protein của Thụy Sỹ đặt tại Geneva Cơ sở dữ liệu về protein

của trường đại học Y Georgetown (Mỹ)

2.3.2.3 Một số công cụ hỗ trợ phân tích trình tự sinh học

FASTA: Do Smith và Waterman tạo ra năm 1981, là chương trình tìm kiếm

những trình tự tương đồng, có thể là trình tự DNA hay trình tự protein, trong CSDL đã chọn

Hình 2.3 Một số cơ sở dữ liệu trong EBI

BLAST: chủ yếu là phần mềm WU-BLAST (Washington University Basic

Local Alignment Tool version 2.0) Đặc điểm chính của công cụ này là tìm kiếm vùng trình tự tương đồng nhanh chóng

ClustalW: là công cụ dành cho việc sắp gióng cột ở hai hay nhiều trình tự

sinh học (cả protein và DNA), công cụ này cho ra kết quả có ý nghĩa sinh học cao

2.3.3 SIB (Swiss Institute of Bioinformatics)

Là viện Tin-sinh học của Thụy Sỹ đặt tại Geneva, nơi cung cấp dịch vụ trên web chất lượng cao cho cộng đồng khoa học thế giới qua trang ExPASy (Expert Protein Analysis System)

Một số CSDL trong ExPASy:

SWISS-PROT: là CSDL protein, được thành lập năm 1986 Nhưng kể từ

năm 1987, SWISS-PROT liên kết với EBI

SWISS-2DPAGE (2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis

database): chứa dữ liệu điện di hai chiều từ protein của người, chuột, E coli…

PROSITE: tích trữ về các họ protein có cùng chức năng

ENZYME (enzyme nomenclature): cung cấp thông tin về danh pháp của

enzyme

SWISS-3DIMAGE: lưu trữ hình ảnh chất lượng cao của các đại phân tử sinh

học đã biết cấu trúc không gian ba chiều

2.3.4 DDBJ (DNA Data Bank Japan) và PDBj (Protein Database Japan)

DDBJ là CSDL về trình tự DNA của Nhật Bản, chính thức đi vào hoạt động năm 1986, đặt tại viện di truyền quốc gia (NIG) Đến năm 2001, trung tâm thông tin về sinh học ở NIG được tổ chức lại với cái tên là CIB (Center Information Biology) kết hợp với DDBJ, viết tắt CIB/DDBJ

PDBj là CSDL của Nhật Bản, tích trữ dữ liệu về cấu trúc, chức năng protein DDBJ của Nhật Bản, EMBL của Châu Âu, NCBI của Hoa Kỳ là ba CSDL về trình tự nucleotide lớn, mang tính chất toàn cầu và ba cơ sở dữ liệu này có sự hợp tác, trao đổi qua lại dữ liệu Từ đó càng làm cho dữ liệu về trình tự nucleotide trở nên phong phú hơn Các tổ chức này đều xây dựng công cụ tìm kiếm trong CSDL của họ Với NCBI là Entrez, EBI là SRS và CIB là getentry Như vậy để có thể khai thác hiệu quả các CSDL này thì việc đầu tiên cần thực hiện là nắm vững các hoạt động của công cụ tìm kiếm “search engines” này

Hình 2.4 Ba cơ sở dữ liệu nucleotide (GenBank – EMB – DDBJ) và công cụ tìm kiếm

2.4.1.2 Bệnh theo tuổi

Theo tổng kết hồi cứu của Viện Nhi TW từ năm 1996 – 1999 ở trẻ từ 1 tháng đến

15 tuổi, 3 căn nguyên gây bệnh chính vẫn là Haemophilus influenzae, Streptococcus

pneumoniae, Neisseria meningitidis (88,7%) với tỷ lệ tử vong tương ứng là 8,7%,

31,2%, 14,3% trong đó Haemophilus influenzae chiếm 56% tổng số và gặp ở trẻ dưới 2 tuổi Ở trẻ sơ sinh thì căn nguyên chính là Klebsiella pneumoniae và Escherichia

coli

Bảng 2.1 Tóm tắt các tác nhân gây bệnh theo lứa tuổi

Tuổi Tác nhân thông thường

0 tuần đến 4 tuần Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus spp

4 tuần đến 12 tuần Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae

3 tháng đến 2 tuổi Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis

3 tuổi đến 15 tuổi Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae

15 tuổi đến 50 tuổi Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae

Trên 50 tuổi Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, trực khuẩn gram âm

2.4.1.3 Các con đường xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh

Một số vi trùng ở trong máu đi vào màng não cũng có thể có nguồn gốc từ viêm nội tâm mạc, viêm phổi, viêm tắc tĩnh mạch hoặc cũng có thể xâm nhập trực tiếp từ các ổ viêm xoang, viêm tai giữa, viêm mũi

Ở các bệnh nhân bị chấn thương sọ não hoặc có vết gãy ở xoang mũi hay bị gãy xương sàng dễ bị viêm màng não Ở những trường hợp này, sự nhiễm trùng thường do các vi khuẩn hiện diện ngoài da của bệnh nhân

Các phẫu thuật ngoại thần kinh cũng có thể gây viêm màng não nhất là các thủ thuật đụng chạm đến dịch não tủy hoặc do các trường hợp viêm cốt tủy ở xương sọ và cột sống

Viêm màng não còn có thể do nhiễm các vi khuẩn từ môi trường bên ngoài như

các bệnh nhân bị phỏng dễ bị nhiễm Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa Trẻ em nằm trong môi trường ẩm ướt dễ bị nhiễm các loại vi khuẩn phát

triển trong không khí ẩm

Trẻ sơ sinh dễ bị nhiễm các loại vi khuẩn có mặt thường xuyên trong âm đạo

hay trực tràng người mẹ (Escherichia coli) hoặc từ đường tiết niệu của người mẹ (Listeria monocytogenes) khi màng ối bị vỡ

2.4.2 Các triệu chứng biểu hiện lâm sàng của bệnh 2.4.2.1 Những triệu chứng giai đoạn khởi phát

Một bệnh sử được khai thác tỉ mỉ có thể thấy bệnh nhân viêm màng não trước đó có nhiễm trùng hô hấp, viêm xoang, viêm tai giữa hay chấn thương sọ não mới hay cũ Ở giai đoạn này, các triệu chứng tập trung ở hội chứng nhiễm trùng, một vài bệnh nhân có đau đầu hay ói mửa

Một vài triệu chứng gợi ý như sốt có tử ban, đốm xuất huyết rải rác trong cơ thể là nghĩ đến não mô cầu…

2.4.2.2 Biểu hiện lâm sàng của viêm màng não mủ

– Hội chứng nhiễm trùng

Sốt cao liên tục ở trẻ em Ngược lại, sốt có thể không điển hình ở người lớn hoặc bệnh nhân cao tuổi Kèm theo sốt là thể trạng suy sụp, mất nước, môi khô, tim đập nhanh Ở trẻ em có thể bức rức, lăn lộn, bỏ ăn

Đau đầu là triệu chứng thường gặp ở tất cả các trường hợp Nôn là triệu chứng xuất hiện muộn hơn đau đầu Nôn vọt nhất thời không liên quan đến bữa ăn

Rối loạn ý thức: ở giai đoạn đầu bệnh nhân rất tỉnh sau đó rơi vào trạng thái tâm lý hoảng sợ, sợ ánh sáng, sợ tiếng động; tiến nhanh đến mất ý thức và hôn mê

Rối loạn cơ vòng: bí tiểu, táo bón là triệu chứng thường gặp trong viêm màng não mủ

– Hội chứng màng não

Đau đầu, ói mửa, sợ ánh sáng, cứng tư thế do phản ứng, bệnh nhân nằm co, cứng gáy, tăng phản xạ gân cơ tứ chi

– Các dấu hiệu thần kinh khác

Co giật, 20 – 30% các trường hợp, xuất hiện sớm ở những ngày đầu Liệt các dây thần kinh sọ (dây III, VI,VIII), phù gai thị

Liệt ½ người mức độ từ nhẹ đến nặng, trong một số ít trường hợp có thể liệt một tay, một chân hay ½ mặt

Rối loạn ý thức và hôn mê Hôn mê có thể xuất hiện sớm, mức độ khác nhau nhưng khi rối loạn ý thức và hôn mê bệnh nhân thường ở giai đoạn nặng

Một số trường hợp với bệnh cảnh của triệu chứng tăng áp lực nội sọ: đau đầu, ói mửa và phù gai thị

Bảng 2.2 Dấu hiệu và triệu chứng của bệnh viêm màng não mủ

Triệu chứng và dấu hiệu Tần số liên quan %

2.4.3 Hậu quả của bệnh trên những đối tượng bị lây nhiễm

Biến chứng nhiễm trùng máu do sự lan tỏa của vi khuẩn theo đường máu Vi khuẩn có thể khu trú lại gây viêm nội tâm mạc hay viêm mủ khớp

Biến chứng thần kinh nặng nề (20%) Ngoài ra còn có rối loạn thị giác, liệt nửa người (15%) Tuy nhiên, các biểu hiện liệt dây thần kinh này có thể biến mất sau khi lành bệnh

Biến chứng co giật: co giật toàn phần hay cục bộ, có thể kèm giãn đồng tử một bên, tăng phản xạ gân xương không đồng đều do phù não, do viêm tắc tĩnh mạch vỏ não

Áp xe não do nhiễm trùng lan tỏa theo đường máu từ các xoang bị viêm

Tràn dịch màng cứng nghi ngờ xảy ra ở những trẻ có vòng đầu lớn nhanh, ói, sốt kéo dài, đạm dịch não tủy tiếp tục tăng cao mặc dù tế bào giảm

Viêm màng não tái phát nhiều lần xảy ra ở những bệnh nhân có khuyết tật cơ thể học (rạn nứt hộp sọ trong những trường hợp tiền căn chấn thương sọ não, rò rỉ dịch não tủy…) do những ổ viêm kế cận tồn tại (viêm xoang, viêm tai…) hoặc do giảm miễn dịch cơ thể

2.4.4 Tình hình bệnh viêm màng não mủ trên thế giới và Việt Nam

– Tình hình nhiễm bệnh trên thế giới

Bệnh viêm màng não nói chung (bao gồm cả viêm màng não mủ) xảy ra ở tất cả các nơi trên thế giới nhưng những trận dịch lớn nhất và thường xuyên lặp lại là ở vùng bán khô cằn của vùng cận sa mạc Sahara, châu Phi Khu vực này còn được biết với tên “The meningitis belt” (tạm dịch là “vành đai bệnh viêm màng não”) trải dài từ Senegal đến Ethiopia gồm 15 nước với dân số ước đoán khoảng 300 triệu người Trận dịch viêm màng não gần đây nhất xảy ra vào giữa thập niên 90 thế kỷ XX với 350 000 ca bệnh và hàng ngàn người chết Năm 1996, hầu hết 190 000 ca bệnh ở Mali, Niger, Nigeria, Burkina và những nước khác đã làm tê liệt hệ thống chăm sóc y tế và làm cạn kiệt nguồn dự trữ vaccine thế giới

Theo thống kê của Tổ chức Y Tế thế giới (WHO), hằng năm số người mắc bệnh viêm màng não mủ (không kể những đại dịch) là 1,2 triệu ca Năm 1999, trên toàn thế giới có 88006 trường hợp viêm màng não mủ được ghi nhận, trong đó có 6593 trường hợp tử vong Trong số này, các nước châu Phi cũng chiếm một số lượng đáng kể,

52953 trường hợp, 4129 trường hợp tử vong Và nếu tính từ ngày 1/1 đến 16/4/2000, trong một khoảng thời gian ngắn đã có hàng chục ngàn trường hợp nhiễm bệnh viêm màng não mủ được ghi nhận, trong đó châu Phi có 18091 trường hợp, 1897 trường hợp tử vong

Đối với bệnh viêm màng não mủ, người ta có thể thống kê được một bức tranh toàn diện về dịch tễ của bệnh này Tuy nhiên, theo các số liệu thống kê chính thức tại Mỹ, tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não mủ là 3-5/100 000 dân và hơn 2000 trường hợp tử vong trong một năm

Nếu chỉ tính riêng ở trẻ sơ sinh, theo điều tra của Thụy Điển, tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não mủ là 2,8/100 000 trẻ mới sinh

Tại các quốc gia đang phát triển, bệnh có khuynh hướng trầm trọng hơn Tại Brazil, trong giai đoạn 1973 – 1982, tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não mủ là 45,8/100 000 dân và tử vong là 33% Tại Gioudanni, tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não mủ là 1,1/1000 trẻ mới sinh

– Tình hình viêm màng não mủ ở Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh viêm màng não mủ tuy không bùng phát thành dịch nhưng vẫn xảy ra liên tục ở các khoảng thời gian khác nhau trong năm

Theo thống kê của Trung tâm Y Tế Dự Phòng thành phố Hồ Chí Minh cho biết:

Số ca bệnh 217 177 301 458

Trong đó chỉ có 8 ca tử vong từ năm 1997 đến năm 2000 (chiếm tỉ lệ 0,69%)

Các số liệu thống kê trên cho thấy bệnh viêm màng não mủ đang có chiều hướng gia tăng Tỷ lệ tử vong của những trường hợp viêm màng não mủ thấp nhưng di chứng của bệnh để lại rất nặng nề Do đó, việc chẩn đoán nhanh và chính xác để điều trị bệnh một cách nhanh chóng là vô cùng cần thiết

2.5 VI KHUẨN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ

Có ít nhất 15 loại vi khuẩn có thể là căn nguyên gây bệnh Được thường

xuyên ghi nhận là Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus

pneumoniae cả 3 loại này chiếm tỷ lệ là 80% các trường hợp viêm màng não mủ Tuy

nhiên, mức độ mắc phải từng loại vi khuẩn tuỳ thuộc vào lứa tuổi, giới tính và yếu tố

thuận lợi cũng như tuỳ thuộc vào khu vực địa lý Ngoài ra, điều kiện khí hậu, vệ sinh, mùa… cũng ảnh hưởng đến tần số mắc bệnh của các căn nguyên

– Neisseria meningitidis (não mô cầu)

Viêm màng não mủ do não mô cầu chiếm 14 – 20% tổng số bệnh nhân với tỷ lệ

tử vong là 10 – 13% N meningitidis là căn nguyên phổ biến ở trẻ em và thanh niên

Căn nguyên này gồm nhiều nhóm, tất cả các nhóm đều có khả năng gây dịch Tuy nhiên nhóm B thường gây dịch lẻ tẻ, nhóm A và C thường gây các vụ dịch lớn Nhóm Y có thể có viêm phổi kết hợp Yếu tố nguy cơ là bệnh nhân suy giảm phần cuối của bổ thể (C5, C6, C7, C9)

– Streptococcus pneumoniae (phế cầu)

Viêm màng não mủ do phế cầu chiếm 13 – 17% tổng số bệnh nhân với tỷ lệ tử vong là 19 – 26% Phế cầu là căn nguyên chính ở người trưởng thành và là một trong ba căn nguyên chính ở trẻ em

– Listeria monocytogenes

Viêm màng não mủ do Listeria chiếm khoảng 2% các trường hợp viêm màng

não mủ với tỷ lệ tử vong là 22 – 29% 90% các trường hợp viêm màng não mủ do

Listeria là do các type Ia, Ib, VIb gây nên Nhiễm Listeria monocytogenes hay gặp ở

trẻ sơ sinh, trẻ bị ung thư, giảm miễn dịch, tiểu đường, bệnh gan, thận Phụ nữ mang

thai có thể mang Listeria monocytogenes ở bộ phận sinh dục, trực tràng mà không có

triệu chứng và truyền vi khuẩn cho con

– Streptococcus agalactiae (liên cầu khuẩn)

Viêm màng não mủ do liên cầu khuẩn chiếm 3 – 6% tổng số bệnh nhân viêm màng não mủ với tỷ lệ tử vong là 12 – 27% Liên cầu khuẩn nhóm B là nguyên nhân phổ biến ở trẻ sơ sinh Khoảng 15 – 40% phụ nữ có thai có liên cầu khuẩn nhóm B trong trực tràng và âm đạo nhưng không có triệu chứng Nguy cơ truyền bệnh từ mẹ sang con tăng cao lên khi mẹ mắc bệnh Bệnh có thể truyền từ tay nữ hộ sinh đến đứa

trẻ Hầu hết các ca nhiễm khuẩn S agalactiae gây ra bởi type III và xuất hiện ngay sau

tuần đầu

– Trực khuẩn Gram âm hiếu khí

Các loài vi khuẩn này (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa…) đang trở thành căn nguyên quan trọng với tỷ lệ tử vong tương đối cao

Bệnh hay gặp sau chấn thương đầu, phẫu thuật thần kinh, trẻ sơ sinh, bệnh nhân có vấn đề về miễn dịch và nhiễm khuẩn huyết Gram âm

– Những vi khuẩn khác

Các điều kiện thuận lợi cho viêm màng não mủ do Nocardia spp như dùng

thuốc miễn dịch, u ác tính, chấn thương đầu và hệ thần kinh trung ương, mụn mủ viêm mãn tính, bệnh sarcom Viêm màng não mủ do vi khuẩn kỵ khí thường có điều kiện như: viêm tai, viêm xoang, viêm họng, áp xe não, nhiễm khuẩn vết thương sau chấn thương và sau phẩu thuật thần kinh

2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 2.6.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng

Người bị viêm màng não mủ thường có những biểu hiện như sốt cao, nôn mửa, đau đầu dữ dội, cứng cổ, sợ ánh sáng, mất ý thức…

2.6.2 Phương pháp xét nghiệm vi khuẩn học

Dịch não tủy được đem ly tâm lấy phần cặn lắng để nhuộm gram tìm vi khuẩn Có thể soi nhìn thấy được vi khuẩn hay không tùy thuộc vào số lượng vi khuẩn bị nhiễm Nếu số lượng này lên đến 105/ml thì có thể soi (+) trong 97% các trường hợp Tỷ lệ nhuộm (+) cũng tùy thuộc vào loại vi khuẩn

Dịch não tủy được đem cấy vào môi trường thạch máu hay thạch sô-cô-la Cấy dịch não tủy có thể dương tính trong 70 – 80% các trường hợp viêm màng não mủ

2.6.3 Phương pháp miễn dịch học

Phương pháp điện di miễn dịch ngược chiều (Counter Immuno Electrophoresis)

xác định được viêm màng não do H influenzae, S pneumoniae, N meningitidis A, B,

C, Y và W 135 trong vòng vài giờ

Phản ứng ngưng kết với latex nhạy hơn phương pháp CIE, cho kết quả trong 4

giờ, giúp phát hiện kháng nguyên polysaccharide trong H influenzae type b, S

pneumoniae, N meningitidis và Streptococcus nhóm B

2.6.4 Phương pháp tế bào học

Tế bào dịch não tủy phải được khảo sát ngay, vì sau 90 phút, các bạch cầu của dịch não tủy sẽ bắt đầu thoái hóa Trong trường hợp bệnh viêm màng não mủ, lượng tế bào có thể từ 100 – 1000/mm3, trong đó bạch cầu đa nhân trung tính chiếm đa số (trên 80%) Trong những trường hợp viêm màng não mủ đang điều trị dở dang, số lượng các tế bào đơn nhân có thể cao hơn đa nhân

Công thức Dejong

Nếu bạch cầu đếm được trong dịch não tủy lớn hơn số lượng trên chính là số lượng bạch cầu viêm Nếu bạch cầu viêm trên 10/mm3 cho phép kết luận có sự tăng bạch cầu dịch não tủy, nghĩa là có hiện tượng viêm

2.6.5 Phương pháp sinh hoá

2.6.5.1 Đường trong dịch não tủy

Trong viêm màng não mủ, lượng đường ở dịch não tủy thường thấp hơn đường huyết 50 – 60% Một số ít trường hợp đường dưới 10 mg% Đường trong dịch não tủy thấp có giá trị phân biệt viêm màng não mủ với các viêm màng não siêu vi hay các nhiễm trùng cạnh màng não

2.6.5.2 Đạm trong dịch não tủy

Đạm trong dịch não tủy tăng cao, khoảng 100 mg% Nếu đạm trong dịch não tủy tăng lên trên 1000 mg% phải nghĩ đến tắc nghẽn khoang dưới nhện thứ phát Ngoài ra, khi dịch não tủy bị chạm thương, nồng độ đạm có thể gia tăng hơn: cứ 1000 hồng cầu sẽ tăng 0,1 mg/ml

Bạch cầu dịch não tủy = (Hồng cầu dịch não tủy x bạch cầu máu)/ Hồng cầu máu

2.6.5.3 Phương pháp khảo sát nồng độ lactate

Lactate là chất được sản sinh từ quá trình chuyển hóa kỵ khí của glucose Nó là một yếu tố quan trọng giúp chẩn đoán bệnh Trị số lactate dịch não tủy tăng cao trên 4 mmol/l trong viêm màng não mủ Độ nhạy cảm của thông số này khá cao so với các thông số khác như đạm, đường Trị số này sẽ giảm trong quá trình đáp ứng với điều trị

2.6.6 Phương pháp chụp cắt lớp – CT (Computer Tomography)

Phương pháp chụp cắt lớp điện toán – CT sọ não không có ích cho chẩn đoán nhưng có thể chỉ định cho bệnh nhân cứ sốt dai dẳng, có biểu hiện tăng áp lực nội sọ, liệt khu trú, co giật, vòng đầu to, rối loạn thần kinh kéo dài, hoặc kết quả cấy và các thông số của dịch não tủy bất thường kéo dài để xác định biến chứng Ở trẻ có sốt và nghi ngờ có tràn dịch dưới màng cứng nên chụp CT để phát hiện và dẫn lưu Đặc biệt ở bệnh nhân viêm màng não mủ do vỡ nền sọ có thoát dịch não tủy, chụp CT có thể phát hiện mức độ khí – dịch, độ mờ của xoang mũi hoặc khí nội sọ CT cắt dọc có thể định vị được vị trí vỡ xương Chụp CT có thể sử dụng chất cản quang tạo độ tương phản rõ giữa dịch – chất hòa tan là cách tốt nhất để xác định vị trí thoát dịch

2.6.7 Phương pháp xét nghiệm dựa vào kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR là một phương pháp mới để xét nghiệm bệnh viêm màng não mủ Phương pháp này có nhiều ưu điểm như độ nhạy, độ chính xác cao, cho phép phát hiện trực tiếp và chính xác vi khuẩn gây bệnh trong thời gian ngắn, kĩ thuật thao tác đơn giản và nhanh chóng trên một lượng dịch não tủy ban đầu ít Mặt hạn chế của phương pháp này là sự ngoại nhiễm cao

2.7 KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ

2.7.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Sau đó DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa trên các đặc tính đó của DNA polymerase Vậy nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự, ta sẽ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi

Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm có: DNA bản mẫu, mồi xuôi và mồi ngược, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP,dTTP), dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2, Taq polymerase

2.7.2 Quy trình của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước và mỗi chu kỳ sẽ tăng gấp đôi số lượng mẫu lần trước (nhân bản theo cấp số nhân)

Bước 1: Giai đoạn biến tính

Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường ở 90o

C – 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút

Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (lai)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC tuỳ thuộc Tm các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Bước 3: Giai đoạn kéo dài

Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất (DNA polymerase sử dụng là DNA polymerase chịu nhiệt) Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần nhân bản

Hình 2.6 Quy trình phản ứng PCR

2.7.3 Seminested PCR/ multiplex PCR 2.7.3.1 Seminested PCR

Đây là một trong những kỹ thuật phát triển sau này dựa vào nền tảng kỹ thuật PCR Kỹ thuật này gồm hai bước:

Bước 1: là sự nhân bản một trình tự DNA

Bước 2: là sự nhân bản các bản mẫu là các đoạn DNA vừa được nhân bản Đoạn DNA được nhân bản trong bước 2 nằm trong đoạn DNA được nhân bản trong bước 1 Một trong hai mồi sử dụng ở bước 1 sẽ được sử dụng lại trong bước 2 để cùng mồi mới tạo thành một cặp mồi Sau bước đầu tiên, các đoạn DNA chứa đoạn DNA cần nhân bản ở bước 2 đã được nhân lên rất nhiều so với lượng DNA ban đầu Do đó, ở bước 2, lượng bản mẫu sẽ nhiều hơn lượng DNA không mong muốn nên sự nhân bản các đoạn DNA mong muốn sẽ diễn ra dễ dàng hơn, dẫn đến sự nhân bản đặc hiệu hơn

2.7.3.2 Multiplex PCR

Multiplex PCR là một kỹ thuật dùng nhiều cặp mồi khác nhau trong cùng một phản ứng PCR để nhân bản đồng thời nhiều đoạn trình tự Số lượng các sản phẩm PCR khác nhau được nhân bản trong cùng một phản ứng PCR có thể từ 2 sản phẩm đến tối đa 15 sản phẩm, điều này có nghĩa là có thể dùng đến 15 cặp mồi trong cùng một phản ứng Kỹ thuật này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và từ đó đã được áp dụng thành công trong nhiều công trình nghiên cứu về các biến đổi di truyền ở người cũng như nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác

Kỹ thuật multiplex PCR thường dùng để kết hợp với kỹ thuật nested PCR hay seminested PCR nhằm thu được kết quả với độ chính xác và độ đặc hiệu cao

2.7.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ

Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có những vùng bảo tồn

cao ở cấp độ nhóm, xen kẽ với các vùng biến động khác nhau giữa các loài trong nhóm Do đó, những trình tự này rất phù hợp với mục đích thiết kế mồi nhằm phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn và các kỹ thuật chẩn đoán dựa vào kỹ thuật PCR ngày càng được phát triển với mục đích tăng độ nhạy của phản ứng

Năm 1994, Radstrom và các cộng sự đã đề ra phương án sử dụng cặp mồi u3 và

ru8 để nhân bản vùng trình tự bảo tồn trên gene 16S rRNA trong bước đầu và sử dụng

mồi ru8 với các mồi đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn để nhân bản vùng trình tự đặc biệt của mỗi loài trong bước 2 Kỹ thuật tiếp tục được nhóm nghiên cứu phát triển (năm 1998) để phát hiện đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ trong

dịch não tủy như Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus

agalactiae, Streptococcus pneumoniae và Listeria monocytogenes

Cũng vào năm 1994, Greisen và các cộng sự công bố công trình nghiên cứu

những mồi và mẫu dò cho gene 16S rRNA của hầu hết các loài vi khuẩn gây bệnh, bao

gồm vi khuẩn tìm thấy trong dịch não tủy Đầu tiên là sự nhân bản vùng trình tự bảo

tồn trên gene 16S rRNA bằng phương pháp PCR Sau đó sử dụng các mẫu dò đặc hiệu

để phát hiện DNA các loài vi khuẩn

Tương tự các công trình nghiên cứu trước, Jang – Jih Lu và các cộng sự vào năm

2000 cũng đã thiết lập một cặp mồi chung trên gene 16S rRNA cho các loài vi khuẩn

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis để thiết lập phản ứng PCR nhân bản đoạn có kích

thước 996 bp Ở bước 2 tác giả sử dụng enzyme cắt giới hạn phân cắt đoạn trình tự lớn 996 bp Các sản phẩm PCR sau khi đã xử lý bằng enzyme sẽ được điện di trên gel polyacrylamide 6% và so sánh với thang chuẩn để xác định sự hiện diện của vi khuẩn trong dịch não tủy

Qua một số công trình nghiên cứu trên, chúng tôi thấy hầu hết việc phát hiện vi khuẩn gây viêm màng não mủ đều trải qua bước cơ bản là nhân bản 1 trình tự bảo tồn Do đó, trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi tiến hành thu thập các trình tự gene

16S và 23S rRNA bảo tồn trên các loài vi khuẩn và lưu trữ trong CSDL Từ các trình tự

này chúng tôi sử dụng phần mềm Primrose để thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ

2.8 GENE 16S rRNA VÀ 23S rRNA

2.8.1 RNA ribosome (rRNA) – Cấu trúc ribosome

Sự tổng hợp các chuỗi polypeptide trong tất cả các hệ thống sống được thực hiện tại các ribosome Ribosome của vi khuẩn có khối lượng khoảng chừng 2,5 triệu dalton, có hệ số lắng là 70S, trong đó protein chiếm 1/3 khối lượng và phần còn lại là các rRNA

Tất cả các ribosome được hình thành từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein có kích thước không bằng nhau Ở vi khuẩn, những tiểu đơn vị này có hệ số lắng là 50S và

30S Ribosome ở E coli cũng như ở các loài vi khuẩn khác chứa 3 loại rRNA: 16S

rRNA, 23S rRNA và 5S rRNA

16S rRNA ở E coli có chiều dài khoảng 1542 ribonucleotide là một thành phần

cấu thành tiểu đơn vị nhỏ của ribosome Tiểu đơn vị lớn của ribosome thì chứa hai loại

rRNA là 23S và 5S (ở E coli có chiều dài lần lượt là 2904 và 120 ribonucleotide)

Người ta cho rằng rRNA đóng vai trò rất quan trọng trong cấu trúc của ribosome, giúp cho việc gắn kết của các protein ribosome và góp phần quyết định hình dạng của ribosome

Thành phần cấu tạo của ribosome điển hình (ở vi khuẩn E coli) bao gồm 55 phân

tử protein có khối lượng khoảng 900 000 dalton, trong số này có 4 phân tử protein cùng loại, các phân tử còn lại là khác nhau Tiểu đơn vị nhỏ của ribosome bao gồm 21 protein kết hợp với 16S rRNA, tiểu đơn vị lớn bao gồm 34 protein kết hợp với 23S rRNA và 5S rRNA

Hình 2.7 Thành phần cấu tạo của ribosome ở prokaryote

Cho đến nay, chưa có một kết luận hợp lý nào về sự xuất hiện một lượng lớn rRNA trong ribosome Tuy nhiên, mọi người đều tin rằng các ribonucleotide không bắt cặp trong cấu trúc bậc 2 của rRNA có liên quan đến sự gắn kết của các RNA khác lên ribosome Chẳng hạn một vài ribonucleotide ở gần đầu 3‟ của 16S rRNA là điểm bắt cặp với các nucleotide (trình tự Shine – Dalgarno) trên phân tử RNA thông tin (mRNA) để ribosome có thể gắn vào RNA thông tin và tiến hành tổng hợp chuỗi polypeptide Tương tự, một vài trình tự rRNA của ribosome cũng tương tác với các trình tự của RNA vận chuyển (tRNA) khác nhau trong quá trình tổng hợp protein

2.8.2 Gene 16S rRNA thước đo tiến hóa

Từ năm 1967, Zuckerkand và Pauling đã đưa ra ý kiến cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hoá” hay “thước đo tiến hoá” Để là một thước đo tiến hóa, phân tử được chọn phải có các đặc điểm sau

- Phân tử phải có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát - Phân tử không được truyền qua lại giữa các loài

- Trình tự của phân tử này phải có độ bảo tồn và biến động thích hợp trong khoảng cách tiến hóa khảo sát

- Phân tử phải có kích thước đủ lớn để chứa nhiều thông tin Mặc dù các tRNA có mặt ở hầu hết các vi sinh vật nhưng chúng không được chọn làm thước đo tiến hóa do có kích thước quá nhỏ (75 ribonucleotide)

Một thập kỷ sau, vào năm 1977, Woese và các cộng sự đã xác định 16S rRNA là phân tử rất thích hợp làm thước đo tiến hóa 16S rRNA là phân tử cổ, là thành phần của bộ máy tổng hợp protein có từ lâu đời Hơn nữa, các rRNA là những phân tử có chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải cho phép phản ảnh sự liên quan tiến hóa giữa các loài sinh vật

Ba loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể được chọn làm thước đo tiến hóa Tuy nhiên, 5S rRNA có kích thước quá nhỏ (khoảng 120 ribonucleotide), mang ít thông tin của quá trình tiến hóa nên ít được chọn 23S rRNA là phân tử lớn (có khoảng 2900 ribonucleotide), có đầy đủ các tính chất để có thể làm thước đo tiến hóa Tuy nhiên, kích thước của 23S rRNA lớn nên thao tác nghiên cứu trên phân tử này không thuận lợi lắm Phân tử 16S rRNA có kích thước vừa phải, khoảng 1500 ribonucleotide, thuận lợi cho các thao tác nghiên cứu nên hiện nay, phân tử này được coi như là “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học Tuy nhiên, do RNA đòi hỏi phải rất cẩn trọng trong thao tác do dễ bị phân hủy nên khuynh hướng

hiện nay là sử dụng gene mã hóa cho RNA – gọi là gene 16S rRNA – trong các nghiên cứu Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có một điểm rất đặc biệt

là có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau giữa các loài trong cùng nhóm này Tuy là những vùng biến động, nhưng những vùng này lại là những vùng bảo tồn ở cấp độ loài Sự bảo tồn và biến động ở các cấp

độ khác nhau đã giúp cho gene 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên của các nhà

nghiên cứu khi tiến hành định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa

hai hay nhiều loài vi khuẩn Cho đến nay, số lượng các gene 16S rRNA đã được giải

trình tự lên đến hơn 10 000 Điều này cho thấy có sự quan tâm rất lớn của các nhà khoa học đến đối tượng này