2.7.3.1. Seminested PCR
Đây là một trong những kỹ thuật phát triển sau này dựa vào nền tảng kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này gồm hai bƣớc:
Bƣớc 1: là sự nhân bản một trình tự DNA.
Bƣớc 2: là sự nhân bản các bản mẫu là các đoạn DNA vừa đƣợc nhân bản. Đoạn DNA đƣợc nhân bản trong bƣớc 2 nằm trong đoạn DNA đƣợc nhân bản trong bƣớc 1. Một trong hai mồi sử dụng ở bƣớc 1 sẽ đƣợc sử dụng lại trong bƣớc 2 để cùng mồi mới tạo thành một cặp mồi. Sau bƣớc đầu tiên, các đoạn DNA chứa đoạn DNA cần nhân bản ở bƣớc 2 đã đƣợc nhân lên rất nhiều so với lƣợng DNA ban đầu. Do đó, ở bƣớc 2, lƣợng bản mẫu sẽ nhiều hơn lƣợng DNA không mong muốn nên sự nhân bản các đoạn DNA mong muốn sẽ diễn ra dễ dàng hơn, dẫn đến sự nhân bản đặc hiệu hơn.
2.7.3.2. Multiplex PCR
Multiplex PCR là một kỹ thuật dùng nhiều cặp mồi khác nhau trong cùng một phản ứng PCR để nhân bản đồng thời nhiều đoạn trình tự. Số lƣợng các sản phẩm PCR khác nhau đƣợc nhân bản trong cùng một phản ứng PCR có thể từ 2 sản phẩm đến tối đa 15 sản phẩm, điều này có nghĩa là có thể dùng đến 15 cặp mồi trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật này đƣợc thử nghiệm thành công vào năm 1988 và từ đó đã đƣợc áp dụng thành công trong nhiều công trình nghiên cứu về các biến đổi di truyền ở ngƣời cũng nhƣ nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác.
Kỹ thuật multiplex PCR thƣờng dùng để kết hợp với kỹ thuật nested PCR hay seminested PCR nhằm thu đƣợc kết quả với độ chính xác và độ đặc hiệu cao.
2.7.4. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ màng não mủ
Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm, xen kẽ với các vùng biến động khác nhau giữa các loài trong nhóm. Do đó, những trình tự này rất phù hợp với mục đích thiết kế mồi nhằm phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn và các kỹ thuật chẩn đoán dựa vào kỹ thuật PCR ngày càng đƣợc phát triển với mục đích tăng độ nhạy của phản ứng.
Năm 1994, Radstrom và các cộng sự đã đề ra phƣơng án sử dụng cặp mồi u3 và ru8 để nhân bản vùng trình tự bảo tồn trên gene 16S rRNA trong bƣớc đầu và sử dụng
mồi ru8 với các mồi đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn để nhân bản vùng trình tự đặc biệt của mỗi loài trong bƣớc 2. Kỹ thuật tiếp tục đƣợc nhóm nghiên cứu phát triển (năm 1998) để phát hiện đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ trong dịch não tủy nhƣ Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae và Listeria monocytogenes.
Cũng vào năm 1994, Greisen và các cộng sự công bố công trình nghiên cứu những mồi và mẫu dò cho gene 16S rRNA của hầu hết các loài vi khuẩn gây bệnh, bao gồm vi khuẩn tìm thấy trong dịch não tủy. Đầu tiên là sự nhân bản vùng trình tự bảo tồn trên gene 16S rRNA bằng phƣơng pháp PCR. Sau đó sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện DNA các loài vi khuẩn.
Tƣơng tự các công trình nghiên cứu trƣớc, Jang – Jih Lu và các cộng sự vào năm 2000 cũng đã thiết lập một cặp mồi chung trên gene 16S rRNA cho các loài vi khuẩn
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis để thiết lập phản ứng PCR nhân bản đoạn có kích thƣớc 996 bp. Ở bƣớc 2 tác giả sử dụng enzyme cắt giới hạn phân cắt đoạn trình tự lớn 996 bp. Các sản phẩm PCR sau khi đã xử lý bằng enzyme sẽ đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 6% và so sánh với thang chuẩn để xác định sự hiện diện của vi khuẩn trong dịch não tủy.
Qua một số công trình nghiên cứu trên, chúng tôi thấy hầu hết việc phát hiện vi khuẩn gây viêm màng não mủ đều trải qua bƣớc cơ bản là nhân bản 1 trình tự bảo tồn. Do đó, trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi tiến hành thu thập các trình tự gene
16S và 23S rRNA bảo tồn trên các loài vi khuẩn và lƣu trữ trong CSDL. Từ các trình tự này chúng tôi sử dụng phần mềm Primrose để thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ.
2.8. GENE 16S rRNA VÀ 23S rRNA
2.8.1. RNA ribosome (rRNA) – Cấu trúc ribosome
Sự tổng hợp các chuỗi polypeptide trong tất cả các hệ thống sống đƣợc thực hiện tại các ribosome. Ribosome của vi khuẩn có khối lƣợng khoảng chừng 2,5 triệu dalton, có hệ số lắng là 70S, trong đó protein chiếm 1/3 khối lƣợng và phần còn lại là các rRNA.
Tất cả các ribosome đƣợc hình thành từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein có kích thƣớc không bằng nhau. Ở vi khuẩn, những tiểu đơn vị này có hệ số lắng là 50S và 30S. Ribosome ở E. coli cũng nhƣ ở các loài vi khuẩn khác chứa 3 loại rRNA: 16S rRNA, 23S rRNA và 5S rRNA.
16S rRNA ở E. coli có chiều dài khoảng 1542 ribonucleotide là một thành phần cấu thành tiểu đơn vị nhỏ của ribosome. Tiểu đơn vị lớn của ribosome thì chứa hai loại rRNA là 23S và 5S (ở E. coli có chiều dài lần lƣợt là 2904 và 120 ribonucleotide). Ngƣời ta cho rằng rRNA đóng vai trò rất quan trọng trong cấu trúc của ribosome, giúp cho việc gắn kết của các protein ribosome và góp phần quyết định hình dạng của ribosome.
Thành phần cấu tạo của ribosome điển hình (ở vi khuẩn E. coli) bao gồm 55 phân tử protein có khối lƣợng khoảng 900 000 dalton, trong số này có 4 phân tử protein cùng loại, các phân tử còn lại là khác nhau. Tiểu đơn vị nhỏ của ribosome bao gồm 21 protein kết hợp với 16S rRNA, tiểu đơn vị lớn bao gồm 34 protein kết hợp với 23S rRNA và 5S rRNA.
Hình 2.7. Thành phần cấu tạo của ribosome ở prokaryote
Cho đến nay, chƣa có một kết luận hợp lý nào về sự xuất hiện một lƣợng lớn rRNA trong ribosome. Tuy nhiên, mọi ngƣời đều tin rằng các ribonucleotide không bắt cặp trong cấu trúc bậc 2 của rRNA có liên quan đến sự gắn kết của các RNA khác lên ribosome. Chẳng hạn một vài ribonucleotide ở gần đầu 3‟ của 16S rRNA là điểm bắt cặp với các nucleotide (trình tự Shine – Dalgarno) trên phân tử RNA thông tin (mRNA) để ribosome có thể gắn vào RNA thông tin và tiến hành tổng hợp chuỗi polypeptide. Tƣơng tự, một vài trình tự rRNA của ribosome cũng tƣơng tác với các trình tự của RNA vận chuyển (tRNA) khác nhau trong quá trình tổng hợp protein.
2.8.2. Gene 16S rRNA thƣớc đo tiến hóa
Từ năm 1967, Zuckerkand và Pauling đã đƣa ra ý kiến cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hoá” hay “thƣớc đo tiến hoá”. Để là một thƣớc đo tiến hóa, phân tử đƣợc chọn phải có các đặc điểm sau.
- Phân tử phải có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát. - Phân tử không đƣợc truyền qua lại giữa các loài.
- Trình tự của phân tử này phải có độ bảo tồn và biến động thích hợp trong khoảng cách tiến hóa khảo sát.
- Phân tử phải có kích thƣớc đủ lớn để chứa nhiều thông tin. Mặc dù các tRNA có mặt ở hầu hết các vi sinh vật nhƣng chúng không đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hóa do có kích thƣớc quá nhỏ (75 ribonucleotide).
Một thập kỷ sau, vào năm 1977, Woese và các cộng sự đã xác định 16S rRNA là phân tử rất thích hợp làm thƣớc đo tiến hóa. 16S rRNA là phân tử cổ, là thành phần của bộ máy tổng hợp protein có từ lâu đời. Hơn nữa, các rRNA là những phân tử có chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải cho phép phản ảnh sự liên quan tiến hóa giữa các loài sinh vật.
Ba loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hóa. Tuy nhiên, 5S rRNA có kích thƣớc quá nhỏ (khoảng 120 ribonucleotide), mang ít thông tin của quá trình tiến hóa nên ít đƣợc chọn. 23S rRNA là phân tử lớn (có khoảng 2900 ribonucleotide), có đầy đủ các tính chất để có thể làm thƣớc đo tiến hóa. Tuy nhiên, kích thƣớc của 23S rRNA lớn nên thao tác nghiên cứu trên phân tử này không thuận lợi lắm. Phân tử 16S rRNA có kích thƣớc vừa phải, khoảng 1500 ribonucleotide, thuận lợi cho các thao tác nghiên cứu nên hiện nay, phân tử này đƣợc coi nhƣ là “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học. Tuy nhiên, do RNA đòi hỏi phải rất cẩn trọng trong thao tác do dễ bị phân hủy nên khuynh hƣớng hiện nay là sử dụng gene mã hóa cho RNA – gọi là gene 16S rRNA – trong các nghiên cứu. Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có một điểm rất đặc biệt là có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau giữa các loài trong cùng nhóm này. Tuy là những vùng biến động, nhƣng những vùng này lại là những vùng bảo tồn ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở các cấp độ khác nhau đã giúp cho gene 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên của các nhà nghiên cứu khi tiến hành định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn. Cho đến nay, số lƣợng các gene 16S rRNA đã đƣợc giải trình tự lên đến hơn 10 000. Điều này cho thấy có sự quan tâm rất lớn của các nhà khoa học đến đối tƣợng này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.8. Vị trí và kích thước của 16S và 23S rRNA trong bộ gene vi khuẩn
– Ứng dụng của gene 16S rRNA trong lĩnh vực y học
Gene 16S rRNA đƣợc sử dụng nhiều trong các nghiên cứu xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh. Trƣớc đây, trong nhiều công trình nghiên cứu, trình tự DNA đích đƣợc nhân trong kỹ thuật PCR liên quan đến các gene gây bệnh đặc hiệu cho tác nhân, nhƣ gene protease A (Kuritza & Oehler, 1991) hay gene dhps (dihydropteroate synthase) (Salo & cs, 1995) nhằm phát hiện N. meningitidis, gene autolysin (Cherian & cs, 1998) nhằm phát hiện các serotype của S. pneumoniae. Đôi khi, trình tự đích là một trình tự ngẫu nhiên đƣợc chọn từ thƣ viện bộ gene của một tác nhân gây bệnh nhƣ trong công trình về Legionella sp và Legionella pneumophila (Mahbubani & cs, 1989). Tuy nhiên trong những năm gần đây, khuynh hƣớng sử dụng các gene có độ bảo tồn cao giữa các vi khuẩn gây bệnh nhƣ vùng gene 16S rRNA ngày càng đƣợc ƣa chuộng. Việc lựa chọn và sử dụng phối hợp consensus primer nằm trong các vùng bảo tồn và các primer đặc hiệu trong các vùng biến động sẽ cho phép phát hiện sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh nói chung đồng thời xác định đƣợc tên của vi khuẩn. Greisen & cs (1994) sử dụng các consensus primer để nhân bản trình tự DNA của 124 loài vi khuẩn. Các trình tự này sau đó đƣợc lai (Southern blotting) với các probe đặc hiệu cho các nhóm và loài vi khuẩn gây bệnh khảo sát. Các tác giả đã phát hiện và định danh đƣợc hầu hết các vi khuẩn gây bệnh hiện diện. Radstrom & cs (1994) nhân bản gene
16S rRNA bằng hai phản ứng PCR nối tiếp (seminested PCR). Phản ứng PCR I cho sản phẩm nhân bản là một trình tự chung cho mọi vi khuẩn trong khi sản phẩm nhân bản lần II là đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn. Theo công bố, quy trình đạt độ nhạy cao (0,94) và độ đặc hiệu cao (0,96). Công trình trên đƣợc hoàn thiện bởi Backman & cs, (1999) nhằm hạn chế các kết quả âm tính giả do tác động ức chế của các tạp chất có mặt trong bệnh phẩm hoặc dƣơng tính giả do sự ngoại nhiễm, đồng thời bổ sung thêm primer đặc hiệu để tăng phổ phát hiện của qui trình.
2.8.3. Gene 23S rRNA
Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành trên trình tự của tiểu đơn vị lớn (23S rRNA) ở vi khuẩn. Theo Rina Uzuka và cộng sự (2004), vùng 23S rRNA thể hiện sự biến động giữa các loài hơn vùng 16S rRNA. Theo đó, có thể thiết kế mồi chung (universal primer) dựa trên vùng bảo tồn và mồi chuyên biệt (specific primer) dựa trên vùng biến động của trình tự 23S rRNA để phân biệt đƣợc các nhóm vi khuẩn gây viêm màng não. Nếu thiết kế mồi trên trình tự 16S rRNA thì không có khả năng phân biệt các loài trong nhóm vi khuẩn này. Nhóm tác giả sử dụng 10 loài vi khuẩn lấy từ dịch não tủy của trẻ bị viêm màng não để nghiên cứu. Thiết kế mồi trong vùng chung và vùng chuyên biệt của gene 23S rRNA. Sau đó khuếch đại những vùng này bằng kỹ thuật multiplex PCR và real-time PCR. Kết quả, tất cả các vi khuẩn đều cho một băng điện di của sản phẩm PCR chỉ sử dụng mồi chung. Haemophilus influenzae
và Streptococcus pneumoniae cho hai băng khi sử dụng phƣơng pháp PCR kết hợp mồi chung và mồi chuyên biệt. Tác giả định lƣợng H. influenzae bằng phƣơng pháp real-time PCR trong 15 phút. Nhƣ vậy ta có thể định danh và định lƣợng vi khuẩn có trong dịch não tủy của bệnh nhân chỉ trong một thời gian ngắn (< 3 giờ).
Theo Rina Uzuka, vùng 23S rRNA thƣờng liên quan đến việc kháng kháng sinh phân tử vòng lớn (macrolide antibiotic). Việc thiết kế các universal primer mới để khuếch đại vùng 23S rRNA là rất hữu ích trong chẩn đoán các vi khuẩn kháng thuốc.
2.9. ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ BẰNG KHÁNG SINH
Việc phân chia vi khuẩn theo khả năng tác động của các nhóm kháng sinh có ý nghĩa rất quan trọng. Nếu dùng đúng thuốc đặc trị cho từng vi khuẩn sẽ giúp cho việc điều trị bệnh một cách hiệu quả. Ngƣợc lại dùng kháng sinh không đúng sẽ xảy ra tình trạng lờn thuốc rất nguy hiểm.
Bảng 2.3. Các nhóm kháng sinh đặc trị vi khuẩn viêm màng não mủ
Vi khuẩn Chọn kháng sinh
S. pneumonia Vancomycin + Broad-spectrum cephalosporin
H. influenzae Ceftriaxone
N. meningitidis Penicillin G
L. monocytogenes Ampicillin + gentamicin
S. agalactiae Penicillin G
Enterobacteriaceae Broad-spectrum cephalosporin + aminoglycoside
PHẦN 3: PHƢƠNG PHÁP VÀ CHƢƠNG TRÌNH SỬ DỤNG
3.1. CÁC CHƢƠNG TRÌNH VÀ NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH ĐƢỢC SỬ DỤNG 3.1.1. Hệ điều hành 3.1.1. Hệ điều hành
Windows XP (Microsoft). Xây dựng CSDL gene 16S và 23S rRNA ở vi khuẩn trên hệ điều hành này.
3.1.2. Các chƣơng trình phân tích trình tự
3.1.2.1. Chƣơng trình so sánh trình tự ClustalW
ClustalW là một phần mềm (chạy trên nền Dos) dùng để so sánh sự tƣơng đồng của hai hay nhiều trình tự sinh học (pairswise or mutiple alignment). ClustalW mô tả kết quả bằng hệ thống các kí hiệu làm nổi bật những nét đặc trƣng trong những đoạn tƣơng đồng. ClustalW ngày càng trở nên hữu ích cho các nhà nghiên cứu trong việc tìm kiếm những vùng bảo tồn trên những trình tự DNA hoặc protein. Sự hiểu biết về mutiple alignment giúp ích rất nhiều cho các nhà khoa học trong việc dự đoán cấu trúc bậc hai, bậc ba của protein, đồng thời phát hiện sự tƣơng đồng giữa những đoạn gene (hoặc protein) vừa đƣợc giải trình tự với những gene (hoặc protein) đã có.
ClustalW tiến hành so sánh tƣơng đồng nhiều trình tự sinh học qua ba giai đoạn: Đầu tiên chƣơng trình sử dụng thuật toán alignment xấp xỉ của Wilbur và Lipman năm 1983 để tính hệ số tƣơng đồng giữa mỗi cặp trình tự.
Những hệ số tƣơng đồng tính đƣợc sẽ đƣợc sử dụng để thành lập cây phả hệ (“Guide tree” hay “dendrogram”) bằng phƣơng pháp UPGM (Unweighted Pair – Group Method) của Sneath và Sokal năm 1973.
Cuối cùng các trình tự đƣợc so sánh với những nhóm trình tự lớn hơn và cứ thế tiếp tục. Ở mỗi giai đoạn so sánh, ClustalW sẽ sử dụng thuật toán của Myers và Miller (1998) nhằm tối ƣu kết quả.
ClustalW 1.83 đƣợc sử dụng trong khóa luận này, có thể tải về từ trang web (http://www.es.embnet.org/Services/ftp/software/ebi/dos/clustalw/)
3.1.2.2. Chƣơng trình tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng – BLAST
BLAST là một chƣơng trình tìm kiếm và so sánh trình tự tƣơng đồng đƣợc nhiều ngƣời dùng nhất hiện nay. Thuật toán của BLAST xuất phát từ ý tƣởng “liệu trong ngân hàng dữ liệu (bao gồm cả CSDL cục bộ và những CSDL lớn trên thế giới nhƣ GenBank, EMBL…) có trình tự nào giống hoặc gần giống với trình tự đang quan (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});