Từ năm 1967, Zuckerkand và Pauling đã đƣa ra ý kiến cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hoá” hay “thƣớc đo tiến hoá”. Để là một thƣớc đo tiến hóa, phân tử đƣợc chọn phải có các đặc điểm sau.
- Phân tử phải có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát. - Phân tử không đƣợc truyền qua lại giữa các loài.
- Trình tự của phân tử này phải có độ bảo tồn và biến động thích hợp trong khoảng cách tiến hóa khảo sát.
- Phân tử phải có kích thƣớc đủ lớn để chứa nhiều thông tin. Mặc dù các tRNA có mặt ở hầu hết các vi sinh vật nhƣng chúng không đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hóa do có kích thƣớc quá nhỏ (75 ribonucleotide).
Một thập kỷ sau, vào năm 1977, Woese và các cộng sự đã xác định 16S rRNA là phân tử rất thích hợp làm thƣớc đo tiến hóa. 16S rRNA là phân tử cổ, là thành phần của bộ máy tổng hợp protein có từ lâu đời. Hơn nữa, các rRNA là những phân tử có chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải cho phép phản ảnh sự liên quan tiến hóa giữa các loài sinh vật.
Ba loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hóa. Tuy nhiên, 5S rRNA có kích thƣớc quá nhỏ (khoảng 120 ribonucleotide), mang ít thông tin của quá trình tiến hóa nên ít đƣợc chọn. 23S rRNA là phân tử lớn (có khoảng 2900 ribonucleotide), có đầy đủ các tính chất để có thể làm thƣớc đo tiến hóa. Tuy nhiên, kích thƣớc của 23S rRNA lớn nên thao tác nghiên cứu trên phân tử này không thuận lợi lắm. Phân tử 16S rRNA có kích thƣớc vừa phải, khoảng 1500 ribonucleotide, thuận lợi cho các thao tác nghiên cứu nên hiện nay, phân tử này đƣợc coi nhƣ là “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học. Tuy nhiên, do RNA đòi hỏi phải rất cẩn trọng trong thao tác do dễ bị phân hủy nên khuynh hƣớng hiện nay là sử dụng gene mã hóa cho RNA – gọi là gene 16S rRNA – trong các nghiên cứu. Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có một điểm rất đặc biệt là có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau giữa các loài trong cùng nhóm này. Tuy là những vùng biến động, nhƣng những vùng này lại là những vùng bảo tồn ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở các cấp độ khác nhau đã giúp cho gene 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên của các nhà nghiên cứu khi tiến hành định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn. Cho đến nay, số lƣợng các gene 16S rRNA đã đƣợc giải trình tự lên đến hơn 10 000. Điều này cho thấy có sự quan tâm rất lớn của các nhà khoa học đến đối tƣợng này.
Hình 2.8. Vị trí và kích thước của 16S và 23S rRNA trong bộ gene vi khuẩn
– Ứng dụng của gene 16S rRNA trong lĩnh vực y học
Gene 16S rRNA đƣợc sử dụng nhiều trong các nghiên cứu xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh. Trƣớc đây, trong nhiều công trình nghiên cứu, trình tự DNA đích đƣợc nhân trong kỹ thuật PCR liên quan đến các gene gây bệnh đặc hiệu cho tác nhân, nhƣ gene protease A (Kuritza & Oehler, 1991) hay gene dhps (dihydropteroate synthase) (Salo & cs, 1995) nhằm phát hiện N. meningitidis, gene autolysin (Cherian & cs, 1998) nhằm phát hiện các serotype của S. pneumoniae. Đôi khi, trình tự đích là một trình tự ngẫu nhiên đƣợc chọn từ thƣ viện bộ gene của một tác nhân gây bệnh nhƣ trong công trình về Legionella sp và Legionella pneumophila (Mahbubani & cs, 1989). Tuy nhiên trong những năm gần đây, khuynh hƣớng sử dụng các gene có độ bảo tồn cao giữa các vi khuẩn gây bệnh nhƣ vùng gene 16S rRNA ngày càng đƣợc ƣa chuộng. Việc lựa chọn và sử dụng phối hợp consensus primer nằm trong các vùng bảo tồn và các primer đặc hiệu trong các vùng biến động sẽ cho phép phát hiện sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh nói chung đồng thời xác định đƣợc tên của vi khuẩn. Greisen & cs (1994) sử dụng các consensus primer để nhân bản trình tự DNA của 124 loài vi khuẩn. Các trình tự này sau đó đƣợc lai (Southern blotting) với các probe đặc hiệu cho các nhóm và loài vi khuẩn gây bệnh khảo sát. Các tác giả đã phát hiện và định danh đƣợc hầu hết các vi khuẩn gây bệnh hiện diện. Radstrom & cs (1994) nhân bản gene
16S rRNA bằng hai phản ứng PCR nối tiếp (seminested PCR). Phản ứng PCR I cho sản phẩm nhân bản là một trình tự chung cho mọi vi khuẩn trong khi sản phẩm nhân bản lần II là đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn. Theo công bố, quy trình đạt độ nhạy cao (0,94) và độ đặc hiệu cao (0,96). Công trình trên đƣợc hoàn thiện bởi Backman & cs, (1999) nhằm hạn chế các kết quả âm tính giả do tác động ức chế của các tạp chất có mặt trong bệnh phẩm hoặc dƣơng tính giả do sự ngoại nhiễm, đồng thời bổ sung thêm primer đặc hiệu để tăng phổ phát hiện của qui trình.