Tạo bào tử bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

To bào t Bacillus subtilis biu hin streptavidin gn kháng th biotinyl hóa kháng virus gây bnh m trng  tôm Bùi Thu Thy Tri hc T nhiên, Khoa Sinh hc LuChuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30 ng dn: TS. Nguyn Th Vân Anh o v: 2011 Abstract: Tng quan các v cn nghiên cu: bào t Bacillus subtilis và biu hin protein ngoi lai trên b mt bào t; Streptavidin; Virus gây bnh m trng  Tôm; Phn  t min dch và ng dng. Gii thiu nguyên li     u. Trình bày mt s kt qu nghiên cn gen Streptavidin vào vector PDG364 Cotb và dung hp vào h gen B -  biu hin protein dung hp Cotb  Streptavidin trên b mt bào t B -  liên kt ca bào t - strep vi kháng th kháng VP28-Biotinyl: Phn ng nt min dch th ng kim tra s có mt ca Virus gây bm trng trên tôm WSSV Keywords: Sinh hc thc nghim; Bào t; Kháng th; Virus; B m trng; Tôm Content I. Tổng quan Bào t Bacillus subtilis là mt trong nhng nghiên cc nhiu nhà khoa hc quan tâm nh tính cht bn nhic hc bi                        .   u hi      ,                      .                    .v                       ,                             ,             ,        v.v                HS  ,       t  c vi các phân t c biotinyl hóa.  Bacillus subtilis         (gi tt là bào t-strep)           . Bào t-strep có th c s dt cht mang ng” nh kh n vi phân t c biotinyl hóa vi nhin nhit, bn vi các tác nhân lý hóa hng nht c micromet, hy vng s có kh chuyên ch các kháng nguyên ca vi sinh vt, các enzyme, các kháng th  phc v cho các m hay ng dng khác nhau. Virus gây bm trng  tôm (WSSV) là loi virus gây bnh nghiêm trng và ph bin  tôm nuôi, là nguyên nhân ch yu gây ra nhng tn hi kinh t li vi ngành công nghip tôm trên toàn th gii. Hit bin pháp cha tr hu hiu nào i vi bnh bnh do virus WSSV gây ra. Do vy, phát hin sm virus gây b trò quan trng và then cht trong vic phòng nga b  m trng gây ra. Rt nhics d phát hin s có mt ca WSSV tôm ging hay ao n dch, que th nhanh. Tuy nhiên nh phù hu kin phòng thí nghim nên không thun tin cho vic xét nghim nhanh trên thm, ang thi giá thành xét nghit cao.         ,  Tạo bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” vi m to bào t-strep và gn kt bào t này vi kháng th kháng VP28 ca virus gây bm trc biotinyl hóa nhm phát hin s có mt cm trng trong mu tôm thông qua phn t. S c hình thành do mt mi liên kt chéo gia các kháng th trên b mt bào t-strep vi kháng nguyên VP28 trên v virus gây bm trc to thành. Cùng vc ký min d n, d dàng, và có th tin hành ngay ti rung nuôi. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu:  Các chng vi khun E. coli   hãng Invitrogen, chng vi khun Bacillus subtilis PY79, vi khun Streptomyces avidinii chn gen mã hóa cho streptavidin là quà tng ci hc Hoàng gia Holloway, London, Anh quc.  Các b kit tinh sch plasmid ca hãng Bioneer, kit tách ADN h gen t vi khun ca Qiagen, b kit tách ADN t virus: Virus Magnet Nano ca Phòng thí nghim Trm Công ngh Enzym và Protein và Trung tâm khoa hc Vt lii hc Khoa hc t nhiên  Các cp mc hin gen streptavidin, cotB, amyE front/back, VP28 cùng các hóa cht khác dùng cho sinh hc phân t 2.2. Phƣơng pháp:  Nghiên cu s dng mt s  PCR, x lý enzyme gii hn, bin np, n di proitein, thm tách min dch, làm phn t III. KẾT QUẢ 3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN STREPTAVIDIN, COTB VÀO VECTOR PDG364 VÀ DUNG HỢP VÀO HỆ GEN B. subtilis 3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa cotB và streptavidin bằng phƣơng pháp PCR Phn ng PCR nhân bn gen streptavidin và cotB vi chu trình nhit cho tng  i vn gen cotB: 94 0 C : 30 giây 65 0 C : 45 giây x 30 chu k 72 0 C : 1 phút i vn gen streptavidin 94 0 C : 30 giây 65 0 C : 45 giây x 30 chu k 72 0 C : 30 giây Kt qu n di trên gel agarose 1% (hình 1) cho th ADN kc khong 1,1 kb ca cotB (hình 1a) và  c khong 0,55 kb, ng vc ca streptavidin (hình 1b). Kt qu này chng t cp mc thit k iu kic chúng tôi la chn là phù hp cho vic nhân bn gen mã hóa streptavidin và cotB (a) (b) Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen cotB (a) và streptavidin (b) (a) Đường chạy 1: Thang chun ADN 1kb, Đường chạy 2: Sn phm PCR ca cotB t ADN h gen (b) Đường chạy 1: Thang chun ADN 1kb, Đường chạy 2: Sn phm PCR ca streptavidin t ADN h gen 3.1.2. Nhân dòng đoạn gen cotB vào vector pDG364  n gen cotB vào vector pDG364 ti v m, chúng tôi x lý ng th n gen cotB và vector pDG364 bng cp enzyme ct gii hn là BamHI và Hin tng. Sn phc ni li bng enzyme T 4 ADN và bin np vào t bào kh bin E. coli chng . Sau khi bin np và nuôi cch LB b c mt s khun lc. Tin hành PCR kim tra các khun lc, s dng cp mi ca vector pDG364 gm 364Fw/R và ch  nhi c kt qu  94 0 C : 30 giây 56 0 C : 45 giây 30 chu k 72 0 C : 1 phút 40 giây Hình 2: Kết quả điện di sản phẩm PCR các khuẩn lạc bằng cặp mồi 364 Fw/Rv Đường chạy 1: Thang chun ADN 1 kb, Đường chạy 2-5: Các khun lc 1-4 2 khun lc (các khun lc 3,4) cho kt qu  xut hin trên bn di agarose là khong 1,6 kb cho phép chúng tôi có th kt lun rn gen cotB n thành công vào vector pDG364, to vector tái t hp pDG364 cotB. Khun lc s 3 c nuôi  tách plasmid, chun b c nhân dòng tip theo. 3.1.3. Nhân dòng đoạn gen streptavidin vào vector pDG364 cotB Phn ng ni streptavidin vào vector pDG 364 cotB c tin hành  gn gia cotB vi pDG 364. Các khun lc sau quá trình bin nc kim tra bng i cp mi cn cotB, streptavidin và ca vector pDG364. Ch  nhit ca phn ng PCR s dng m 94 0 C : 30 giây 56 0 C : 45 giây x 30 chu k 72 0 C : 2 phút 10 giây Sau khi tin hành phn ng PCR cho 3 khun lc chn ngu nhiên, s dng cp mi ca vector pDG 364 Fw/Rv, kt qu n di sn phc th hin  hình 3. Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiê ̉ m tra ca ́ c khuâ ̉ n la ̣ c bă ̀ ng că ̣ p mô ̀ i cu ̉ a vector pDG 364 Đường chạy 1:   1kb, Đường chạy 2-4: 1- 3 Kt qu n di cho thy  c ng chy 2,3,4    duy nht có    2,1 c này phù hp vi các tính toán, ch   3      364   p cotB streptavidin  khnh thêm, chúng tôi tin hành kim tra mt ln na th tái t hc bt enzyme gii hn. Kt qu n di các sn phm ct plasmid bng enzyme gii hn (hình 27) cho thy khi plasmid tái t h c ct bi cp HindIII và Ecoa streptavidin (hình 4c ct bng cp enzyme BamHI và EcoRI thì xut hin gen dung hp cotB-streptavidin (hình 4a), (a) (b) Hình 4: Kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn của vector tái tổ hợp pDG364 cotB-streptavidin (a) Đường chạy 1: Thang chun ADN 1 kb, Đường chạy 2: c x lý vi cp enzyme BamHI và EcoRI, Đường chạy 3u (b) Đường chạy 1: Thang chun ADN 1 kb, Đường chạy 2: u, Đường chạy 3: c x lý vi cp enzyme HindIII và EcoRI       ,        g co thành công vector tái t hp pDG 364 cotB streptavidin 3.1.4. Đƣa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin trên vector vào hệ gen B. subtilis  dung hn gen cotB-streptavidin vào h gen ca B. subtilis d  dng enzyme Pst m vòng vector này. Kt qu bin np vào t bào B. subtilis cho thc mt s khun ly. Các khun lc s c có b sung 1% tinh bt cha chloramphenicol 5µg/ml và nuôi  42 0  Hình 5 cho th               (các khun lc 1-28 )      i tinh bt,         B. subtilis PY79  i tinh bt ry các khun lc ki  ng h     , n gen cotB-streptavidin c dung hp vào h gen B. subtilis. Hình 5: Kiểm tra sự có mặt của gen dung hợp trong ADN hệ gen Bacillus subtilis A) ch LB mang các khun lc nhum màu Iot B)                      1-28: các khun lc kim tra 1-28 -): B. subtilis PY 79 du không chn gen dung hp  BIU HIN PROTEIN DUNG HP COTB-STREPTAVIDIN TRÊN B MT BÀO T B. subtilis 3.2.1. Kiểm tra biểu hiện của cotB-streptavidin trên bào tử bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch Bm tách min dch s dng kháng th a streptavidin c kt qu  hình 6ng chy 2-5 là các mu bào t hình thành t t bào B. subtilis mang gen cotB- c khoc mong muc li,  ng chy s 6 là mu bào t hình thành t t bào B. subtilis ch   u không xut hi  protein nào. Hình 6: Kết quả thẩm tách miễn dịch kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp cotB- streptavidin trên bào tử Đường chạy 1: Thang chun protein nhum sn, Đường chạy 2-5: Bào t  ng t các khun lc s 1, 2, 3, 4, Đường chạy 6i chng âm, bào t B. subtilis PY79 hoang di không có protein dung hp T kt qu u khnh bào t B. subtilis u hin protein dung hp cotB-streptavidin (bào t-strep). Chúng tôi a chn bào t c hình thành t khun lc s 4 vi mc biu hin protein dung hp cotB-streptavidin cao nht cho các thí nghim tip sau.      LIÊN KT CA BÀO T-STREP VI KHÁNG TH KHÁNG VP28-BIOTINYL. 3.3.1. Đánh giá mức độ liên kết của bào tử-strep với kháng thể đa dòng kháng VP28- biotinyl Trong thí nghim này, chúng tôi gn bào t-strep vi kháng th    VP28-biotinyl vi ng kháng th : 10 µg, 50 µg và 100µg. Bào t B. subtilis PY79 hoang di c làm  kim tra. Hình 7: Kiểm tra khả năng gắn của bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa dòng Đường chạy 1: 10 9 bào t B.subtilis PY79  vi 10 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 2: 10 9 bào t, B.subtilis PY79  vi 50 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 3: 10 9 bào t B.subtilis PY79  vi 100 µg kháng th kháng VP28 biotinyl ,Đường chạy 4: Thang chun protein nhum sn,Đường chạy 5: 10 9 bào t-strep  vi 100 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 6: 10 9 bào t-strep  vi 50 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 7: 10 9 bào t-strep  vi 10 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 8: 1 µg kháng th kháng VP28 biotinyl Kt qu c trên hình 7 cho thy, khi gn kháng th i bào t, chúng    kDa  các mu bào t-strep ca kháng th kháng VP28 (ng chy 5-7 m nht cc t l thun vi n kháng th cho vào. i vi mu bào t B. subtilis PY79 hoang dng chy 1-3) c  -strep  tt c ng kháng thu này có th c lí gii do trong quá trình thao tác, kháng th kháng VP28 liên k c hiu vi các protein  lp áo ngoài ca bào t . T kt qu này, chúng tôi có th bc u kt lun bào t-strep có kh    i kháng th kháng VP28-     B. subtilis y có th gn vi kháng th kháng VP28-biotinyl vi ái l t-strep. Bi vy, m c hiu và bn vng ca liên kt gia bào t-strep, bào t B. subtilis PY79 vi kháng th cn phc tip tc kim tra.  có th ki bn vng ca liên kt gia bào t vi streptavidin, các mu bào t c gn kháng th kháng VP28-c bo qun  4 0 C sau 2 tháng s c kim tra li bm tách min dch (hình 8). Hình 8: Mẫu bào tử-strep gắn với kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl sau 2 tháng bảo quản Đường chạy 1: Thang chun protein nhum sn, Đường chạy 2: 10 9 bào t-strep  vi 100 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 3: 10 9 bào t-strep  vi 50 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 4: 10 9 bào t-strep  vi 10 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 5: 10 9 bào t B.subtilis PY79  vi 100 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 6: 10 9 bào t-strep, Đường chạy 7: 1µg kháng th kháng VP28 biotinyl Kt qu c trên hình 8 cho thy, sau 2 tháng bo qun,  ng chy s 5 là mu bào t B. subtilis PY79 c  vi kháng th kháng VP28-biotinyl vi 100 µg, chúng y, liên kt gia kháng th vi protein lp v áo ngoài ca bào t B. subtilis PY79 vi kháng th là không bn vng và không phi là liên kc hiu. Ngoài ra, vi 10 µg kháng th c s dng cho phn ng gn vi bào t-strep thì liên kt gia streptavidin vi kháng th c bn v dng kháng th là 50 µg và 100 µg. T kt qu c, chúng tôi có th khng nh bào t-strep có kh c hiu và bn vng vi kháng th  VP28-  chúng tôi phát trit min dch ng dng trong phát hin virus gây bm trng trên tôm WSSV. 3.3.1. Đánh giá mức độ liên kết của bào tử-strep với kháng thể đơn dòng kháng VP28- biotinyl Trong thí nghing kháng th  dng cho phn ng là 50 µg và 100 µg. Hình 9: Kiểm tra khả năng gắn của bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa dòng Đường chạy 1: Thang chun protein nhum sn, Đường chạy 2: 10 9 bào t-strep  vi 50 µg kháng th Đường chạy 3: 10 9 bào t-strep  vi 100 µg kháng th  dòng kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 4: 1µg kháng th  Hình 9 cho thy bào t-st n vi kháng th  VP28-biotinyl  c y, bào t-strep gn vi kháng th kháng VP28- biotinyl c u có th s dng cho phn t sau này. 3.3.2. Đánh giá hằng số phân ly của phức hệ bào tử-strep- kháng thể kháng VP28- biotinyl N  ca kháng th kháng VP28-biotinyl gn lên bào t- c tính toán bng phn mm Scion image d sáng c 1µg kháng th kháng VP28-biotinyl chun. Da trên ma n kháng th phn u và n kháng th gn lên bào t-strep, chúng tôi có th tính toán ng kháng th hp ph c trên mi bào t và hng s a kháng th kháng VP28-biotinyl vi streptavidin, gi là K b, dn ng gia bào t-strep vi kháng th- S + A ↔ S*A Ti thm cân bng, hng s c tính theo công thc: K bSA = AS SA ]].[[ ][ (1)  [SA] là n kháng th hp ph lên b mt bào t-strep [S] là n bào t-strep không gn vi kháng th [A] là n kháng th còn tha t y = [SA] Vi R s là s v trí gn ca kháng th kháng VP28-biotinyl trên 1 bào t Và C là n bào t i t 10 9 bào t/ 100l thành 16x10 -3 nM t m 2 = R S x C thì [S]= m 2 - y Và m o là n kháng th u thì [A] = m o -y Kt hp vi s liu tính toán bng phn mc  trên, chúng tôi s dng phn m dng chun da  trên phù hp vi s liu thc nghim. T ng chun (v tin cy R= 0,98), chúng tôi c giá tr K b(C-S) ng kháng th kháng VP28-biotinyl hp ph trên mi bào t, c th là:  K bSA =1/m 1 = 1/3500 = 0.0028 (nM) = 2,8x10 5 /M  R S xC = m 2 = 64 (nM) Vi n  ca 10 9 bào t/100 µl là C = 16x10 -4 (nM) thì s ng phân t streptavidin biu hin trên bào t có kh    i kháng th-biotinyl là R S = 4x10 4 phân t/bào t. Trên lý thuyt, hng s liên kt ca streptavidin dng tetramer v  t ti 10 15 /M, trong khi kt qu c da trên thc nghim ch ra hng s liên kt ca streptavidin dc biu hii dng dung hp vi cotB trên b mt bào t vi kháng th kháng VP28-biotinyl hóa ch là 2,8x10 5 /M, tc là gi 9 ln so vi dng tetramer. Tuy nhiên, kt qu c v  ch ra liên kt streptavidin- biotin trên b mt bào t c hiu và bn vng so vi liên kt k c 3.4. PHN   T MIN DCH TH NG KIM TRA S CÓ MT CA VIRUS GÂY BM TRNG TRÊN TÔM WSSV. 3.4.1. Xác định nồng độ virus trong dịch nghiền bằng Realtime PCR Vi các dung dch virus pha loãng, chúng tôi tin hành tách chit ADN bng b kit Virus Magnet Nano. T 250 µl dch nghic 50 µl sn phm ADN tinh sc làm khuôn cho phn  nh s bn copies trong dung dch virus  tng n. T kt qu Real-timec n virus trong tng n  Bảng 3: Số bản copies trong từng dung dịch WSSV N pha loãng S bn copies/50µl S bn copies/1ml u 3,8x10 4 copies 76x10 4 copies WSSV 1:4 4,3x10 3 copies 87x10 3 copies WSSV 1:16 - - WSSV 1:64 - - (-): không thể xác định Vi hai n pha loãng 1:16 và 1: 64, Realtime PCR không th c s b  khui. 3.4.2. Đánh giá khả năng hình thành ngƣng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl với dịch nghiền tôm nhiễm WSSV  có th c liu bào t-strep gn khng th kháng VP28-biotinyl có th c s d cho phn t hay không, chúng tôi tin hành thí nghim  bào t n vi kháng th i dch nghin cha virus gây bm trng vi các di n khác nhau. Bào t B. subtilis PY79 gn vi kháng th  c s dng trong thí nghi  i chng âm. Sau 4 gi   nhi  phòng, c kt qu  trên hình 10. Hình 10: Kiểm tra khả năng hình thành phản ứng ngƣng kết của bào tử Hàng 1: 20µl dch nghin có cha WSSV, Hàng 2: 50µl dch nghin có cha WSSV, Hàng 3: 100µl dch nghin có cha WSSV, Hàng 4: 200µl dch nghin có cha WSSV, Cột A: 10 µl cha 10 8 bào t B. subtilis PY79  vi 100µg kháng th kháng VP28, Cột B: 10 µl cha 10 8 bào t-strep  vi 10µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Cột C: 10 µl cha 10 8 bào t-strep  vi 50µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Cột D: 10 µl cha 10 8 bào t-strep  vi 100µg kháng th kháng VP28 biotinyl Hình 10 cho thy, s t xy ra rõ nét  các mu bào t-strep gn kháng th kháng VP28-biotinyl vi th tích dch nghin là 50µl trong khi vi mu bào t B. subtilis PY79, s t không h xy ra, bào t tp trung thành cm  ng phn ng. Kt qu này phù hp vi kt qu thm tách min dc  ng thi tái khnh mi liên kt không bn vc hiu gia bào t B. subtilis PY79 vi kháng th háng VP28-biotinyl. Bên ci di th tích dch nghin virus cho vào, chúng tôi quan sát thy, vi 20µl th tích dch nghin (hàng 1) thì phn  kt hy ra. Nguyên nhân có th ng virus trong dung d [...]... công gen streptavidin vào vector pDG364 cotB và dung hợp thành công đoạn gen cotB -streptavidin vào ADN hệ gen Bacillus subtilis 2 Biểu hiện thành công protein dung hợp cotB -streptavidin trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis 3 Bào tử- strep đã gắn kết đặc hiệu và bền vững với kháng thể đơn dòng và đa dòng kháng VP28 được biotinyl hóa 4 Bước đầu ứng dụng được bào tử- strep gắn kháng thể kháng VP28 -biotinyl. .. ra với bào tử- strep gắn 10 µg, 50 µg và 100 µg kháng thể biotinyl hóa Tuy nhiên, kết hợp với kết quả western blot ở mục 3.3, để đảm bảo liên kết giữa bào tử- strep với kháng thể kháng VP28 -biotinyl bền vững, nồng độ kháng thể được chọn cho các thí nghiệm sau này là 50 µg 3.4.3 Đánh giá khả năng hình thành phản ứng ngƣng kết giữa bào tử- strep gắn kháng thể kháng VP28 -biotinyl với các nồng độ virus pha... dụng kháng thể đa dòng kháng VP28, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm tương tự đối với kháng thể đơn dòng kháng VP28 Trong thí nghiệm đối với kháng thể đơn dòng, lượng kháng thể được dùng để gắn với bào tử- strep là 50µg Hình 12 là kết quả của phản ứng sau 4 tiếng ủ giữa bào tử- strep – kháng thể đơn dòng kháng VP28 -biotinyl với dải nồng độ virus giảm dần Hình 12: Thử phản ứng ngƣng kết giữa bào tử- strep -kháng. .. độ virus tối thiểu để sự ngưng kết có thể xảy ra Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các dịch nghiền virus đã được pha loãng theo các tỷ lệ 1:4, 1:16 và 1:64 và xác định số bản copies của WSSV 3.4.3.1 Phản ứng ngưng kết giữa bào tử- strep gắn kháng thể đa dòng kháng VP28 -biotinyl với các nồng độ virus pha loãng Trong thí nghiệm này, 50 µl dịch virus với các nồng độ pha loãng được ủ với bào tửstrep có gắn. .. liên kết chéo giữa kháng nguyên với kháng thể Do vậy, ngưng kết không được tạo thành Kết quả cũng cho thấy phản ứng ngưng kết cho phép phát hiện sự có mặt của WSSV nồng độ tối thiểu là 3,8x104 bản copies, thấp hơn khoảng 10 lần so với sử dụng kỹ thuật PCR (nồng độ thấp nhất là 4,3x103) 3.4.3.2 Phản ứng ngưng kết giữa bào tử- strep gắn kháng thể đơn dòng kháng VP2 8biotinyl với các nồng độ virus pha loãng... với bào tửstrep có gắn kháng thể đa dòng kháng VP28 -biotinyl nồng độ 50 µg Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ Hình 11 là sự hình thành ngưng kết theo thời gian Hình 11: Phản ứng ngƣng kết giữa bào tử- strep -kháng thể đa dòng kháng VP28 -biotinyl với các nồng độ WSSV pha loãng Giếng A: Đối chứng (-) Đệm NTE, Giếng B: Dịch nghiền virus nồng độ ban đầu, Giếng C: Dịch nghiền virus được pha loãng 1:4,... ứng chứa virus nồng độ gốc (giếng 2) Trong khi đó, với 2 mẫu đối chứng âm (giếng A và F) và 3 mẫu virus pha loãng (giếng C, D, E), chúng tôi không quan sát thấy sự xuất hiện của ngưng kết Như vậy, với những kết quả thu được cho phép chúng tôi khẳng định bào tửstrep gắn kháng thể đơn dòng kháng VP28 -biotinyl hoàn toàn có thể sử dụng được làm giá thể cho phản ứng ngưng kết thụ động ngược để phát hiện sự... lần, 16 lần và 64 lần thì bào tử- strep bắt đầu tập trung lại ở đáy giếng Sự khác biệt này được thể hiện rõ hơn sau 3 giờ ủ, đặc biệt rõ nét là ở giờ thứ 4 Như vậy, phản ứng ngưng kết chỉ xuất hiện trong giếng chứa nồng độ virus gốc, trong khi đó với giếng chứa WSSV pha loãng 4, 16 và 64 lần thì ngưng kết không xuất hiện Hiện tượng này có thể được giải thích bởi do nồng độ virus quá thấp, không đủ để... kháng thể đơn dòng và đa dòng kháng VP28 được biotinyl hóa 4 Bước đầu ứng dụng được bào tử- strep gắn kháng thể kháng VP28 -biotinyl để phát hiện sự có mặt của virus gây bệnh đốm trắng nhờ phản ứng ngưng kết Phương pháp cho phép phát hiện sự có mặt của virus gây bệnh đốm trắng với nồng độ tối thiểu là 3,8x104 bản copies, thấp hơn khoảng 10 lần so với phương pháp PCR HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Tiếp tục nghiên... Thử phản ứng ngƣng kết giữa bào tử- strep -kháng thể đơn dòng kháng VP2 8biotinyl với các nồng độ virus pha loãng Giếng A: Đối chứng (-) đệm NTE, Giếng B: Dịch nghiền virus nồng độ ban đầu, Giếng C: Dịch nghiền virus được pha loãng 1:4, Giếng D Dịch nghiền virus được pha loãng 1:16, Giếng E: Dịch nghiền virus được pha loãng 1:64, Giếng F: Đối chứng (-) dịch nghiền tôm không nhiễm WSSV Kết quả trên hình .  Tạo bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm vi m to bào t-strep. tra khả năng gắn của bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa dòng Đường chạy 1: 10 9 bào t B .subtilis PY79  vi 10 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường