Khai thác dữ liệu EST nhằm phát hiện Microsatellite phục vụ cho công tác phân tích và so sánh đặc điểm di truyền của ong mật

Khai thác dữ liệu EST nhằm phát hiện Microsatellite phục vụ cho công tác phân tích và so sánh đặc điểm di truyền của ong mật

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KKHHAAII TTHHÁÁCC DDỮỮ LLIIỆỆUU EESSTT ((EExxpprreesssseedd SSeeqquueennccee TTaaggss)) NNHHẰẰMM PPHHÁÁTT HHIIỆỆNN MMIICCRROOSSAATTEELLLLIITTEE PPHHỤỤCC VVỤỤ CCHHOO CCÔÔNNGG TTÁÁCC PPHHÂÂNN TTÍÍCCHH VVÀÀ SSOO SSÁÁNNHH ĐĐẶẶCC ĐĐIIỂỂMM DDII TTRRUUYYỀỀNN CCỦỦAA OONNGG MMẬẬTT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002-2006 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGỌC VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KKHHAAII TTHHÁÁCC DDỮỮ LLIIỆỆUU EESSTT ((EExxpprreesssseedd SSeeqquueennccee TTaaggss)) NNHHẰẰMM PPHHÁÁTT HHIIỆỆNN MMIICCRROOSSAATTEELLLLIITTEE PPHHỤỤCC VVỤỤ CCHHOO CCÔÔNNGG TTÁÁCC PPHHÂÂNN TTÍÍCCHH VVÀÀ SSOO SSÁÁNNHH ĐĐẶẶCC ĐĐIIỂỂMM DDII TTRRUUYYỀỀNN CCỦỦAA OONNGG MMẬẬTT Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ TRẦN NGỌC VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 iii LỜI CẢM TẠ Cảm ơn công lao nuôi dƣỡng, dạy dỗ của cha mẹ Xin chân thành cảm tạ Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh Học cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Chân thành cảm ơn TS. Bùi Minh Trí đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Xin cảm ơn CN. Lƣu Phúc Lợi đã giúp đỡ, hỗ trợ tài liệu chuyên môn. Cảm ơn các anh chị tại phòng Sinh Hóa đã tạo điều kiện tốt cho tôi khi tiến hành thực hiện công việc tại Trung Tâm. Xin cảm ơn bạn bè thân yêu của lớp DH02SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Tp. Hồ Chí Minh tháng 08 năm 2006 Sinh viên thực hiện Trần Ngọc Việt iv TÓM TẮT TRẦN NGỌC VIỆT, Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHAI THÁC DỮ LIỆU EST (Expressed Sequence Tags) NHẰM PHÁT HIỆN MICROSATELLITE PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ONG MẬT” Giảng viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2006 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Phân tích Thí Nghiệm - trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh Ở Việt Nam, nghề nuôi ong mật đã hình thành rất lâu và hiện nay các sản phẩm của ong mật hầu hết là đƣợc xuất khẩu. Hiệu quả kinh tế mang về từ nghề nuôi là khá cao. Tuy nhiên, việc nuôi ong chỉ tập trung chủ yếu ở một số vùng nhất định nhƣ Tây Nguyên (Đak Lak), miền Đông Nam Bộ, chƣa tận dụng đƣợc hết nguồn tài nguyên có sẵn. Sự hạn chế này là do chƣa xác định đƣợc loài ong cho mật nào phù hợp với từng vùng địa lý cụ thể tại Việt Nam. Chính vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu về việc thiết lập nên primer chạy phản ứng PCR dựa vào chỉ thị microsatellite của các loài ong cho mật để làm cơ sở cho những bƣớc nghiên cứu định danh và xác định đặc điểm di truyền của ong mật phục vụ cho việc mở rộng nghề nuôi ong mật ở các vùng ở Việt Nam. Những kết quả đã đạt đƣợc: ۰ Chúng tôi đã chọn đƣợc một nguồn dữ liệu (EST) tốt cho nghiên cứu ۰ Thiết lập đƣợc phƣơng pháp để tìm kiếm microsatellite từ nguồn EST ۰ Thiết kế đƣợc những cặp primer dựa vào vùng bảo tồn hai bên những loại microsatellite tìm đƣợc Kết luận: Sự thành công của việc thiết kế primer đã làm cơ sở cho những bƣớc nghiên cứu xa hơn về đặc điểm di truyền của các loài ong cho mật. Thành công này mở ra một triển vọng cho việc ứng dụng lĩnh vực Bioinformatic hỗ trợ cho nghiên cứu thực nghiệm, làm giảm đáng kể chi phí và đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu thực nghiệm tại Trung Tâm. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ …………………………………………………………………………… iii Tóm tắt ………………………………… .………….……………………………… iv Mục lục ………………………………………………………………………… …….v Danh sách các chữ viết tắt viii Danh sách các bảng .ix Danh sách các hình .x 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề .1 1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 2 1.2.1. Mục đích nghiên cứu .2 1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu .2 1.3. Giới hạn .2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1. Giới thiệu chung về ong mật .3 2.1.1. Cấu tạo cơ thể của ong mật 3 2.1.1.1. Hình thái cơ thể 3 2.1.1.2. Các cơ quan bên trong 6 2.1.2. Tổ chức của đàn ong 6 2.1.3. Yêu cầu dinh dƣỡng của ong .7 2.1.4. Các sản phẩm của ong .7 2.1.4.1. Mật ong .7 2.1.4.2. Phấn hoa .7 2.1.4.3. Sữa ong chúa 7 2.1.4.4. Sáp ong 8 2.2. Nguồn gốc EST (Expressed Sequence Tags) 8 2.2.1. EST là gì? 8 2.2.2. Phƣơng pháp tạo EST 8 vi 2.3. Microsatellite là gì? .10 2.3.1. Các dạng microsatellite .10 2.3.2. Cơ chế hình thành microsatellite .11 2.3.3. Ứng dụng của microsatellite 12 2.3.4. Marker phân tử (molecular markers) .13 2.3.5. Vì sao chọn marker microsatellite? .14 2.4. Ngôn ngữ lập trình Perl (Practical Extraction and Reporting Language) .15 2.4.1. Nguồn gốc của Perl 15 2.4.2. Cấu trúc của Perl 16 2.4.2.1. Dữ liệu vô hƣớng (scala data) 16 2.4.2.2. Cấu trúc điều khiển .16 2.4.2.3. Các List, Array và Hash .19 2.4.2.4. Dòng chƣơng trình và các thƣờng trình con .19 2.4.2.5. Package và Module 20 2.5. Giới thiệu về mồi (primer) 21 2.5.1. Khái quát về mồi 21 2.5.2. Đặc điểm của mồi .21 2.5.2.1. Tính chuyên biệt .21 2.5.2.2. Tính ổn định .22 2.5.2.3. Tính tƣơng thích .23 2.6. Tin sinh học .24 2.6.1. Khái niệm tin sinh học 24 2.6.2. Các lĩnh vực nghiên cứu chính của tin sinh học .24 2.6.2.1. Genomics - Hệ gen học 24 2.6.2.2. Sinh học tiến hóa 26 2.6.2.3. Phân tích chức năng gen .26 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu .29 3.1.1. Thời gian nghiên cứu .29 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu .29 3.2. Vật liệu và công cụ nghiên cứu .29 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu .29 vii 3.2.2. Công cụ nghiên cứu .29 3.3. Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu .30 3.3.1. Quy trình nghiên cứu tổng quát .30 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .31 3.3.2.1. Sơ đồ các bƣớc tiến hành nghiên cứu .31 3.3.2.2. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu chi tiết 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 4.1. Kết quả tìm kiếm và tải trình tự EST về máy tính cá nhân .42 4.1.1. Kết quả tìm kiếm EST .42 4.1.2. Kết quả tải trình tự EST về máy tính cá nhân .43 4.2. Kết quả tìm và phân loại microsatellite .44 4.2.1. Kết quả tìm microsatellite qua xử lý của EST_TRIMMER 44 4.2.2 Kết quả xử lý qua MISA 45 4.3. Kết quả thiết kế primer 49 4.3.1. Kết quả thiết kế primer qua 6 Script Perl 49 4.3.2. Kết quả so sánh và chọn lọc primer đƣợc thiết kế .56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 5.1. Kết luận .59 5.1.1. Sơ đồ phƣơng pháp thực hiện 59 5.1.2. Kết quả đạt đƣợc .60 5.2. Đề nghị 60 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 7. PHỤ LỤC .64 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ALP Amplified Length Polymorphism AP-PCR Arbitrary Primer –Polymerase Chain Reaction BLAST Basic Local Alignment Search Tools CEB Computional Evolution Biology DAF DNA Amplification Fringerprinting DDBJ DNA Data Bank of Japan EMBL the European Molecular Biology Laborary EST Expressed Sequence Tags NCBI the National Center for Biotechnology Information MPSS Massively Parllel Signatur Sequencing PCR Polymerase Chain Reaction PDA Primer Design Assitant PERL Practical Extraction and Reporting Language RAPD Radom Aplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism SSCP Single Strand Conformation Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats STS Sequence Tagged Sites ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Tên gọi một số marker DNA 13 Bảng 4.1. Kết quả xử lý qua MISA 47 Bảng 4.2. Thành phần của các dạng microsatellite .47 Bảng 4.3. Tỷ lệ phần trăm các dạng microsatellite .48 Bảng 4.4. Phần trăm các loại microsatellite chiếm tỷ lệ cao 48 Bảng 4.5. Kết quả primer của dạng dinucleotide SSR 54 Bảng 4.6. Kết quả primer của dạng trinucleotide SSR .55 Bảng 4.7. Kết quả primer của dạng tetranucleotide SSR .56 Bảng 4.8. Kết quả primer sau cùng của dạng dinucleotide SSR 57 Bảng 4.9. Kết Quả primer sau cùng của dạng tri/tetra-nucleotide SSR 57 Bảng 4.10. Trình bày loại SSR và mã số truy cập của EST .58 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái các loài ong cho mật .3 Hình 2.2. Thể hiện ba phần chính của ong .4 Hình 2.3. Hình thái phần đầu của con ong .4 Hình 2.4. Hình thái phần ngực của con ong .5 Hình 2.5. Hình thái phần bụng của con ong .5 Hình 2.6. Sơ đồ nguồn gốc của EST 9 Hình 2.7. Cách thức tạo nên EST .10 Hình 2.8. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 11 Hình 2.9. Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 12 Hình 3.1. Trình bày qui trình nghiên cứu tổng quát .30 Hình 3.2. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu chính 31 Hình 3.3. Giao diện trên trang NCBI với từ khóa honeybee 32 Hình 3.4. Cú pháp thực thi của EST_TRIMMER 35 Hình 3.5. Cú pháp thực thi của MISA 36 Hình 3.6. Giao diện của Primer3 38 Hình 3.7. Giao diện của PrimerQuest .40 Hình 3.8. Giao diện của PDA .40 Hình 3.9. Giao diện của DNAClub 41 Hình 4.1. Kết quả tìm thấy EST trên NCBI .42 Hình 4.2. Kết quả download với tùy chọn có sẵn của NCBI .43 Hình 4.3. Kết quả thực thi 4 tác vụ của EST_TRIMMER .45 Hình 4.4. File chứa kết quả trình tự EST đƣợc chọn 45 Hình 4.5. File định dạng FASTA .45 Hình 4.6. Thể hiện kết quả thực thi của MISA 46 Hình 4.7. Kết quả của file new_ids170404 49 Hình 4.8. Kết quả trình diễn của ssrout170404 50 Hình 4.9. Kết quả trình diễn của labdbout170404 50 Hình 4.10. Xuất kết quả các thông số thiết lập từ script 51 Hình 4.11. Trình bày primer đƣợc thiết kế .51 [...]... làm cho công việc nghiên cứu trở nên dễ dàng và chính xác hơn rất nhiều Bioinformatic là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê và khoa học máy tính để giải quyết các vấn đề sinh học Trên cơ sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: Khai thác dữ liệu EST (Expressed Sequence Tags) nhằm phát hiện microsatellite phục vụ cho công tác so sánh và phân tích. .. phân tích đặc điểm di truyền của ong mật 2 Đề tài đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS Bùi Minh Trí Đối tƣợng nghiên cứu là các loài ong cho mật 1.2 Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp nhận di n marker microsatellite từ dữ liệu EST có tìm thấy microsatellite của các loài ong cho mật - Thiết kế đƣợc primer từ hai vùng bảo tồn của microsatellite cho việc... tự microsatellite đặc trƣng nhất - So sánh lựa chọn, thiết kế đƣợc các công cụ tin học phù hợp nhất cho công việc nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu - Tập hợp đƣợc toàn bộ và nhanh nhất dữ liệu EST hiện có của các loài ong mật để cho xác suất tìm thấy microsatellite là lớn nhất - Phải có phƣơng pháp nhanh nhất trong việc xác định và phân loại microsatellite có trong các EST - Xây dựng đƣợc một qui trình trong... trong công tác phân tích và so sánh đặc điểm di truyền của các loài Sự đa hình của SSR đƣợc xác định bằng phƣơng pháp PCR với 13 mồi đƣợc thiết kế ở vùng bảo tồn hai bên SSR (flanking regions) trên cơ sở sự khác nhau về kích thƣớc của các băng khi điện di của trình tự lặp lại 2.3.4 Marker phân tử (molecular marker) Chỉ thị phân tử là những đặc điểm thể hiện ở khía cạnh hoá học hay cấu trúc phân tử di. .. các cá thể, đàn ong có thể giữ đƣợc nhiệt độ tối ƣu trong tổ, thu đƣợc nhiều mật và phấn hoa, bảo vệ tổ chống kẻ thù và phát triển Mỗi đàn ong có những đặc điểm cá thể riêng: mùi đặc thù, khả năng khai thác mật và tiết sáp, khả năng chia đàn, sức chống bệnh truyền nhiễm… 7 Đàn ong chỉ sống và phát triển khi có đủ các thành phần Mỗi cá thể trong đàn (ong chúa, ong thợ, ong đực) thực hiện một chức năng... vệ “thuần khiết” đặc điểm di truyền ban đầu của mỗi loài ong Hiện nay, marker microsatellite là một chọn lựa tốt trong việc phân tích sự đa dạng di truyền, lập bản đồ di truyền, nhận biết giữa các loài và các cá thể trong một loài Dựa trên nguồn dữ liệu EST (Expressed Sequence Tags) chúng ta có thể tìm ra đƣơc những vị trí microsatellite có ở trên các EST một cách nhanh chóng nhờ vào lĩnh vực nghiên... marker SSR? Hiện nay marker SSR là một công cụ mạnh (powerful tool) đƣợc ứng dụng rộng rải trong việc lập bản đồ bộ gen của các loài; phân tích đặc điểm di truyền của các loài, dƣới loài và các cá thể trong một loài phục vụ có hiệu quả cho công tác chọn giống trong chăn nuôi và trồng trọt; tìm hiểu về nguồn gốc và phân lập các gen gây bệnh (các gen có liên quan đến bệnh Alzheimer, ung thƣ ruột kết và nhiều... năng nhất định theo hƣớng bảo tồn và kéo dài cuộc sống của cả đàn Ong chúa: ong chúa làm nhiệm vụ đẻ trứng Ong thợ: ong thợ làm nhiệm vụ nuôi ấu trùng, lấy mật và phấn hoa, xây bánh tổ, điều chỉnh nhiệt độ, làm sạch tổ, bảo vệ tổ, chăm sóc ong chúa… Ong đực: nhiệm vụ của ong đực là giao phối với ong chúa tơ 2.1.3 Yêu cầu dinh dƣỡng của ong Khẩu phần ăn tự nhiên của ong mật trƣởng thành phải có: protein... dụng để lập bản đồ di truyền Chúng dễ dàng sử dụng và chứa đựng thông tin cao có thể thay thế tốt cho RFLP trong kỹ thuật lập bản đồ di truyền ở ngƣời (Dib và ctv., 1996) Sự phát triển SSR trong thực vật là rất nhanh, và vị trí SSR hiện giờ đƣợc hợp nhất để thành lập bản đồ di truyền của tất cả các loài ngũ cốc (Liu và ctv., 1996; Korzun và ctv., 1997; Smith và ctv., 1997; Stephenson và ctv., 1998) SSR... nguồn dinh dƣỡng này trong khẩu phần ăn phải đƣợc xác định rõ tỉ lệ về số lƣợng và chất lƣợng để đạt đƣợc mức dinh dƣỡng cao nhất 2.1.4 Các sản phẩm của ong mật 2.1.4.1 Mật ong Thành phần mật ong có trên 65% dạng đƣờng khử gồm glucose và fructose, còn saccharose ít, chỉ có khoảng 5% Ngoài ra trong quá trình luyện mật hoa, con ong còn tiết ra một số acid hữu cơ có tác dụng làm cho đƣờng trong mật ong . KHAI THÁC DỮ LIỆU EST (Expressed Sequence Tags) NHẰM PHÁT HIỆN MICROSATELLITE PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM DI. Sequence Tags) nhằm phát hiện microsatellite phục vụ cho công tác so sánh và phân tích đặc điểm di truyền của ong mật 2 Đề tài đƣợc thực hiện dƣới