Đề tài “Nghiên cứu thiết kế và cố định ADN đầu dò ứng dụng trong cảm biến ADN định hướng phát hiện vi khuẩn streptococcus suis gây bệnh viêm màng não”. Luận văn gồm các nội dung chính như sau: Thiết kế ADN đầu dò đặc trưng cho vi khuẩn S.suis, chế tạo thẻ sử dụng một lần mang ADN đầu dò đặc trưng cho vi khuẩn S.suis, đánh giá quá trình lai ADN đích với ADN đầu dò trên thẻ, đánh dấu ADN đích bằng hạt từ để phát hiện trên cảm biến từ.
1 GIỚI THIỆU Với xu phát triển tìm vật liệu mới, kỹ thuật kế thừa phát triển phương pháp truyền thống kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm cách nhanh chóng, xác độ nhạy cao vấn đề thiết đáng quan tâm Một xu hướng nghiên cứu phát triển gần cảm biến sinh học phân tích y sinh chế tạo phát triển thẻ sử dụng lần, cố định đầu dò sinh học sử dụng cảm biến làm phận phát Ở cảm biến truyền thống, đầu dò ADN cố định trực tiếp bề mặt cảm biến mẫu cần phân tích xử lý bề mặt cảm biến, chất lượng bề mặt cảm biến bị sau lần sử dụng khó tái sử dụng lại nên giá thành cho mẫu phân tích cao So với cảm biến truyền thống hệ thống phân tích y sinh với thẻ dùng lần có nhiều ưu điểm Trước hết, trình xử lý đánh dấu mẫu thực thẻ, sau thẻ đưa vào cảm biến để phát hiện, khơng làm ảnh hưởng đến chất lượng cảm biến sau lần sử dụng Nhờ vậy, cảm biến sử dụng để phát nhiều mẫu, cần thay thẻ cho mẫu phân tích Một ưu điểm khác việc sử dụng thẻ dùng lần phát loại mẫu phân tích khác cảm biến cần sử dụng thẻ khác với loại đầu dò khác đặc hiệu loại mẫu cần phân tích Bên cạnh đó, việc chế tạo thẻ dùng lần thường không phức tạp, tốn quan trọng chúng phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp đại Streptococcus suis (S.suis) liên cầu khuẩn gây bệnh lợn, gọi tắt liên cầu lợn, tác nhân gây bệnh nghiêm trọng lợn xảy nhiều nơi giới gây tổn thất lớn kinh tế Năm 1960 phát ca nhiễm bệnh người sau số lượng bệnh nhân nhiễm ngày gia tăng Biểu lâm sàng bệnh là: viêm màng não (biểu chủ yếu), xuất huyết, viêm phổi, viêm tim viêm khớp; người bệnh nặng tử vong Theo Hướng dẫn Giám sát phòng, chống bệnh liên cầu lợn người Bộ Y Tế ngày tháng 11 năm 2014, tỉ lệ tử vong từ 5% tới 20% Cũng theo báo cáo Cục Y tế dự phòng, năm 2016 vừa qua bệnh liên cầu lợn giảm 19.4% từ 514,299 trường hợp năm 2015 xuống 414,587 trường hợp Tử vong bệnh giảm tới 58% từ 17 trường hợp năm 2015 xuống trường hợp năm 2016 Bệnh có thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài đến ngày dẫn đến tử vong vòng – ngày sau biểu bệnh Hiện nay, chưa có vắc xin phòng bệnh nhiều phòng xét nghiệm nước áp dụng kỹ thuật: phân lập liên cầu (định danh qua nuôi cấy thạch máu cừu ngựa), phản ứng PCR, định danh hệ thống test Rapid Strep số phương pháp khác kháng thể huỳnh quanh hay ELISA Mỗi loại kỹ thuật xét nghiệm có đặc thù mạnh riêng hạn chế chung chúng vấn đề giá thành cao, bước thực phức tạp thời gian lâu để thu kết Trong hồn cảnh đó, việc kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) kỹ thuật vật lý, hóa học khác vật liệu nano (hạt nano từ) với ứng dụng cảm biến ADN dựa chuyển đổi từ cho hướng nghiên cứu cho việc xây dựng cảm biến phát liên cầu khuẩn S.suis gây bệnh Theo định hướng nghiên cứu gắn với xu phát triển trên, thực luận văn với đề tài “Nghiên cứu thiết kế cố định ADN đầu dò ứng dụng cảm biến ADN định hướng phát vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh viêm màng não” Luận văn gồm nội dung sau: Thiết kế ADN đầu dò đặc trưng cho vi khuẩn S.suis Chế tạo thẻ sử dụng lần mang ADN đầu dò đặc trưng cho vi khuẩn S.suis Đánh giá q trình lai ADN đích với ADN đầu dò thẻ Đánh dấu ADN đích hạt từ để phát cảm biến từ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Cảm biến sinh học xu 1.1.1 Tổng quan cảm biến sinh học Cảm biến sinh học (biosensor viết tắt biological sensor) loại thiết bị phân tích bao gồm phần cảm nhận sinh học kết hợp với chuyển đổi tín hiệu chuyển tín hiệu sinh học thành tín hiệu điện, nhiệt quang Theo IUPAC (International Union of Pure ADN Applied Chemistry) “Cảm biến sinh học (biosensor) thiết bị tích hợp có khả cung cấp thơng tin phân tích định lượng bán định lượng đặc trưng, bao gồm phân tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với phần tử chuyển đổi” 1.1.2 Cảm biến ADN Cảm biến ADN cảm biến sinh học sử dụng đầu thu sinh học đoạn ADN Trong cảm biến sinh học ADN, đoạn ADN ngắn đặc hiệu cho gen lồi sinh vật cố định trực tiếp lên bề mặt đế cảm biến, gọi đầu dò (probe) Đoạn đầu dò dùng để bắt cặp/lai với đoạn ADN bổ sung (có trình tự nucleotide bổ sung với đầu dò) Đoạn ADN bổ sung gọi ADN đích ADN đích trình tự ADN đặc hiệu gen đặc trưng cho loài sinh vật mong muốn phát Q trình lựa chọn đầu dò oligonucleotide cho cảm biến ADN thực sử dụng trình tự gen biết, với điều kiện ý sau Chiều dài đầu dò thường dao động khoảng 18 – 50 nucleotide, kích thước dài khiến thời gian lai lâu hiệu suất tổng hợp thấp, kích thước ngắn làm giảm độ đặc hiệu đầu dò Thành phần G – C nên từ 40 – 60%, nguy lai không đặc hiệu tăng tỉ lệ G – C nằm khoảng Tránh có mặt vùng bổ sung bên mẫu dò chúng tạo cấu trúc “kẹp tóc” (hair-pin) ngăn cản q trình lai (hình 1.5) Tránh trình tự chứa đoạn nucleotide đơn liên tiếp (ví dụ AAAA) Một trình tự đạt yêu cầu trên, cần thiết phân tích trình tự máy tính Nên so sánh trình tự đầu dò với vùng trình tự nguồn hay hệ gen nguồn so sánh với trình tự bổ sung trình tự nguồn 1.1.3 Cảm biến ADN dựa chuyển đổi quang Cảm biến dựa chuyển đổi quang loại phổ biến cho cảm biến nói chung cảm biến ADN nói riêng, với ưu điểm độ xác cao, độ nhạy cao … Trong suốt thập kỷ vừa qua việc nghiên cứu công nghệ cho cảm biến dựa chuyển đổi quang phát triển cách vượt trội Cảm biến hoạt động dựa tính chất vật lý ánh sáng để định lượng chất cần phân tích Cảm biến ADN dựa chuyển đổi quang chia làm hai loại: đánh dấu không đánh dấu 1.1.4 Cảm biến ADN dựa chuyển đổi điện hóa Cách phát ADN sử dụng cảm biến ADN với chuyển đổi điện hóa tiến hành theo phương pháp đánh dấu đoạn ADN đích Chia làm hai loại cảm biến ADN sử dụng chất thị oxi hóa – khử (redox indicator) cảm biến ADN sử dụng hạt nano Phương pháp sử dụng chất thị oxi hóa – khử nhận biết bắt cặp ADN dựa vào khử chất thị oxi hóa – khử (chất hữu cơ) gắn vào đoạn ADN đích ADN đầu dò Khi có kết cặp ADN đầu dò ADN đích hình thành đoạn xoắn kép, dẫn đến nồng độ chất thị tăng bề mặt cảm biến làm thay đổi tín hiệu điện hóa q trình 1.1.5 Cảm biển ADN dựa chuyển đổi từ Nguyên tắc hoạt động phương pháp cảm biến ADN dựa chuyển đổi từ thông qua việc phát từ trường sinh từ hạt siêu thuận từ bị từ hóa Các hạt từ chức hóa đơn lớp streptavidin thường sử dụng để đánh dấu ADN đích có gắn biotin nhờ liên kết đặc hiệu streptavin với biotin Hơn nữa, chúng tích hợp chức chíp, độ nhạy cao phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp đại 1.1.6 Cảm biến sử dụng lần Cảm biến đo đường huyết cá nhân ví dụ điển hình cho cảm biến sử dụng lần Cảm biến đo đường huyết cá nhân phân thành hai loại dựa theo phương pháp thực gồm phương pháp đo trực tiếp (thông qua việc lấy mẫu Hệ thống sử dụng chip lần Biacore công cụ hữu ích cho việc nghiên cứu phân tích mối quan hệ chất protein, nucleic acids, carbohydrates, lipids…Hệ thống giúp phân tích thơng tin quan trọng thông qua liên kết chất 1.2 Các phương pháp cố định đầu dò ADN Kỹ thuật cố định ADN đầu dò lên bề mặt cảm biến sinh học có ảnh hưởng lớn đến độ nhạy, độ xác, độ ổn định cảm biến Quá trình cố định đoạn ADN cần thỏa mãn yêu cầu như: không ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử ADN, khơng làm biến đổi ảnh hưởng đến tính chất lớp màng bề mặt, liên kết tạo bền điều kiện sinh lý 1.2.1 Phương pháp vật lý Phương pháp vật lý hay gọi phương pháp hấp phụ ADN lên bề mặt màng chức hóa Bản chất liên kết liên kết tĩnh điện Tuy nhiên liên kết tĩnh điện lại phụ thuộc chủ yếu vào độ pH nồng độ muối dung dịch, nên thay đổi dung dịch đệm với độ pH nồng độ muối cao hơn, tương tác ADN màng chức bị suy yếu kết ADN bị tách khỏi màng chức 1.2.2 Phương pháp hóa học Phương pháp hóa học phương pháp sử dụng phản ứng hóa học để liên kết phân tử ADN với đế chức hóa thơng qua liên kết cộng hóa trị Các liên kết hóa học thường bền, không phụ thuộc vào nồng độ muối phụ thuộc vào pH mơi trường Do đó, ADN cố định tạo phương pháp hóa học bền dung dịch đệm khác với nồng độ muối cao giá trị pH thay đổi Có hai bước tiến hành phương pháp hóa học: 1) Chức hóa bề mặt đế 2) Cố định đầu thu sinh học 1.2.3 Phương pháp sinh học Trong sinh học liên kết protein streptavidin phân tử hữu biotin liên kết khơng cộng hóa trị bền Phức hợp Streptavidin–Biotin tạo thành bền kể dung môi hữu cơ, chất hoạt động bề mặt, nhiệt độ cao pH khắc nghiệt Chính vậy, người ta sử dụng liên kết đặc hiệu streptavidin biotin để làm cầu nối ADN với bề mặt đế cảm biến Đế thường chức hóa streptavidin, phân tử biotin gắn vào ADN phản ứng hóa học Vì liên kết streptavidin–biotin có độ bền cao nên ADN cố định tạo thành bền điều kiện sinh lý Nhược điểm phương pháp giá thành cao phải sử dụng Streptavidin gắn Biotin vào ADN cần cố định 1.3 Giới thiệu vi khuẩn Streptococcus suis Streptococcus suis vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, kích thước khoảng 1µm, khơng có lơng, không sinh nha bào Streptococcus suis (S.suis) liên cầu khuẩn gây bệnh lợn, gọi tắt liên cầu lợn, tác nhân gây bệnh nghiêm trọng lợn người xảy nhiều nơi giới gây tổn thất lớn kinh tế Trong bệnh phẩm, chúng thường xếp thành chuỗi Năm 1995, dựa vào cấu trúc vỏ nhà khoa học nghiên cứu S.suis có tổng cộng 35 typ huyết (từ typ đến typ 34 typ 1/2 ) Mặc dù vậy, chủng gây bệnh cho người đáng ý typ 1, 2, 14 Typ gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng lợn kiểu huyết phổ biến ảnh hưởng đến người rộng rãi tồn giới, có trường hợp gây bệnh người typ typ 14 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 2.1.1 Vật liệu Đế silic; hạt từ Streptavidin (DynabeacdsMyOneTM Streptavidin C1 – Invitrogen); ADN đầu dò SPA, ADN đích, ADN đối chứng, cặp mồi SF2-SRB, cặp mồi SF-SR (Integrated DNA Technology); thang ADN 50 bp 100 bp hãng ThermoFisherTM; thiết bị cảm biến từ điện trở dị hướng (cảm biến AMR) chế tạo Lê Khắc Quynh đồng tác giả PTN trọng điểm micro – nano (Đại học Quốc Gia Hà Nội) 2.1.2 Hóa chất dung dịch Bảng 2.2 Các hóa chất STT Tên hóa chất Nhà cung cấp 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) (EDC) carbodiimide Sigma (Mỹ) 2–(N–morpholino) ethanesulfonic acid (MES) Biobasic (Canada) Acetic acid Biobasic (Canada) Acrylamide 30% Sigma (Mỹ) APTES Sigma (Mỹ) Axeton XILONG (Trung Quốc) Ethanol VWR International (Mỹ) NaCl Biobasic (Canada) NaH2PO4 Biobasic (Canada) 10 Na2HPO4 Biobasic (Canada) 11 NaOH Sigma (Mỹ) 12 Master mix Qiagen (Đức) 13 PolyDiMethylSiloxane (PDMS) Dow Corning (Mỹ) 14 Succinic Acid Anhydride (SAA) Sigma (Mỹ) 15 SDS 10% Sigma (Mỹ) 16 Thang ADN GeneRuler 50 bp (SM371) Thermo Scientific (Mỹ) 17 Toluen XILONG (Trung Quốc) Bảng 2.3 Các dung dịch Tên dung dịch Thành phần Đệm cố định MES 25 mM; NaCl 125 mM; pH 5.5 (MES 100mM) Đệm chạy điện di 2x 0.025 M Tris HCl; 0.1% SDS; 0.192 M Glycine; pH 8.3 Đệm B&W 2x 1mM EDTA, 2M NaCl, 10mM Tris – HCl, H2O; pH 7.5 Đệm lai 1x 2X SSC; 0.1% v/v SDS; pH Đệm SSC 20x 3M NaCl; 300 mM Na3Citrate.2H2O; pH Đệm tra mẫu 6x 0.125 M Tris HCl; 4% SDS; 20% v/v Glycerol; 0.2 M DDT; 0.02 M Bromophenol Blue; pH 6.8 PBS NaH2PO4 mM, Na2HPO4 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4 TBE 5X 1.1 M Tris; 900 mM Borate; 25 mM EDTA; pH=8.3 2.1.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm Bảng 2.4 Các thiết bị, dụng cụ STT Tên thiết bị, dụng cụ Nhà cung cấp Bản soi gel hồng ngoại Bio-Rad (Mỹ) Bếp nung/Hot plate Bộ diện di protein Bio – Rad (Mỹ) Các loại Eppendorf Eppendorf (Đức) Các loại Falcon Eppendorf (Đức) Các loại Pipetman Bio – Rad (Mỹ) Cân phân tích GR–200, AND (Nhật Bản) Đĩa petri Việt Nam Máy ảnh 10 Máy hút chân không Labogene (Đan Mạch) 11 Máy lắc tròn Water Pro RO (Mỹ) 12 Máy lọc nước GFL (Đức) 13 Máy ly tâm loại bé Hettich (Đức) 14 Máy quay phủ WS-400B-6NPP (Anh) 15 Máy PCR Bio – Rad (Mỹ) 16 Máy rung siêu âm Elma (Đức) 17 Máy UVO – Cleaner Jelight Company Inc (Mỹ) 18 Kính hiển vi quang học 19 Lò lai phân tử UVP (Mỹ) 20 Lò sấy chân khơng OV-DZF-6020 (Trung Quốc) 21 Tủ hút Labconco (Mỹ) 22 Tủ lạnh -20 0C Sanaky (Nhật Bản) 23 Tủ lạnh 40C Sanaky (Nhật Bản) 24 Tủ ấm Binder (Đức) 25 Quang phổ kế hấp thụ nanodrop 2000 Thermo Scientific (Mỹ) 2.2 Phương pháp chế tạo 2.2.1 Phương pháp thiết kế đầu dò a) Chọn đoạn đặc trưng cho gen 16S rARN loài S.suis Trước hết, trình tự gen chủng S.suis thu thập từ ngân hàng gen NCBI (National Center for Biotechnology Information) Để chọn đoạn ADN đặc trưng cho gen 16S rARN chọn trình tự ADN 10 chủng thuộc loài S.suis 17 loài khác giống Streptococcus từ ngân hàng gen So sánh trình tự chương trình ClustalX 2.0.11 xác định đoạn ADN đặc trưng cho S.suis thỏa mãn hai tiêu chí trình bày tiếp sau Mã tên 10 chủng loài S.suis 17 loài khác giống Streptococcus cho gen 16S rARN liệt kê phần phụ lục Đoạn ADN đặc trưng cho S.suis xác định theo hai tiêu chí: 1) Có trình tự giống chủng thuộc lồi S.suis 2) Có trình tự khác S.suis với loài khác giống Streptococcus b) Thiết kế đầu dò cho gen 16S rARN S.suis Một số yêu cầu dể chọn đầu dò đặc hiệu: - Có trình tự đoạn ADN đặc trưng cho gen 16S rARN S.suis; - Có độ dài 18-50 nucleotide, tỉ lệ GC: 40-60%, Tm: thường không chênh hai mồi phụ thuộc vào độ dài cặp mồi thường dao động từ 55 oC 65oC, tránh tình trạng nucleotide mồi tự bổ sung cho (self complementary) hình thành cấu trúc kẹp tóc 2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng PCR a Thiết kế mồi cho phản ứng PCR PCR dùng để chứng minh tách ADN tổng số từ khuẩn lạc S.suis lồi khác thuộc giống Streptococcus khác ni cấy đĩa thạch Việc thiết kế mồi cho phản ứng PCR tiến hành theo thứ tự: 1) Thu thập trình tự gen chủng S.suis lồi khác thuộc giống Streptococcus khác từ ngân hàng NCBI; 2) So sánh xếp trình tự chương trình ClustalX 2.0.11; 3) Chọn mồi xi SF mồi ngược SR có trình tự bổ sung cho vùng bảo thủ gen 16S rARN giống Streptococcus để khuếch đại khơng ADN S.suis mà lồi khác thuộc giống Streptococcus Trong chọn mồi xuôi, tuân theo số quy tắc: mồi có độ dài từ 17- 23 nucleotide, nhiệt độ nóng chảy gần nhiệt độ nóng chảy mồi ngược , khơng nên có nucleotide lặp lại liên tiếp lần trở lên; 4) Kiểm tra lại cặp mồi với chương trình Primer plus để thu thơng số xác b Thiết kế mồi cho phản ứng PCR PCR dùng để chứng minh đặc hiệu đoạn ADN đặc trưng gen 16S rARN S.suis Việc thiết kế mồi cho phản ứng PCR tiến hành theo thứ tự: 1) Thu thập trình tự gen chủng S.suis từ ngân hàng NCBI; 2) So sánh xếp trình tự chương trình ClustalX 2.0.11; 3) Chọn mồi ngược (kí hiệu SRB) đoạn có trình tự bổ sung cho đoạn ADN đặc trưng chọn mục 2.2.1.a mồi xuôi đoạn ADN gen tuân theo số quy tắc cho: mồi có độ dài từ 17- 23 nucleotide, nhiệt độ nóng chảy gần nhiệt độ nóng chảy mồi ngược, khơng nên có nucleotide lặp lại liên tiếp lần trở lên mong muốn có đoạn khuếch đại với độ dài khoảng 100 bp; 4) Kiểm tra lại cặp mồi với chương trình Primer plus để thu thơng số xác 2.2.3 Chế tạo thẻ SPA sử dụng lần Thẻ dùng lần SPA/SAA/APTES/PDMS/Si (thẻ SPA) với kích thước thực tế 0.5 cm x 0.5 cm mang đầu dò SPA đặc hiệu cho gen 16S rARN S suis gây bệnh viêm màng não chế tạo theo bước: 1) PDMS quay phủ đế silic; 2) Xử lý bề mặt PDMS tia tử ngoại ozon (UVO); 3) Chức hóa màng PDMS UVO APTES 5%, tạo nhóm amin tự bề mặt màng; 4) Chức hóa màng mòng PDMS amin SAA, tạo nhóm carboxyl tự bề mặt màng; 5) Cố định ADN đầu dò có đầu nhóm amin lên bề mặt chức hóa có nhóm carboxyl đế thẻ SAA/APTES/PDMS/Si để tạo nên thẻ SPA 10 Hình 2.1 Sơ đồ chế tạo thẻ sử dụng lần SPA Xử lí bề mặt mẫu trước quay phủ PDMS Tạo màng PDMS Xử lý bề mặt màng PDMS phương pháp Ultraviolet-Ozone Amin hóa bề mặt đế Si.PDMS.UVO APTES Màng PDMS.UVO amin hóa APTES gọi chung “màng PDMS amin” Biến đổi nhóm amin thành nhóm cacboxyl Succinic acid anhydride (SAA) Trên đế silic chức hóa APTES có nhóm amin bề mặt, dùng Succinic acid anhydride (SAA) để làm biến đổi bề mặt có chứa nhóm amin thành nhóm cacboxyl Đế chứa màng PDMS cacboxyl gọi đế PDMS carboxyl a) Cố định ADN đầu dò lên đế PDMS carboxyl phương pháp hấp phụ vật lý b) Cố định đầu dò SPA lên đế PDMS carboxyl phương pháp hóa học ADN cố định lên đế carboxyl phương pháp hóa học nhờ sử dụng chất nối 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide (EDC) Chất kích hoạt nhóm –COOH bề mặt đế để phản ứng với nhóm amin đầu dò SPA Đế PDMS carboxyl cố định đầu dò SPA gọi thẻ SPA Diện tích bề mặt tiếp xúc 15µl dung dịch SPA với đế PDMS carboxyl (có kích thước thực tế cm x cm) 0.114 cm2 (hình 2.2) Hình 2.2 Thẻ SPA diện tích tiến hành cố định đầu dò SPA 11 2.2.4 Lai ADN với đầu dò thẻ SPA Sợi ADN đích bổ sung với đầu dò SPA có gắn biotin đầu 5’ sợi ADN đối chứng có trình tự khơng bổ sung lai với đầu dò SPA cố định bề mặt thẻ SPA 2.2.5 Đánh dấu ADN hạt từ-streptavidin Đầu 5’ ADN đích có gắn biotin, sau lai với đầu dò SPA, tiến hành xác định lượng đầu dò SPA thơng qua việc đánh dấu ADN đích hạt từ bọc streptavidin (gọi tắt hạt từ-streptavidin) Sau đó, tiến hành đo tín hiệu hạt từ cảm biến AMR 2.2.6 Tách ADN từ khuẩn lạc Mẫu bệnh phẩm dịch não tủy chẩn đoán nhiễm liên cầu lợn S.suis mẫu bệnh phẩm có chứa liên cầu khuẩn khác (đối chứng âm) cấy đĩa thạch khoa vi sinh Bệnh viện Bạch Mai cung cấp ADN toàn phần tách từ khuẩn lạc S.suis liên cầu khuẩn Streptococcus khác Phòng thí nghiệm Học Viện Quân Y, sử dụng kit tách: ZR Fungal/Bacterial DNA Mini PrepTM (Zymo Research Corp.) 2.2.7 Phương pháp PCR Nguyên lý: Kỹ thuật PCR kỹ thuật dùng enzym Taq ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp phân tử ADN từ trình tự phân tử ADN làm khuôn với tiền chất dNTP ADN khuôn cần mở xoắn thành mạch đơn nhiệt độ 94oC Sau cặp mồi đoạn DNA bắt cặp khoảng nhiệt độ 55 oC (tùy vào thành phần base độ dài đoạn mồi mà có nhiệt độ gắn mồi khác nhau) Tiếp theo, DNA nhân dựa cặp mồi đặc hiệu nhiệt độ 72oC (quá trình bắt đầu 3’-OH tự do) Phản ứng thực có: DNA mẫu, mồi, Taq-polimerase, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, dung dịch đệm Mg2+ Tiến hành: Sau đo nồng độ ADN khn, tính tạo nồng độ ADN mẫu để đưa vào ống phản ứng thể tích ADN khn giống nhau, đạt khoảng 50 ng tổng thể tích 25 µl cho phản ứng Tính lượng thể tích thành phần khác phản ứng, trộn thành phần chia vào ống có khn ADN 12 2.3 Phương pháp nghiên cứu mẫu 2.3.1 Điện di ADN Điện di ADN kỹ thuật dựa vào đặc tính tích điện âm (-) đồng khắp bề mặt điện trường nên di chuyển cực dương (+) điện trường cấu trúc ADN dùng để phân tách ADN Tính linh động khả phân tách phân tử ADN di chuyển điện trường phụ thuộc vào kích thước, khối lượng cấu hình chúng a) Điện di gel agarose Gel agarose loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tách đoạn ADN có kích thước 0.5 – 20 kb Việc chọn nồng độ gel agarose để điện di ADN tùy thuộc vào kích thước đoạn acid nucleic cần phân tách Vì muốn phân tách đoạn ADN có độ dài gần 0.2 kb (198 bp) nên chọn nồng độ gel agarose 1.5% Q trình thí nghiệm tiến hành theo bước Bước : Chuẩn bị gel agarose Bước 2: Tra mẫu Trộn μl ADN sản phẩm PCR với μl dung dịch đệm tra mẫu (6x loading buffer) Sau đó, mẫu tra vào giếng gel Bước 3: Tiến hành điện di với dòng chiều, hiệu điện 60V (cố định thế), thời gian 80 phút Bước 4: Chạy xong điện di, gel lấy nhẹ khỏi khn ngâm dung dịch Ethidium Bromide 10µg/ml 10 phút, sau rửa gel nước cất tiến hành quan sát Bước 5: Bản gel quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng khoảng 254 nm, máy soi ADN lên dạng vạch sáng Cuối cùng, ảnh điện di chụp lại qua ống kính lọc tia tử ngoại b) Điện di gel polyacrylamide Dựa vào kích thước ADN cần phân tách mà gel acrylamide 15% chọn để sử dụng cho trình điện di mẫu 84bp Bước 1: Chuẩn bị gel Bước 2: Tra mẫu, trộn 5μl ADN sản phẩm PCR với 1μl dung dịch đệm tra mẫu (6X loading buffer) Sau đó, mẫu tra vào giếng gel Bước 3: Tiến hành điện di với dòng chiều, hiệu điện 100V (cố định thế), thời gian 70 phút 13 Bước 4: Sau điện di, gel lấy nhẹ khỏi khuôn ngâm dung dịch Ethidium Bromide 10µg/ml 10 phút, sau rửa gel nước cất Bước 5: Bản gel quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng khoảng 254 nm, máy soi ADN lên dạng vạch sáng Ảnh điện di chụp lại qua ống kính lọc tia tử ngoại 2.3.2 Khảo sát góc thấm ướt đế qua bước biến đổi bề mặt Góc thấm ướt xác định phương pháp đơn giản mơ tả Lamour theo sơ đồ hình 2.4: - Đặt đế bề mặt phẳng sạch, nhỏ vào đế 20 µl H2O nước deion; - Chụp lại hình ảnh góc giọt nước bề mặt đế theo sơ đồ hình 2.5; - Sử dụng phần mềm miễn phí Image J để xác định góc thấm ướt Hình 2.5 Sơ đồ hệ chụp ảnh góc thấm ướt 2.3.3 Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR – Fourier Transformation Infrared Spectrometer) phương pháp hóa lý dựa phép đo dao động phân tử bị kích thích xạ hồng ngoại dải bước sóng đặc trưng Khi phân tử hấp thụ lượng từ bên ngồi dẫn đến trình quay, dao động xung quanh vị trí cân Tùy theo lượng kích thích lớn hay nhỏ xảy q trình quay, dao động hay quay dao động đồng thời Các mẫu khảo sát máy đo quang phổ hấp thụ (FTIR), IR Prestige-21 Shimadzu Fourier Transform Infrared, Khoa Hóa Học Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2.3.4 Xác định nồng độ ADN quang phổ kế Dịch tan sau phản ứng cố định đầu dò ADN lên đế thu hồi để định lượng lượng đầu dò lại dung dịch Lượng đầu dò ADN cố định đế thẻ chênh lệch lượng đầu dò trước cố định lượng đầu dò lại dung dịch sau cố định Do ADN hấp thụ cực đại bước sóng 260 nm nên đo độ hấp thụ ADN bước sóng 260 nm để định lượng ADN dung dịch theo định luật Lambert-Beer Độ chênh lệch độ hấp thụ đầu dò ADN tính theo cơng thức: 14 ∆ = − (1.1) Trong đó: Ao : độ hấp thụ bước sóng 260 nm dung dịch ADN trước cố định lên đế A: độ hấp thụ bước sóng 260 nm dung dịch ADN sau cố định lên đế A : độ chênh lệch độ hấp thụ ADN trước sau cố định lên đế silic carboxyl Số mol đầu dò ADN cố định được, tính theo cơng thức: = ∆ ∗ ∗ (1.2) Trong đó: P: lượng đầu dò ADN cố định (pmol) V: thể tích dung dịch cố định (µl) C: nồng dung dịch đầu dò ADN ban đầu (µM) 2.3.5 Phương pháp kính vị quang học Kính vi quang học loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát hình ảnh vật thể nhỏ phóng đại nhờ hệ thống thấu kính thủy tinh Kính hiển vi quang học lựa chọn để quan sát hình ảnh bề mặt thẻ SPA luận văn có độ phóng đại vật kính 50x CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chế tạo thẻ sử dụng lần 3.1.1 Chế tạo đế thẻ Phân tích thành phần hóa học lớp chức hóa màng PDMS phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi (FTIR) Thành phần đế sau bước biến đổi phân tích phương pháp FTIR (hình 3.1) Trên phổ FTIR màng PDMS phủ đế silic có đỉnh hấp thụ đặc trưng cho liên kết Si-O-Si (1088 cm-1), Si-CH3 (1258 cm-1 806 cm-1) C-H (2920 cm-1) Trên phổ FTIR PDMS UVO, đỉnh kể xuất thêm đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động liên kết Si-OH (3669 cm -1 3742 cm1 ) Trên phổ FTIR màng PDMS amin, xuất đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động liên kết N-H (1539 cm-1) -NH2 So với phổ FTIR màng PDMS amin, phổ FTIR màng PDMS carboxyl xuất thêm đỉnh hấp thụ đặc trưng cho 15 dao động liên kết amide (CO-NH) (1643 cm-1) Những kết cho thấy bề mặt đế chức hóa Hình 3.1 Phổ FTIR màng PDMS qua bước chức hóa Khảo sát thay đổi góc thấm ướt đế silic sau bước phủ polyme PDMS, xử lý UVO, chức hóa APTES, SAA Bên cạnh việc phân tích phổ FTIR, biến đổi bề mặt thẻ minh họa thay đổi đáng kể góc thấm ướt (hình 3.2) Việc đo góc thấm ướt bề mặt thẻ thực cách nhỏ 20 µl nước deion lên bề mặt thẻ đo đơn giản theo cách Lamour mô tả, chụp ảnh máy ảnh kỹ thuật số xử lý hình ảnh phần mềm ImageJ Sai số trung bình 2.5 Màng mỏng PDMS đế silic có tính chất kị nước với góc thấm ướt 110º Màng PDMS xử lý tử ngoại/ozon (UVO) 20 phút có góc thấm ướt 72º Mẫu sau chức hóa APTES tăng góc thấm ướt lên 90º giảm xuống 83º sau bước chức hóa SAA Như vậy, thay đổi góc thấm ướt sau bước chức hóa cho thấy biến đổi tính chất bề mặt màng PDMS sau bước biến đổi Kết góc thấm ướt phù hợp với liệu cơng trình Hình 3.2 Góc thấm ướt bề mặt thẻ sau bước biến đổi 3.1.2 Thiết kế ADN đầu dò đặc hiệu cho vi khuẩn S.suis a Xác định đoạn ADN đặc trưng cho S.suis ADN đầu dò cần thiết kế đoạn ADN đặc hiệu cho S.suis phân biệt với lồi khác thuộc giống liên cầu khuẩn Streptococcus Để thiết kế ADN đầu dò đặc hiệu 16 cho S.suis Trước hết, cần xác định đoạn ADN đặc trưng cho S.suis Đoạn ADN phải đáp ứng hai tiêu chí : 1) Có trình tự biến đổi loài khác giống Streptococcus để tránh dương tính giả 2) Có trình tự bảo thủ cao chủng khác thuộc loài S.suis để tránh âm tính giả Gen 16S rARN thường nghiên cứu để định danh phân loại vi khuẩn nói chung S.suis nói riêng, gen bảo thủ Do đó, khn khổ nghiên cứu luận văn, chọn trình tự đoạn ADN đặc trưng S.suis nằm gen 16S rARN Để thiết kế đầu dò đặc hiệu cho gen 16S rARN chọn trình tự ADN 10 chủng thuộc loài S.suis 17 loài khác giống Streptococcus từ ngân hàng gen So sánh trình tự chương trình ClustalX 2.0.11 xác định đoạn ADN đặc trưng cho S.suis thỏa mãn hai tiêu chí Mã tên 10 chủng lồi S.suis 17 loài khác giống Streptococcus cho gen 16S rARN Do gen 16S rARN bảo thủ nên chọn đoạn đặc trưng cho S.suis gen Trình tự đoạn ADN đặc trưng cho gen 16S rARN chọn trình bày bảng 3.1 Trình tự đoạn ADN đặc trưng cho gen 16S rARN phù hợp với trình tự mồi xi Marois cộng sử dụng để khuếch đại đặc hiệu đoạn dài 294 bp gen 16S rARN phương pháp PCR Đầu dò SPA có trình tự đoạn ADN đặc trưng có nhóm amin đầu 5’ để cố định lên đế thẻ (PDMS carboxyl) Bên cạnh đó, đầu dò SPA thiết kế thêm đoạn poly T gồm 20 Thymidine đầu 5’ để giảm tương tác đoạn ADN đích sau lai với đầu dò với bề mặt đế Các trình tự Nucleotide đoạn gen liệt kê bảng 3.1 Bảng 3.1 Trình tự ADN đặc trưng cho gen 16S rARN đầu dò SPA Tên gen Đoạn trưng ADN Đầu dò SPA Trình tự chiều 5’ – 3’ đặc CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TA Amin-(T)20 CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TA Số Nu 23 43 Đầu dò dùng để cố định lên đế thẻ (gọi tắt SPA) có trình tự đoạn ADN đặc trưng có nhóm amin đầu 5’ để cố định lên đế thẻ (PDMS carboxyl) Bên cạnh đó, đầu dò SPA thiết kế thêm đoạn poly T gồm 20 Thymidine đầu 5’ để giảm tương tác đoạn ADN đích sau lai với đầu dò với bề mặt đế (bảng 3.1) b Chứng minh đặc hiệu đoạn ADN đặc trưng PCR 17 Để chứng minh đặc hiệu đoạn ADN đặc trưng (được thiết kế lý thuyết) loài S.suis từ mẫu dịch não tủy bệnh nhân chẩn đoán viêm màng não S.suis gây ra, ADN tổng số tách từ khuẩn lạc S.suis đối chứng đĩa thạch máu cấy từ dịch não tủy nói thực phản ứng PCR ADN tổng số với cặp mồi SF – SR phản ứng PCR sử dụng mồi ngược (kí hiệu SRB có trình tự bổ sung với đoạn ADN đặc trưng mồi xi SF2 (hình 3.4) Hình 3.4 Sơ đồ vị trí cặp mồi sản phẩm PCR Thực phản ứng PCR với căp mồi SF SR (bảng 3.2) để chứng minh việc tách thành công ADN tổng số từ khuẩn lạc S.suis đối chứng đĩa thạch máu Do cặp mồi SF SR thiết kế có trình tự bổ sung cho vùng bảo thủ gen 16S rARN giống Streptococcus nên mẫu S.suis mẫu đối chứng thuộc giống Streptococcus (Streptococcus alactolytocus (Sa01), Streptococcus motis (Sm01), Streptococcus Virodans (Sv01) Streptococcus pneumoniae (Spn01)) lên băng sáng với độ dài khoảng 200bp (theo ClustalX2.0 198 bp) Các vạch sáng lên mờ lượng ADN tổng số tách từ khuẩn lạc không nhiều Sản phẩm PCR phân tích phương pháp điện di gel polyacrylamide 15% mẫu ADN có kích thước nhỏ (hình 3.6) Kết điện di cho thấy, băng sáng với độ dài khoảng 84 bp xuất tất mẫu thuộc loài S.suis Độ dài 84 bp phù hợp với độ dài dự tính sản phẩm PCR thiết kế mồi ClustalX2.0.11 Primer3 plus Bên cạnh đó, băng sáng với độ dài khoảng 84 bp không xuất mẫu đối chứng thuộc giống Streptococcus (Streptococcus motis (Sm02), Streptococcus alactolytocus (Sa01) Streptococcus pneumoniae (Spn01)) cho thấy mồi SRB đặc hiệu với loài S.suis, hay đoạn ADN đặc trưng đặc hiệu với S.suis Các vạch sáng lên mờ lượng ADN tổng số tách từ khuẩn lạc khơng nhiều Ngồi ra, quan sát thấy băng sáng với độ dài khoảng 50 bp tất mẫu Đây sản phẩm việc tạo thành dimer cặp mồi bắt cặp với đầu 3’(điều khẳng định kết thí nghiệm PCR mẫu khơng có ADN mẫu (DNA template) lên băng sáng với độ dài khoảng 50 bp) 18 Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR gen 16S rARN sử dụng cặp mồi SF2-SRB gel polyacrylamide 15% L: Thang ADN 50 bp (ThermoFisherTM SM0371) Ss07, Ss08, Ss09, Ss10 Ss11 thuộc loài S.suis Sm01, Sa01, Spn02 đối chứng 3.1.3 Cố định đầu dò SPA lên bề mặt đế thẻ sử dụng lần 3.1.3.1 Lựa chọn phương pháp cố định đầu dò SPA Đầu dò SPA với độ dài 43 nucleotide thiết kế theo mục 3.1.2 cố định lên bề mặt đế thẻ (PDMS carboxyl) phương pháp hấp phụ vật lý phương pháp hóa học sử dụng chất nối EDC Theo tên gọi, phương pháp hấp phụ vật lý tiến hành đơn giản cách hấp phụ ADN lên bề mặt đế thẻ PDMS carboxyl Trong đó, phương pháp hóa học phương pháp sử dụng chất nối, trường hợp chất nối EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) tan nước để kích hoạt nhóm carboxyl bề mặt đế thẻ nhằm tạo liên kết cộng hóa trị amide nhóm carboxyl đế thẻ amin đầu dò SPA Kết cố định phân tích đánh giá phương pháp đo độ hấp thụ phương pháp quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier ( FTIR) Kết cố định đầu dò SPA phân tích phổ hấp thụ Để cố định đầu dò SPA lên bề mặt đế thẻ PDMS carboxyl, dung dịch đầu dò SPA nhỏ lên bề mặt đế thẻ thời gian nhiệt độ phòng Dịch tan sau cố định thu hồi để định lượng lượng đầu dò SPA lại dung dịch Lượng đầu dò ADN cố định đế thẻ chênh lệch lượng đầu dò trước cố định lượng đầu dò lại dung dịch sau cố định Kết cho thấy, độ hấp thụ bước sóng 260 nm đầu dò SPA lại dịch tan nhỏ độ hấp thụ dung dịch SPA ban đầu lượng ΔA, chứng tỏ SPA cố định lên bề mặt đế PDMS carboxyl, ra, độ hấp phụ dịch tan phương pháp có chất nối EDC có giá trị thấp hẳn so với độ hấp phụ dung dịch SPA trước tham gia phản ứng (bảng 3.4) 19 Bảng 3.4 Lượng đầu dò SPA ban đầu, lại cố định theo phương pháp vật lý hóa học Phương pháp cố định Lượng đầu dò ban đầu (pmol) Lượng đầu dò lại (pmol) Lượng đầu dò cố đinh (pmol) Hấp phụ vật lý 15 ± 0.3 13.5 1.5 ± 0.1 Hóa học 15 ± 0.3 10.5 4.5 ± 0.3 Như vậy, phạm vi tiến hành thí nghiệm cố định đầu dò ADN lên bề mặt đế PDMS carboxyl với phương pháp hấp phụ vật lý hóa học dùng EDC, với kết đầu dò cố định đế gấp lần so với phương pháp lại điều kiện, phương pháp hóa học sử dụng chất nối EDC lựa chọn cho việc tiến hành cố định đầu dò SPA suốt q trình thí nghiệm Phân tích phương pháp FTIR Đế thẻ PDMS carboxyl trước sau gắn đầu dò SPA để thành thẻ SPA phân tích phương pháp FTIR Trên phổ FTIR thẻ PDMS carboxyl (phụ lục 2) có đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động liên kết liên kết amide (1643 cm-1) Trên phổ FTIR thẻ SPA (phụ lục 3) xuất thêm đỉnh hấp thụ so với phổ PDMS carboxyl 916 cm-1, 970 cm-1, 1060 cm-1 ADN 1105 cm-1 tương ứng đặc trưng cho liên kết ribose–phosphate, C–O P–O–C ADN Như vậy, SPA cố định PDMS carboxyl Hình thái học bề mặt màng mỏng PDMS thẻ SPA chụp kính hiển vi điện tử quét Hitachi S4800 field-emission scanning electron microscope (FESEM) Ảnh chụp FESEM cho thấy bề mặt màng mỏng PDMS phằng (hình 3.11.a) bề mặt SPA nhăn gồ ghề (hình 3.11.b) Đó kết q trình xử lý màng PDMS UVO Hình 3.11 Ảnh FESEM bề mặt màng mỏng PDMS (a) thẻ SPA (b), (c) 3.1.3.2 Khảo sát thời gian cố định đầu dò SPA Để khảo sát phụ thuộc lượng đầu dò SPA cố định đế thẻ vào thời gian phản ứng, thực phản ứng cố định sau sau 18 nhiệt độ phòng Kết hình 3.10 cho thấy sau 18 phản ứng, nồng độ đầu dò SPA lại 20 dịch tan thấp không đáng kể so với sau Do đó, chọn thời gian tiến hành phản ứng 3.1.3.3 Khảo sát lượng đầu dò SPA cố định đế thẻ Đầu dò SPA với nồng độ 0.5 µM, µM, µM µM sử dụng để cố định lên bề mặt đế thẻ PDMS carboxyl Kết cho thấy lượng đầu dò SPA cố định thẻ PDMS carboxyl có xu hướng bão hòa (đạt khoảng 4.5 pmol) nồng độ SPA ban đầu tăng đến µM (hình 3.13), chọn đầu dò SPA với nồng độ µM để tạo thẻ SPA Lượng đầu dò SPA cố định (pmol) 0 Nồng độ đầu dò2 SPA ban đầu3 (µM) Hình 3.13 Đồ thị tối ưu lượng đầu dò SPA cố định lên đến PDMS carboxyl 3.2 Khảo sát thẻ SPA với ADN Đầu dò SPA thẻ SPA lai với sợi đơn có trình tự bổ sung (được gọi ADN đích) với nồng độ khác với ADN đối chứng (trình tự ADN đối chứng có sai khác Nucleotide so với ADN đích 15 Nucleotide) ADN đích có biotin đầu 5’ để liên kết với hạt từ - streptavidin với mục đích dán nhãn sau Trình tự ADN nêu trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Trình tự đầu dò SPA, ADN đích ADN đối chứng Tên Đầu dò SPA ADN đích ADN đối chứng Trình tự 5’-Amino-(T)20CAGTATTTACCGCATGGTAGATA-3’ 3’-GTCATAAATGGCGTACCATCTAT–Biotin-5’ 3’-CGCCATAATCGATAGCAAAGGTTA-5’ Số Nu 43 23 24 21 3.2.1 Lai đầu dò SPA với ADN đích ADN đích đoạn ADN sợi đơn tổng hợp, dài 23 Nucleotide, có trình tự bổ sung với đầu dò ADN đích dùng để nghiên cứu điều kiện lai với đầu dò SPA thẻ SPA Do lượng đầu dò SPA thẻ SPA khoảng 4,5 pmol nên thực hiên lai ADN đích với lượng khác nhau: 4.5 pmol, pmol 18 pmol giờ, 50oC Sau lai, thu – bổ sung thể tích đo dịch tan phản ứng phương pháp đo phổ hấp thụ, lượng ADN đích lai được tính tốn giống xác định lượng pmol đầu dò SPA cố định cơng thức 3.2 Kết cho thấy lượng ADN đích đem lai tăng lượng ADN đích lai tăng (hình 3.15) Lượng ADN đích phản ứng (pmol) 4.5 3.5 2.5 1.5 10đem lai (pmol15 Lượng ADN đích ) 20 Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn lượng ADN đích phản ứng ứng với nồng độ đầu vào 3.2.2 Lai đầu dò SPA với ADN đối chứng Bên cạnh việc lai đầu dò SPA với đoạn bổ sung ADN đích, bề mặt thẻ PDMS carboxyl thực thí nghiệm đối chứng sau: 1) Lai đầu dò SPA với đoạn ADN đối chứng có trình tự khơng bổ sung với đầu dò (5’-ATT GGA AAC GAT AGC TAA TAC CGC-3’); 2) Lai ADN đích bề mặt đế thẻ PDMS carboxyl khơng có đầu dò SPA Hình 3.17 thể tương quan kết lai thẻ ADN đích đối chứng với nồng độ khác (4.5 pmol, pmol, 18 pmol) Ta thấy với ADN đích, lượng ADN đem lai tăng lượng ADN lai tăng theo trường hợp thẻ SPA đế khơng có đầu dò SPA Tuy nhiên, lượng ADN đích lai trung bình cao khoảng gấp 2.4 lần trường hợp thứ so với trường hợp Tuy khơng có đầu dò SPA thẻ, ADN đích bám vào đế thẻ hấp phụ ADN lên bề mặt thẻ Với ADN đối chứng, lượng ADN lai dao động pmol không phụ thuộc vào lượng ADN đối chứng đem lai Tại nồng độ ADN đem lai 4.5 pmol, khơng thấy có khác biệt rõ ràng lượng ADN lai ADN đích ADN đối chứng, từ nồng độ pmol 22 thấy rõ khác biệt lượng ADN lai ADN đích với ADN đối chứng ADN đích lai gấp 8.7 lần ADN đối chứng lai 4.4 Lượng ADN lai (pmol) 4.5 ADN đích 3.5 2.5 ADN đối chứng 2.6 2.1 1.8 1.7 1.5 1.22 0.5 0.72 0.39 0.3 4.5 18 Lượng ADN đem lai (pmol) Hình 3.17 Các lượng ADN lai tương đương với lượng ADN đem lai ADN đích, ADN đối chứng ADN đích đế khơng có đầu dò SPA 3.3 Đánh dấu ADN hạt từ đánh giá kết cảm biến AMR 3.3.1 Đánh dấu ADN hạt từ Thẻ SPA sau lai với ADN đích đánh dấu hạt từ sau đưa lên cảm biến phát từ để đo tín hiệu Hạt từ dùng để đánh dấu từ lên sợi ADN đích hạt siêu thuận từ thương mại (Dynabeadsđ MyOne Streptavidin C1) cú kớch thc àm c bọc polyme gắn đơn lớp protein streptavidin bề mặt (ferrite chiếm 26% khối lượng hạt) Do đoạn ADN đích có gắn biotin đầu 5’ nên liên kết với hạt từ-streptavidin nhờ liên kết đặc hiệu streptavidin với biotin Bên cạnh đó, thực đánh dấu từ với đối chứng sau: đối chứng a: thẻ SPA khơng có ADN đích, đối chứng b: thẻ SPA với ADN đối chứng (có trình tự khơng bổ sung với đầu dò khơng có biotin đầu 5’, đối chứng c: thẻ khơng có đầu dò SPA với ADN đích Sau ủ thẻ với hạt từ rửa thẻ đệm để loại bỏ hạt từ không liên kết, thẻ quan sát kính hiển vi quang học với độ phóng đại vật kính 50x (độ phóng đại kính hiển vi độ phóng đại thị kính nhân với độ phóng đại vật kính) (hình 3.21) Có thể thấy khác biệt tương đối mẫu ADN đích mẫu đối chứng Nếu hình ảnh hạt từ mẫu ADN đích thể số lượng nhiều dày đặc, hình ảnh chụp hạt từ mẫu đối chứng a, b, c thể số lượng hẳn 23 Mẫu ADN đích 18 pmol Đối chứng a Đối chứng b Đối chứng c Hình 3.21 Hình ảnh quan sát bề mặt thẻ SPA kính hiển vi quang học với độ phóng đại vật kính 50x 3.3.2 Đánh giá kết đánh dấu ADN hạt từ cảm biến AMR Đoạn ADN đích sau đánh dấu từ thẻ SPA, phát thiết bị cảm biến phát hạt từ Cảm biến sử dụng để phát hạt từ cảm biến từ điện trở dị hướng (anisotropic magnetoresistance) nhóm tác giả Lê Khắc Quynh chế tạo phòng thí nghiệm trọng điểm micro-nano (Đại học Quốc gia Hà Nội) Thẻ dùng lần với sợi ADN đích đánh dấu từ đưa trực tiếp lên bề mặt cảm biến để tiến hành đo tín hiệu Kết đo tín hiệu cảm biến từ cho thấy trường hợp thẻ SPA ủ với ADN đích sau đánh dấu từ cho tín hiệu lớn nhiễu (hình 3.23.a) Tín hiệu tăng gần tuyến tính với lượng ADN đích (hình 3.23.b) Giới hạn phạt cảm biến khoảng 4.5 pmol sợi đơn ADN đích Các đối chứng a,b,c mơ tả mục 3.3.1 cho tín hiệu tương đương với nhiễu (hình 3.23.a) 24 a) b) Hình 3.23 a Tín hiệu cảm biến thẻ SPA với lượng ADN đích khác đối chứng b Đồ thị phụ thuộc tín cảm biến vào lượng ADN đích thẻ SPA Kết cho thấy giới hạn phát cảm biến AMR nồng độ 4.5 pmol ADN đích, nồng độ dung dịch ADN đích đầu vào 0.3 µM So với phương pháp cảm biến sợi quang phát ADN với độ nhạy nồng độ 0.5 µM phương pháp dùng cảm biến AMR có tính khả quan độ nhạy tốt giá thành phương pháp thực Bên cạnh có vài phương pháp đại có giá thành cao có giới hạn phát thấp phương pháp đánh dấu huỳnh quang ADN chip có giới hạn phát 1nM phương pháp graphene hiệu ứng trường cách đưa ADN vào môi trường nước có chứa chất hóa học nhằm phát ADN qua tín hiệu điện thơng qua màng graphene có giới hạn phát thấp pM KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đã thiết kế ADN đầu dò SPA (độ dài 43 Nucleotide), với trình tự 5’Amin-(T)20 CAGTATTTACCGCATGGTAGATA-3’, đặc hiệu cho gen 16S rARN liên cầu khuẩn S.suis Đã chế tạo thẻ dùng lần cách phủ polyme PDMS lên đế silic, sau chức hóa đế để cố định đầu dò SPA phương pháp hóa học (dùng chất nối EDC) Mật độ đầu dò đạt 2.4 x 1013 sợi/cm2 Khi lai đầu dò SPA thẻ dùng lần với ADN đích cho thấy với ADN đích đem lai tăng lượng ADN lai tăng Tại lượng ADN đích đem lai pmol, có phân biệt ADN đích ADN đối chứng 8.7 lần Sử dụng cảm biến từ đo lượng ADN đánh dấu từ thẻ cho thấy tín hiệu cảm biến tăng tuyến tính với lượng ADN đích đem lai, giới hạn phát 4.5 pmol sợi đơn ADN đích 25 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Lê Thị Hiên, Vũ Thị Huyền, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Thị Ngọc, Lương Hồng Nhung, Bùi Đình Tú (2015), Cố định protein albumin huyết bò lên Polydimethylsiloxane chức hóa APTES, SAA ứng dụng chế tạo cảm biến sinh học, Kỷ yếu Hội nghị Vật lý chất rắn Khoa học vật liệu toàn quốc lần thứ – SPMS2015, 08-10/11/2015, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam, tr 514 ... Nghiên cứu thiết kế cố định ADN đầu dò ứng dụng cảm biến ADN định hướng phát vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh vi m màng não Luận văn gồm nội dung sau: Thiết kế ADN đầu dò đặc trưng cho vi. .. với ứng dụng cảm biến ADN dựa chuyển đổi từ cho hướng nghiên cứu cho vi c xây dựng cảm biến phát liên cầu khuẩn S .suis gây bệnh Theo định hướng nghiên cứu gắn với xu phát triển trên, thực luận văn. .. Xác định nồng độ ADN quang phổ kế Dịch tan sau phản ứng cố định đầu dò ADN lên đế thu hồi để định lượng lượng đầu dò lại dung dịch Lượng đầu dò ADN cố định đế thẻ chênh lệch lượng đầu dò trước cố