Tạo bào tử bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - BÙI THU THỦY TẠO BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS BIỂU HIỆN STREPTAVIDIN GẮN KHÁNG THỂ BIOTINYL HÓA KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bùi Thu Thủy TẠO BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS BIỂU HIỆN STREPTAVIDIN GẮN KHÁNG THỂ BIOTINYL HĨA KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ VÂN ANH Hà Nội - 2011 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH i BẢNG VIẾT TẮT iv MỞ ĐẦU .1 Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ 1.1.1 Nội bào tử vi khuẩn 1.1.2 Bào tử Bacillus subtilis .4 1.2 STREPTAVIDIN .10 1.2.1 Giới thiệu chung streptavidin .10 1.2.2 Cấu trúc streptavidin 11 1.2.3 Cấu tạo biotin 11 1.2.4 Tƣơng tác streptavidin-biotin 12 1.2.5 Thiết kế trạng thái đơn hóa trị streptavidin với vị trí gắn biotin .13 1.3 VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM 15 1.3.1 Giới thiệu chung bệnh đốm trắng tôm virus gây bệnh đốm trắng 15 1.3.2 Protein vỏ VP28 virus WSSV 17 1.3.3 Các phƣơng pháp phát virus gây bệnh đốm trắng tôm 17 1.3.4 Bào tử B subtilis biểu streptavidin bề mặt (bào tử-strep) ứng dụng 18 1.4 PHẢN ỨNG NGƢNG KẾT MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG 19 Chƣơng II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21 2.1 NGUYÊN LIỆU 21 2.1.1 Chủng vi khuẩn .21 2.1.2 Các kit 21 2.1.3 Các cặp mồi .21 2.1.4 Mẫu tôm sú nhiễm bệnh đốm trắng 22 2.1.5 Các nguyên liệu khác 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP 23 2.2.1 Tách chiết ADN hệ gen từ vi khuẩn Gram dƣơng 23 2.2.2 Tách chiết plasmid từ vi khuẩn .23 2.2.3 Tách chiết ADN hệ gen virus từ mẫu tôm nhiễm WSSV .24 Khóa 2009-2011 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y 2.2.4 Nhân đoạn gen đích đặc hiệu kỹ thuật PCR 24 2.2.5 Nhân dòng đoạn gen đích vào vector pCR 2.1 25 2.2.6 Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E coli chủng DH5 25 2.2.7 Xử lý plasmid cặp enzyme giới hạn 26 2.2.8 Phản ứng gắn đoạn gen đích (insert) vào vector T4 ADN ligase 26 2.2.9 Dung hợp đoạn gen đích vào ADN hệ gen Bacillus subtilis chủng PY79 27 2.2.10 Kiểm tra có mặt đoạn gen đích ADN hệ gen B subtilis 27 2.2.11 Nuôi cấy tạo bào tử 28 2.2.12 Kiểm tra biểu protein dung hợp phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 28 2.2.13 Biotinyl hóa kháng thể kháng VP28 .30 2.2.14 Gắn kháng thể kháng VP28 đƣợc biotinyl hóa lên bào tử-strep .30 2.2.15 Nhuộm màu bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl 31 2.2.15 Thu dịch nghiền có chứa virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm sú nhiễm bệnh 31 2.2.16 Phản ứng ngƣng kết thụ động ngƣợc (Reverse passive latex agglutination) 31 2.2.17 Định lƣợng số copies WSSV kỹ thuật PCR thời điểm (Realtime PCR) 31 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN STREPTAVIDIN VÀO VECTOR PDG364 COTB VÀ DUNG HỢP VÀO HỆ GEN B subtilis .33 3.1.1 Nhân đoạn gen mã hóa cotB streptavidin phƣơng pháp PCR Để thu đƣợc lƣợng lớn đoạn gen mã hóa cho streptavidin từ nguồn ADN hệ gen Streptomyces avidinii cotB từ ADN hệ gen B subtilis tiến hành thực phản ứng PCR với chu trình nhiệt cho đoạn gen nhƣ sau: .33 3.1.2 Nhân dòng đoạn gen cotB vào vector pDG364 .35 3.1.3 Nhân dòng đoạn gen streptavidin vào vector pDG364 cotB 37 3.1.4 Đƣa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin vector vào hệ gen B subtilis 40 3.2 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN PROTEIN DUNG HỢP COTBSTREPTAVIDIN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ B subtilis 42 3.2.1 Kiểm tra khả tạo bào tử tế bào B subtilis tái tổ hợp 42 3.2.2 Kiểm tra biểu cotB-streptavidin bào tử phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch 43 Khóa 2009-2011 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y 3.3 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ LIÊN KẾT CỦA BÀO TỬ-STREP VỚI KHÁNG THỂ KHÁNG VP28-BIOTINYL 44 3.3.1 Đánh giá mức độ liên kết bào tử-strep với kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl 45 3.3.2 Đánh giá số phân ly phức hệ bào tử-strep- kháng thể kháng VP28-biotinyl 48 3.4 PHẢN ỨNG NGƢNG KẾT MIỄN DỊCH THỤ ĐỘNG KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM WSSV 50 3.4.1 Xác định nồng độ virus dịch nghiền Realtime PCR .51 3.4.2 Đánh giá khả hình thành ngƣng kết bào tử-strep gắn kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl với dịch nghiền tôm nhiễm WSSV 54 3.4.3 Đánh giá khả hình thành phản ứng ngƣng kết bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl với nồng độ virus pha loãng 56 HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 I TÀI LIỆU TRONG NƢỚC 61 II TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 61 Khóa 2009-2011 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình Hình ảnh hiển vi điện tử quét bào tử Bacillus subtilis Hình Hình dạng ngồi nội bào tử B subtilis Hình Cấu tạo nội bào tử B subtilis Hình Chu kỳ sống bào tử Hình Ảnh điện di SDS-PAGE số protein lớp áo bào tử Hình Trình tự axit amin cotB với trình tự lặp lại liên tiếp đƣợc gạch chân gồm 27 axit amin giàu serine Hình Hệ thống biểu bề mặt bào tử sử dụng protein lớp áo bào tử Hình Trình tự gồm 183 axit amin streptavidin 11 Hình Cấu trúc không gian Streptavidin với tiểu phần giống 11 Hình 10 Cơng thức cấu tạo cấu hình khơng gian biotin 12 Hình 11 Tƣơng tác phân tử trytophan với biotin 12 Hình 12 Mạng lƣới liên kết hydro vùng tƣơng tác streptavidin với biotin 13 Hình 13 Cấu trúc thịng lọng (loop) streptavidin 13 Hình 14 Streptavidin dạng đơn hóa trị 14 Hình 15 Tơm bị bệnh đốm trắng với đốm trắng xuất đầu 15 Hình 16 Virus gây bệnh đốm trắng tơm 16 Hình 17 Phản ứng ngƣng kết hồng cầu 19 Hình 18 Phƣơng thức chèn gen dung hợp vào ADN hệ gen B Subtilis 27 Hình 19 Sơ đồ vector pDG364 21 Hình 20 Sơ đồ tóm tắt bƣớc tạo vector tái tổ hợp pDG 364 cotB streptavidin 32 Hình 21 Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen streptavidin cotB 33 Khóa 2009-2011 i Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Hình Bùi Thu Thủ y Tên hình Trang Hình 22 Kết điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn vector pDG364 35 Hình 23 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lạc cặp mồi 364Fw/Rv 36 Hình 24 Kết điện di sản phẩm sau tinh gel streptavidin pDG 364 cotB 37 Hình 25 Kết điện di sản phẩm PCR kiể m tra các khuẩ n la ̣c bằ ng că ̣p mờ i vector pDG 364 38 Hình 26 Kết điện di sản phẩ m PCR ki ểm tra thể tái tổ hợp cặp mồi 39 Hình 27 Kết điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn vector tái tổ hợp pDG364 cotB-streptavidin 40 Hình 28 Xƣ̉ lý enzyme giới ̣n cho pDG364-cotB-streptavidin 41 Hình 29 Kiểm tra có mặt gen dung hợp ADN hệ gen Bacillus subtilis 42 Hình 30 Bào tử quan sát dƣới kính hiển vi laser quét 43 Hình 31 Kết thẩm tách miễn dịch kiểm tra biểu protein dung hợp 44 Hình 32 Kiểm tra khả gắn bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa dịng 45 Hình 33 Mẫu bào tử-strep gắn với kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl sau tháng bảo quản 46 Hình 34 Kiểm tra khả gắn bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa dịng 47 Hình 35 Biểu đồ thể lƣợng kháng thể kháng VP28-biotinyl hấp phụ bào tử-strep nồng độ kháng thể khác 49 Hình 36 Hình dạng ngƣng kết 51 Hình 37 Kiểm tra có mặt virus mẫu dịch nghiền 52 Hình 38 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra WSSV nồng độ pha loãng 52 Khóa 2009-2011 ii Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Hình 39 Kết realtime xác đinh số copies dung dịch virus nồng độ pha lỗng 54 Hình 40 Kiểm tra khả hình thành phản ứng ngƣng kết bào tử 55 Hình 41 Phản ứng ngƣng kết bào tử-strep-kháng thể kháng VP28 đa dòng với nồng độ WSSV pha lỗng 57 Hình 42 Phản ứng ngƣng kết bào tử-strep-kháng thể đơn dòng kháng VP28- biotinyl với nồng độ virus pha lỗng 59 Khóa 2009-2011 iii Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y BẢNG VIẾT TẮT APS Ammonium Persulphate BSA Albumin huyết bò (Bovine Serum Albumin) CBB Coomassie Blue Brillant dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid kDa Kilodalton LB Luria Bertani PAGE Điện di gel polyacrylamide (Polyarylamide Gel Electrophoresis) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) PMSF Phenyl Methylsulphonyl Fluoride PVDF Polyvinylidere Fluoride RPLA Phản ứng ngƣng kết thụ động ngƣợc ( Reverse Passive Latex Agglutination) SDS Sodium Dodecyl Sulphate TEMED N, N, N’, N’-Tetramethyl-Ethylenediamine WSSV Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus) Khóa 2009-2011 iv Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y MỞ ĐẦU Bào tử Bacillus subtilis đối tƣợng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nhờ tính chất bền nhiệt, không độc hại, đặc biệt nhấ t là các cơng trình nghiên cứu hệ thống biểu protein bề mặt bào tử Hệ thống biểu sử dụng protein lớp áo bào tử làm yếu tố dung hơ ̣p, gắ n với mô ̣t protein ngoa ̣i lai nhằ m biể u hiê ̣n protein này bề mă ̣ t bào tử Protein ngoa ̣i lai kháng nguyên hay các protein làm đầ u dò v.v Nhƣ̃ng ƣ́ng du ̣ng của ̣ thố ng này trải rô ̣ng nhiề u liñ h vƣ̣c , nổ i bâ ̣t nhấ t là tiề m ta ̣o thế ̣ vaccine mới có thể sƣ̉ du ̣ng qua đƣờng uố ng hay đƣờng mũi, hay ta ̣o các chấ t hoa ̣t hóa sinh ho ̣c, chấ t bám dính sinh ho ̣c v.v Streptavidin tƣ̀ lâu đã đƣơ ̣c ngƣời biế t đế n rấ t nhiề u ƣ́ng du ̣ng quan tro ̣ng chủ yế u thuô ̣c liñ h vƣ̣c Hóa sinh học Sinh y ho ̣c, liên quan đế n khả liên kế t đă ̣c biê ̣t của nó với biotin với phân tử đƣợc biotinyl hóa Bào tử Bacillus subtilis biể u hiê ̣n streptavidin bề mă ̣t (gọi tắt bào tửstrep) hƣ́a he ̣n đem la ̣i nhi ều tiề m ƣ́n g du ̣ng Bào tử-strep đƣợc sử dụng nhƣ chất mang “đa dụng” nhờ khả gắn với phân tử đƣợc biotinyl hóa với nhiều ƣu điểm nhƣ bền nhiệt, bền với tác nhân lý hóa học, kích thƣớc đồng cỡ micromet, hy vọng có khả “chuyên chở” kháng nguyên vi sinh vật, enzyme, kháng thể để phục vụ cho mục đích phân tích hay ứng dụng khác Virus gây bệnh đốm trắng tôm (WSSV) loại virus gây bệnh nghiêm trọng phổ biến tôm nuôi, nguyên nhân chủ yếu gây tổn hại kinh tế lớn ngành cơng nghiệp tơm tồn giới Hiện nay, chƣa có biện pháp chữa trị hữu hiệu bệnh bệnh virus WSSV gây Do vậy, phát sớm virus gây bệnh đóng vai trị quan trọng then chốt việc phòng ngừa bệnh virus đốm trắng gây Rất nhiều phƣơng pháp đƣợcsử dụng để phát có mặt WSSV tơm giống hay ao ni nhƣ PCR, hóa mơ miễn dịch, que thử nhanh Tuy nhiên phƣơng pháp phù hợp điều kiện phịng thí nghiệm nên khơng thuận tiện cho việc xét nghiệm nhanh thực địa (nhƣ đầm, ao nuôi ) đồng thời giá thành xét nghiệm cao Khóa 2009-2011 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Đặt m2 = RS x C [S]= m2 - y Và mo nồng độ kháng thể cho vào ban đầu [A] = mo-y Thay vào cơng thức (1): KbSA = y = với Kd số phân ly phức hệ [m2  y ].[mo  y ] Kd Đặt Kd = m1 Phƣơng trình thu đƣợc là: [m2 –y] [mo – y] = y.m1 y2 – (mo + m1 + m2 ).y + m2mo = Giải hệ phƣơng trình bậc hai này, giá trị y thu đƣợc nhƣ sau: y= mo  m1  m2  mo  m1  m2   4m2mo Kết hợp với số liệu tính tốn phần mềm Scion Image thu đƣợc trên, sử dụng phần mềm Kaleida Graph để dựng đƣờng chuẩn dựa phƣơng trình tính tốn phù hợp với số liệu thực nghiệm, thu đƣợc kết nhƣ hình 35 KbSA = 1/m1 = 1/3500 = 0.00028 = 2,8 x 10 5/M RsC = m2 = 64(nM) C=1.6 x 10 -3nM; R=4 x 104/spore Y=0.5*((m0+m1+m2)-((m0+m1+m2)^2-4*m2*m0)^0.5) 100 10 y = 0.5*((m0+3500+64)-((m0+3 Value 7.8923 0.98048 Chisq R 100 1000 Error NA NA 10 Initial anti-VP28 IgG concentration (nM) Hình 35 : Biểu đồ thể lƣợng kháng thể kháng VP28-biotinyl hấp phụ bào tử-strep nồng độ kháng thể khác Khóa 2009-2011 49 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Từ đƣờng chuẩn (với độ tin cậy R= 0,98), chúng tơi tính đƣợc giá trị Kb(C-S) lƣợng kháng thể kháng VP28-biotinyl hấp phụ bào tử, cụ thể là:  KbSA =1/m1 = 1/3500 = 0.0028 (nM) = 2,8x105/M  RSxC = m2 = 64 (nM) Với nồng độ 109 bào tử/100 µl C = 16x10-4 (nM) số lƣợng phân tử streptavidin biểu bào tử có khả tƣơng tác với kháng thể-biotinyl RS = 4x104 phân tử/bào tử Trên lý thuyết, số liên kết streptavidin dạng tetramer với biotin đạt tới 1015/M, kết chúng tơi tính tốn đƣợc dựa thực nghiệm số liên kết streptavidin dạng monomer đƣợc biểu dƣới dạng dung hợp với cotB bề mặt bào tử với kháng thể kháng VP28-biotinyl hóa 2,8x105/M, tức giảm 3x109 lần so với dạng tetramer Mặc dù yếu tƣơng tác kháng nguyên-kháng thể với số phân ly thƣờng nằm khoảng 107109/M số bào tử-strep kháng thể-biotinyl mà thu đƣợc đủ để liên kết streptavidin-biotin bề mặt bào tử đặc hiệu bền vững so với liên kết khác nhƣ liên kết kị nƣớc Kết thu đƣợc sở để ứng dụng bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl phản ứng ngƣng kết phát có mặt virus gây bệnh đốm trắng 3.4 PHẢN ỨNG NGƢNG KẾT MIỄN DỊCH THỤ ĐỘNG KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM WSSV Trong nghiên cứu này, sử dụng bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl làm giá thể để phát có mặt kháng nguyên VP28 vỏ WSSV nhờ vào tƣơng tác kháng nguyên- kháng thể Liên kết chéo các kháng nguyên với kháng thể tạo thành mạng lƣới, sở hình thành nên ngƣng kết Do vậy, phản ứng ngƣng kết xảy ra, mạng lƣới bào tử-strep – kháng thể kháng VP28 biotinyl- virus đƣợc tạo thành vòng tròn ngƣng kết phân tán chiếm gần hết đáy giếng phản ứng Ngƣợc lại, phản ứng ngƣng kết không xảy ra, bào tử tập trung lại trung tâm đáy giếng phản ứng Ngoài ra, số trƣờng hợp dƣơng tính giả, bào tử vừa tập trung lại trung tâm giếng phản ứng, vừa tạo thành vòng tròn giống nhƣ ngƣng kết xung quanh (hình 36) Khóa 2009-2011 50 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Hình 36: Hình dạng ngƣng kết A Mẫu dƣơng tính B Mẫu âm tính C Mẫu dƣơng tính giả 3.4.1 Xác định nồng độ virus dịch nghiền Realtime PCR Với dung dịch virus pha lỗng, chúng tơi tiến hành tách chiết ADN kit Virus Magnet Nano Từ 250 µl dịch nghiền, chúng tơi thu đƣợc 50 µl sản phẩm ADN tinh µl thu đƣợc đƣợc làm khuôn cho phản ứng realtime PCR xác định số copies dung dịch virus nồng độ (hình 37) Với mẫu tơm đƣợc xác định nhiễm bệnh đốm trắng WSSV gây nên, tiến hành nghiền thu dịch chứa virus Để khẳng định chắc có mặt virus, mẫu dịch nghiền đƣợc tách chiết tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu đoạn gen mã hóa cho VP28 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhƣ sau: 940C : 30 giây 600C : 45 giây 720C : 30 giây x 35 chu kỳ Kết điện di sản phẩm PCR (hình 36) cho thấy, chúng tơi thu đƣợc băng có kích thƣớc 650 bp đoạn VP28 đƣờng chạy số Nhƣ vậy, mẫu dịch nghiền chúng tơi thu đƣợc có virus gây bệnh đốm trắng Khóa 2009-2011 51 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Hình 37: Kiểm tra có mặt virus mẫu dịch nghiền Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN kb Đường chạy 2: đối chứng (-) Đường chạy 3: mẫu dịch nghiền Đường chạy 4: đối chứng (+) Với kết kiểm tra thu đƣợc, chúng tối tiếp tục tiến hành pha loãng dung dịch virus theo tỷ lệ 1:4, 1:16 1:64 xác định nồng độ virus Realtime PCR Để làm đƣợc thí nghiệm này, 250µl dịch virus nồng độ gốc ban đầu nồng độ pha loãng đƣợc tiến hành tách chiết ADN song song Tiếp đó, 3µl tổng số 50µl ADN thu đƣợc, đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Realtime PCR Kết thu đƣợc nhƣ hình 38 39 Hình 38: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra WSSV nồng độ pha loãng Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN kb Đường chạy 2: Dịch WSSV pha loãng 1:4 Đường chạy 3: Dịch WSSV nồng độ gốc ban đầu Đường chạy 3: Dịch WSSV pha loãng 1:16 Đường chạy 4: Dịch WSSV pha loãng 1:64 Kết thu đƣợc hình 38 cho thấy, với hai nồng độ pha lỗng 1:16 1:64 PCR khơng phát đƣợc có mặt WSSV nồng độ virus ADN Khóa 2009-2011 52 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y tách chiết đƣợc từ mẫu dịch thấp Kết phù hợp với kết realtime PCR hình 38 5x108 5x107 5x106 WSSV 5x105 WSSV 1:4 Fluor Well Type Ident Rep Ct Log SQ SQ SQ SQ Ct Ct Mean SD Mean SD Set Point SYBR E02 Unkn Wssv 1:4 27.06 3.117 1.31E+03 1.31E+03 0.00E+00 27.06 N/A N/A SYBR E01 Unkn Wssv 1 23.37 4.055 1.14E+04 1.14E+04 0.00E+00 23.37 N/A N/A SYBR C06 Std - 24.69 3.699 5.00E+03 5.00E+03 0.00E+00 24.69 N/A N/A SYBR C05 Std - 20.25 4.699 5.00E+04 5.00E+04 0.00E+00 20.25 N/A N/A SYBR C04 Std - 17.84 5.699 5.00E+05 5.00E+05 0.00E+00 17.84 N/A N/A SYBR C03 Std - 12.88 6.699 5.00E+06 5.00E+06 0.00E+00 12.88 N/A N/A SYBR C02 Std - 9.35 7.699 5.00E+07 5.00E+07 0.00E+00 9.35 N/A N/A SYBR C01 Std - 4.73 8.699 5.00E+08 5.00E+08 0.00E+00 4.73 N/A N/A Hình 39: Kết realtime xác đinh số copies dung dịch virus nồng độ pha lỗng Khóa 2009-2011 53 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Từ kết thu đƣợc, chúng tơi tính đƣợc nồng độ virus nồng độ pha loãng nhƣ sau: Bảng 3: Số copies dung dịch WSSV Nồng độ pha lỗng Số copies/50µl Số copies/1ml WSSV ban đầu 3,8x104 copies 76x104 copies WSSV 1:4 4,3x103 copies 87x103 copies WSSV 1:16 - - WSSV 1:64 - - (-): xác định Với hai nồng độ pha loãng 1:16 1: 64, Realtime PCR xác định đƣợc số copies hàm lƣợng ADN thu đƣợc ít, không đủ để khuếch đại 3.4.2 Đánh giá khả hình thành ngƣng kết bào tử-strep gắn kháng thể đa dịng kháng VP28-biotinyl với dịch nghiền tơm nhiễm WSSV Để đánh giá đƣợc liệu bào tử-strep gắn khắng thể kháng VP28biotinyl đƣợc sử dụng nhƣ giá thể cho phản ứng ngƣng kết hay khơng, chúng tơi tiến hành thí nghiệm ủ bào tử gắn với kháng thể đa dịng biotinyl hóa với dịch nghiền chứa virus gây bệnh đốm trắng với dải nồng độ khác Bào tử đƣợc sử dụng thí nghiệm bào tử-strep đƣợc nhuộm xanh IC5PE-maleimide sau đƣợc gắn với kháng thể kháng VP28-biotinyl Bào tử B subtilis PY79 gắn với kháng thể đƣợc sử dụng thí nghiệm làm đối chứng âm Sau ủ nhiệt độ phòng, chúng tơi thu đƣợc kết nhƣ hình 40 Khóa 2009-2011 54 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Hình 40: Kiểm tra khả hình thành phản ứng ngƣng kết bào tử Hàng 1: 20µl dịch nghiền có chứa WSSV Hàng 2: 50µl dịch nghiền có chứa WSSV Hàng 3: 100µl dịch nghiền có chứa WSSV Hàng 4: 200µl dịch nghiền có chứa WSSV Cột A: 10 µl chứa 108 bào tử B subtilis PY79 ủ với 100µg kháng thể kháng VP28 Cột B: 10 µl chứa 108 bào tử-strep ủ với 10µg kháng thể kháng VP28 biotinyl Cột C: 10 µl chứa 108 bào tử-strep ủ với 50µg kháng thể kháng VP28 biotinyl Cột D: 10 µl chứa 108 bào tử-strep ủ với 100µg kháng thể kháng VP28 biotinyl Hình 40 cho thấy, hàng thứ 2, có khác biệt rõ rệt đối chứng âm mẫu bào tử B subtilis PY79 (cột A) với mẫu bào tử-strep (cột B, C, D) Sự ngƣng kết xảy rõ nét mẫu bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl với thể tích dịch nghiền 50µl với mẫu bào tử B subtilis PY79, ngƣng kết không xảy ra, bào tử tập trung thành cụm đáy giếng phản ứng Kết phù hợp với kết thẩm tách miễn dịch mà thu đƣợc đồng thời tái khẳng định mối liên kết không bền vững không đặc hiệu bào tử B subtilis PY79 với kháng thể đa dịng kháng VP28-biotinyl Bên cạnh đó, với dải thể tích dịch nghiền virus cho vào, quan sát thấy, với 20µl thể tích dịch nghiền (hàng 1) phản ứng ngƣng kết hầu nhƣ không xảy Nguyên nhân lƣợng virus dung dịch q để hình thành nên mạng lƣới kháng nguyên-kháng thể Do vậy, phản ứng ngƣng kết khơng xảy đƣợc Ngồi ra, với lƣợng thể tích dịch nghiền 100 µl 200 µl (hàng 3, 4) khó kiểm tra đƣợc phản ứng ngƣng kết có xảy hay khơng lƣợng thể tích q lớn, gây khó khăn cho quan sát Với kết này, chúng tơi định Khóa 2009-2011 55 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y chọn thể tích dịch nghiền 50 µl cho tồn thí nghiệm sau Đồng thời, phản ứng ngƣng kết xảy với bào tử-strep gắn 10 µg, 50 µg 100 µg kháng thể biotinyl hóa Tuy nhiên, kết hợp với kết western blot mục 3.3, để đảm bảo liên kết bào tử-strep với kháng thể kháng VP28-biotinyl bền vững, nồng độ kháng thể đƣợc chọn cho thí nghiệm sau 50 µg 3.4.3 Đánh giá khả hình thành phản ứng ngƣng kết bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl với nồng độ virus pha loãng Với kết thu đƣợc ban đầu, chúng tơi tiếp tục tiến hành thí nghiệm để xác định đƣợc nồng độ virus tối thiểu để ngƣng kết xảy Chúng tơi tiến hành thí nghiệm với dịch nghiền virus đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1:4, 1:16 1:64 xác định số copies WSSV 3.4.3.1 Phản ứng ngưng kết bào tử-strep gắn kháng thể đa dòng kháng VP28biotinyl với nồng độ virus pha lỗng Trong thí nghiệm này, 50 µl dịch virus với nồng độ pha loãng đƣợc ủ với bào tử-strep có gắn kháng thể đa dịng kháng VP28-biotinyl nồng độ 50 µg Hỗn hợp đƣợc ủ nhiệt độ phịng Hình 41 hình thành ngƣng kết theo thời gian Khóa 2009-2011 56 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Hình 41: Phản ứng ngƣng kết bào tử-strep-kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl với nồng độ WSSV pha loãng Giếng A: Đối chứng (-) Đệm NTE Giếng B: Dịch nghiền virus nồng độ ban đầu Giếng C: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:4 Giếng D: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:16 Giếng E: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:64 Giếng F: Đối chứng (-) Dịch nghiền tơm khơng nhiễm WSSV Kết hình 41 cho thấy, sau ủ nhiệt độ phòng, ngƣng kết bắt đầu xuất giếng phản ứng số (chứa dung dịch WSSV nồng độ gốc) Ngƣợc lại giếng đối chứng âm (giếng số 6) giếng chứa dung dịch virus pha loãng lần, 16 lần 64 lần bào tử-strep bắt đầu tập trung lại đáy giếng Sự khác biệt đƣợc thể rõ sau ủ, đặc biệt rõ nét thứ Nhƣ vậy, phản ứng ngƣng kết xuất giếng chứa nồng độ virus gốc, với giếng chứa WSSV pha lỗng 4, 16 64 lần ngƣng kết khơng xuất Hiện tƣợng đƣợc giải thích nồng độ virus Khóa 2009-2011 57 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y thấp, khơng đủ để hình thành mạng lƣới liên kết chéo kháng nguyên với kháng thể Do vậy, ngƣng kết không đƣợc tạo thành Để đảm bảo độ tin cậy thí nghiệm, chúng tơi tiến hành lặp lại thí nghiệm nhiều lần đƣờng kính ngƣng kết đƣợc đo lại để thuận lợi cho việc xác định xác kết mẫu kiểm tra sau Kết thu đƣợc bảng dƣới Bảng 4: Kết phản ứng ngƣng kết Đƣờng kính trung bình (mm) Mẫu Đƣờng kính ≥ 4,5 mm Đƣờng kính 3,9-4,5 mm Đƣờng kính ≤ 3,9 mm Dịch nghiền chứa WSSV ≥ 3,8x104 copies/ 50 µl 11 0 Dịch nghiền chứa WSSV ≤ 4,3x103 copies/ 50 µl 0 18 Âm tính (dịch nghiền tơm khơng nhiễm WSSV mẫu chứa đệm NTE) Số lƣợng Từ bảng kết trên, chúng tơi bƣớc đầu kết luận, mẫu cho đƣờng kính đƣờng kính ngƣng kết ≥ 4,5 mm mẫu dƣơng tính với số copies ≥ 104/ 50µl dịch nghiền Ngƣợc lại, mẫu cho đƣờng kính ≤ 3,9 mm mẫu âm tính mẫu chứa số copies WSSV ≤ 103/ 50µl dịch nghiền Ngồi ra, q trình thí nghiệm, số trƣờng hợp dƣơng tính giả xuất mẫu tơm khơng nhiễm WSSV, đƣờng kính ngƣng kết nằm khoảng 3,9-4,5 mm Kết dƣơng tính giả đƣợc giải thích tƣơng tác không đặc hiệu bào tử-strep gắn kháng thể với tạp chất có dịch nghiền tơm Bên cạnh đó, kết cho thấy phản ứng ngƣng kết cho phép phát có mặt WSSV nồng độ tối thiểu 3,8x104 copies, thấp khoảng 10 lần so với sử dụng kỹ thuật PCR (nồng độ thấp 4,3x103) 3.4.3.2 Phản ứng ngưng kết bào tử-strep gắn kháng thể đơn dòng kháng VP28-biotinyl với nồng độ virus pha loãng Dựa kết thu đƣợc sử dụng kháng thể đa dịng kháng VP28, chúng tơi tiếp tục tiến hành thí nghiệm tƣơng tự kháng thể đơn dịng kháng VP28 Trong thí nghiệm kháng thể đơn dịng, lƣợng kháng thể đƣợc Khóa 2009-2011 58 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y dùng để gắn với bào tử-strep 50µg Hình 42 kết phản ứng sau tiếng ủ bào tử-strep – kháng thể đơn dòng kháng VP28-biotinyl với dải nồng độ virus giảm dần Hình 42: Thử phản ứng ngƣng kết bào tử-strep-kháng thể đơn dòng kháng VP28- biotinyl với nồng độ virus pha loãng Giếng A: Đối chứng (-) đệm NTE Giếng B: Dịch nghiền virus nồng độ ban đầu Giếng C: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:4 Giếng D Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:16 Giếng E: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:64 Giếng F: Đối chứng (-) dịch nghiền tơm khơng nhiễm WSSV Kết hình 42 cho thấy ngƣng kết đƣợc hình thành rõ nét giếng phản ứng chứa virus nồng độ gốc (giếng 2) Trong đó, với mẫu đối chứng âm (giếng A F) mẫu virus pha loãng (giếng C, D, E), không quan sát thấy xuất ngƣng kết Nhƣ vậy, với kết thu đƣợc cho phép khẳng định bào tử-strep gắn kháng thể đơn dịng kháng VP28biotinyl hồn tồn sử dụng đƣợc làm giá thể cho phản ứng ngƣng kết thụ động ngƣợc để phát có mặt WSSV Khóa 2009-2011 59 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y KẾT LUẬN Với kết thu đƣợc q trình nghiên cứu nhƣ trên, chúng tơi xin đƣa số kết luận sau: Nhân dòng thành công gen streptavidin vào vector pDG364 cotB dung hợp thành công đoạn gen cotB-streptavidin vào ADN hệ gen Bacillus subtilis Biểu thành công protein dung hợp cotB-streptavidin bề mặt bào tử Bacillus subtilis Bào tử-strep gắn kết đặc hiệu bền vững với kháng thể đơn dòng đa dòng kháng VP28 đƣợc biotinyl hóa Bƣớc đầu ứng dụng đƣợc bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28biotinyl để phát có mặt virus gây bệnh đốm trắng nhờ phản ứng ngƣng kết Phƣơng pháp cho phép phát có mặt virus gây bệnh đốm trắng với nồng độ tối thiểu 3,8x104 copies, thấp khoảng 10 lần so với phƣơng pháp PCR HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Tiếp tục nghiên cứu để tối ƣu hóa điều kiện phản ứng ngƣng kết nhƣ giảm thời gian phản ứng ngƣng kết xuống giờ, tăng độ nhạy phản ứng hạn chế xuất kết dƣơng tính giả Khóa 2009-2011 60 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TRONG NƢỚC Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Giáo trình Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Đỗ Ngọc Liên (2008), Miễn dịch học sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Văn Ty (2001), Miễn dich học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội II TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI Argarana, C., Kuntz, I.D., Birken, S., Axel, R., Cantor, C.R (1986), “Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene”, Oxf J., 14, pp 1871-1882 Chaiet, L., Wolf, F.J (1964) “The Properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomycetes”, Arch Biochem Biophys., 106, pp 1-5 Chen, J., Jin, M., Yu, Z., Dan, H., Zhang, A., Song, Y., Chen H (2007), “Latex agglutination test for the rapid detection of avian influenza virus subtype H5N1 and its clinical application” , J Vet Diagn Invest., 19, pp 155–160 Daisuke, I., Ritsuko, K., Hiromu, T., Kazuhito, W (2011), “Proteins Involved in Formation of the Outermost Layer of Bacillus subtilis Spores”, J Bacteriol., 193, pp 4075-4080 Driks, A (1999), “Bacillus subtilis spore coat”, Microbiol Mol Biol Rev., 63, pp 1-20 Guohua, Y., Zhimin, W., Yipeng, Q (2004), “Vp28 of shrimp White Spot Syndrome Virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells”, J Biochem Mol Bio, 37, pp 726-734 10 Howarth, M., Chinnapen, D., Gerrow, K., Dorrestin, P., Grandy, M.R., Kelleher, N.L., El-Husseini, A., Ting, A.Y (2006), “A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site”, Nature methods, 3, pp 267-273 11 Isticato, R., Cangiano, G., Tran, H.T., Ciabattini, A., Medaglini, D., Oggioni, M.R., Felice, M.D., Pozzi, G., Ricca, E (2001), “Surface display of recobinant protein on Bacillus subtilis spore”, J Bacteriol., 183, pp 6294-6301 12 Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Lumlertdacha, B., Sitprija, V (2000), “Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test”, J.Clin Microbiol, 38, pp 3098-3099 Khóa 2009-2011 61 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y 13 Kim, J.H , Lee, C.S , Kim, B.G (2005), “Spore-displayed streptavidin: A live diagnostic tool in biotechnology”, Biochem Biophys Res Commun , 331, pp 210–214 14 Le, D.H., Huynh, H.A., Fairweather, N., Ricca, E., Cutting, S.M (2003), “Bacterial spore as vaccine vehicles”, Infect Immun., 71, pp 2810-2818 15 Ning, D., Leng, X., Li, Q (2011), “Surface-displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome virus in crayfish by oral administration, J Appl Microbiol, 111, pp 1364-5072 16 Ricca, E., Cutting, S.M (2003), “Emerging applications of bacterial spores in nanobiotechnology”, J Nanobiotechnol., 1, pp 6-16 17 Takekazu, O., Fumiko, N., Shuta, Y., Keisuke, Y., Norihisa, O., Kiyoshi, L., Hiroshi, O., Haruji, S (2004), “Detection of white spot syndrome virus from stomach tissue homogenate of the kuruma shrimp (Penaeus japonicus) by reverse passive latex agglutination”, J Virol Methods, 119, pp 11–16 18 Takekazu, O., Fumiko, N., Shuta, Y., Keisuke, Y., Norihisa, O., Kiyoshi, L., Hiroshi, O., Haruji, S (2005), Detection of white spot syndrome virus (WSSV) from hemolymph of Penaeid shrimps Penaeus japonicus by reverse passive latex agglutination assay using high-density latex particles, J Virol Methods, 124, pp 143–148 19 Valimaa, L (2008), Streptavidin- A versatile binding protein for solid-phase immunoassays, University of Turku, Finland 20 Witteveldt, J., Cifuentes Carolina, C., Vlak Just, M (2004), “Protection of Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination ”, J Virology, pp 2057-2061 21 Wu, S., Wong, S (2005), “Engineering soluble monomeric streptavidin with reversible biotin binding capability”, J Biol Chem., 280, pp 23225-23231 22 http://www.astrobio.net/exclusive/3184/wanted-easy-going-martianroommates 23 http://classes.midlandstech.com/carterp/courses/bio225/chap10/lecture3.htm 24 http://en.wikipedia.org/wiki/Biotin 25 http://extramarks.com/ask-exploreanswer/question/45525/science/what-isendospore-formation-expain-it/8/?pn=&prevsh= Khóa 2009-2011 62 Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y 26 http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/hydro.htm 27 http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/loops.html 28 http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/trypto.html 29 http://research.ncku.edu.tw/re/articles/e/20110916/3.html 30 http://sciencefilm.de/detail.php?id=215017&rubrik=Bio&lang=en&q=&qrub rik= 31 http://sonongnghiephatinh.gov.vn/vn/Recommendd.aspx?tabid=58 32 http://www.tansaoa.comdoc_viewer.aspxfileNameuploadfiledomtrang.pdf Khóa 2009-2011 63 ... virus gây bệnh đốm trắng tơm” với mục đích tạo bào tử- strep gắn kết bào tử với kháng thể kháng VP28 virus gây bệnh đốm trắng đƣợc biotinyl hóa nhằm phát có mặt virus đốm trắng mẫu tôm thông qua... việc biotinyl hóa kháng thể kháng VP28 (kháng thể kháng VP28 -biotinyl) gắn kết kháng thể kháng VP28 -biotinyl với bào tử- strep để bƣớc đầu ứng dụng chế tạo kit chẩn đoán virus gây bệnh đốm trắng tôm. .. chung bệnh đốm trắng tôm virus gây bệnh đốm trắng 15 1.3.2 Protein vỏ VP28 virus WSSV 17 1.3.3 Các phƣơng pháp phát virus gây bệnh đốm trắng tôm 17 1.3.4 Bào tử B subtilis biểu streptavidin