Xây dựng cơ sở dữ liệu gen 16S và 23S rRNA ở vi khuẩn để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ

BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ

• Sơ lƣợc về bệnh viêm màng não mủ 1. Định nghĩa
• Các triệu chứng biểu hiện lâm sàng của bệnh 1. Những triệu chứng giai đoạn khởi phát

Một số vi trùng ở trong máu đi vào màng não cũng có thể có nguồn gốc từ viêm nội tâm mạc, viêm phổi, viêm tắc tĩnh mạch hoặc cũng có thể xâm nhập trực tiếp từ các ổ viêm xoang, viêm tai giữa, viêm mũi. Trẻ sơ sinh dễ bị nhiễm các loại vi khuẩn có mặt thường xuyên trong âm đạo hay trực tràng người mẹ (Escherichia coli) hoặc từ đường tiết niệu của người mẹ (Listeria monocytogenes) khi màng ối bị vỡ. Viêm màng não tái phát nhiều lần xảy ra ở những bệnh nhân có khuyết tật cơ thể học (rạn nứt hộp sọ trong những trường hợp tiền căn chấn thương sọ não, rò rỉ dịch não tủy…) do những ổ viêm kế cận tồn tại (viêm xoang, viêm tai…) hoặc do giảm miễn dịch cơ thể.

Bệnh viêm màng não nói chung (bao gồm cả viêm màng não mủ) xảy ra ở tất cả các nơi trên thế giới nhưng những trận dịch lớn nhất và thường xuyên lặp lại là ở vùng bán khô cằn của vùng cận sa mạc Sahara, châu Phi.

VI KHUẨN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ

Các yếu tố nguy cơ là viêm xoang, viêm tai giữa, viêm nắp thanh quản, viêm phổi, bệnh tiểu đường, suy giảm miễn dịch sau khi cắt lách, chấn thương đầu có thoát dịch não tủy. – Staphylococci (tụ cầu). epidermidis là căn nguyên chủ yếu ở bệnh nhân có lỗ thông dịch não tủy. aureus) thường gặp trong giai đoạn sớm sau phẫu thuật thần kinh, hoặc sau chấn thương có rò dịch não tủy. Các điều kiện thuận lợi cho viêm màng não mủ do Nocardia spp nhƣ dùng thuốc miễn dịch, u ác tính, chấn thương đầu và hệ thần kinh trung ương, mụn mủ viêm mãn tính, bệnh sarcom.

Viêm màng não mủ do vi khuẩn kỵ khí thường có điều kiện như: viêm tai, viêm xoang, viêm họng, áp xe não, nhiễm khuẩn vết thương sau chấn thương và sau phẩu thuật thần kinh.

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng

• Phương pháp sinh hoá

Các loài vi khuẩn này (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa…) đang trở thành căn nguyên quan trọng với tỷ lệ tử vong tương đối cao. Phương pháp chụp cắt lớp điện toán – CT sọ não không có ích cho chẩn đoán nhƣng có thể chỉ định cho bệnh nhân cứ sốt dai dẳng, có biểu hiện tăng áp lực nội sọ, liệt khu trú, co giật, vòng đầu to, rối loạn thần kinh kéo dài, hoặc kết quả cấy và các thông số của dịch não tủy bất thường kéo dài để xác định biến chứng. Đặc biệt ở bệnh nhân viêm màng não mủ do vỡ nền sọ có thoát dịch não tủy, chụp CT có thể phát hiện mức độ khí – dịch, độ mờ của xoang mũi hoặc khí nội sọ.

Phương pháp này có nhiều ưu điểm như độ nhạy, độ chính xác cao, cho phép phát hiện trực tiếp và chính xác vi khuẩn gây bệnh trong thời gian ngắn, kĩ thuật thao tác đơn giản và nhanh chóng trên một lƣợng dịch não tủy ban đầu ít.

KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ

• Seminested PCR/ multiplex PCR 1. Seminested PCR

Kỹ thuật này đƣợc thử nghiệm thành công vào năm 1988 và từ đó đã đƣợc áp dụng thành công trong nhiều công trình nghiên cứu về các biến đổi di truyền ở người cũng nhƣ nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác. Do đó, những trình tự này rất phù hợp với mục đích thiết kế mồi nhằm phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn và các kỹ thuật chẩn đoán dựa vào kỹ thuật PCR ngày càng đƣợc phát triển với mục đích tăng độ nhạy của phản ứng. Kỹ thuật tiếp tục được nhóm nghiên cứu phát triển (năm 1998) để phát hiện đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ trong dịch não tủy nhƣ Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae và Listeria monocytogenes.

Tương tự các công trình nghiên cứu trước, Jang – Jih Lu và các cộng sự vào năm 2000 cũng đã thiết lập một cặp mồi chung trên gene 16S rRNA cho các loài vi khuẩn Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis để thiết lập phản ứng PCR nhân bản đoạn có kích thước 996 bp.

GENE 16S rRNA VÀ 23S rRNA

Chẳng hạn một vài ribonucleotide ở gần đầu 3‟ của 16S rRNA là điểm bắt cặp với các nucleotide (trình tự Shine – Dalgarno) trên phân tử RNA thông tin (mRNA) để ribosome có thể gắn vào RNA thông tin và tiến hành tổng hợp chuỗi polypeptide. Trước đây, trong nhiều công trình nghiên cứu, trình tự DNA đích đƣợc nhân trong kỹ thuật PCR liên quan đến các gene gây bệnh đặc hiệu cho tác nhân, nhƣ gene protease A (Kuritza & Oehler, 1991) hay gene dhps (dihydropteroate synthase) (Salo & cs, 1995) nhằm phát hiện N. Việc lựa chọn và sử dụng phối hợp consensus primer nằm trong các vùng bảo tồn và các primer đặc hiệu trong các vùng biến động sẽ cho phép phát hiện sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh nói chung đồng thời xác định đƣợc tên của vi khuẩn.

Công trình trên đƣợc hoàn thiện bởi Backman & cs, (1999) nhằm hạn chế các kết quả âm tính giả do tác động ức chế của các tạp chất có mặt trong bệnh phẩm hoặc dương tính giả do sự ngoại nhiễm, đồng thời bổ sung thêm primer đặc hiệu để tăng phổ phát hiện của qui trình.

ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ BẰNG KHÁNG SINH

Theo đó, có thể thiết kế mồi chung (universal primer) dựa trên vùng bảo tồn và mồi chuyên biệt (specific primer) dựa trên vùng biến động của trình tự 23S rRNA để phân biệt đƣợc các nhóm vi khuẩn gây viêm màng não. Haemophilus influenzae và Streptococcus pneumoniae cho hai băng khi sử dụng phương pháp PCR kết hợp mồi chung và mồi chuyên biệt. Nhƣ vậy ta có thể định danh và định lƣợng vi khuẩn có trong dịch não tủy của bệnh nhân chỉ trong một thời gian ngắn (< 3 giờ).

Việc thiết kế các universal primer mới để khuếch đại vùng 23S rRNA là rất hữu ích trong chẩn đoán các vi khuẩn kháng thuốc.

PHƯƠNG PHÁP VÀ CHƯƠNG TRÌNH SỬ DỤNG

• CÁC CHƯƠNG TRÌNH VÀ NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH ĐƯỢC SỬ DỤNG 1. Hệ điều hành
• PHƯƠNG PHÁP

Thuật toán của BLAST xuất phát từ ý tưởng “liệu trong ngân hàng dữ liệu (bao gồm cả CSDL cục bộ và những CSDL lớn trên thế giới nhƣ GenBank, EMBL…) có trình tự nào giống hoặc gần giống với trình tự đang quan tâm”. Mối quan hệ của các thông tin này là: một sinh vật có thể có nhiều gene (mỗi trình tự thì chỉ có một accession number) và một sinh vật có những đặc điểm (phân loại…) riêng biệt. Chúng tôi sử dụng trình tự của gene 16S và 23S rRNA để thiết kế mồi thông qua chương trình thiết kế mồi Primrose, cụ thể để phát hiện Streptococcus pneumoniae (tác nhân chiếm khoảng 17%) trong nhóm các vi khuẩn viêm màng não mủ.

– Tạo mồi: chúng ta xác định các thông số nhƣ chiều dài mồi, số base đƣợc cho phép biến đổi trong mồi…Chọn thẻ “Find oligonucleotide” để chương trình tìm ra các mồi có thể có.

Danh sách các mồi thiết kế được trên 16S rRNA

Xác định các thông số cho mồi và số lượng mồi được tạo ra trên trình tự đích 16S rRNA. Chương trình sẽ loại bỏ các mồi bắt cặp với trình tự ngoài trình tự đích và trình bày danh sách các mồi thích hợp. Nhấp đúp chuột vào trình tự từng mồi để biết đƣợc các thông tin chi tiết nhƣ vị trí bắt cặp của mồi trên trình tự đích, số base trong mồi không bắt cặp (mismatch)….

Vị trí bắt cặp của mồi ngược trên trình tự đích 16S rRNA Kiểm tra lại sự bắt cặp của cặp mồi này trên trình tự đích.

Kiểm tra sự bắt cặp của mồi ngược và mồi xuôi trên trình tự đích 16S rRNA

– Xác định trình tự đích: tương tự như ở gene 16S rRNA ta chọn trình tự gene 23S rRNA ở Streptococcus pneumoniae. Sau khi kiểm tra loại bỏ các mồi bắt cặp với trình tự ngoài trình tự đích (gene 23S rRNA ở Streptococcus pneumoniae) ta có danh sách các mồi phù hợp. Kiểm tra lại sự bắt cặp của cặp mồi tổ hợp với trình tự đích (gene 23S rRNA trên Streptococcus pneumoniae).

Sử dụng chương trình TmCheck đi kèm trong Primrose để tính nhiệt độ nóng chảy của mồi theo phương pháp “Nearest Neighbour”.