Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV Semliki forest virut nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã thụ thể neurokinin 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam

Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV Semliki forest virut nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã thụ thể neurokinin 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV Semliki forest virut nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã thụ thể neurokinin 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 604270 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) 1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein vai trò nghiên cứu dược phẩm 1.1.2 Các hệ thống vector 1.1.3 Các hệ thống biểu thụ thể kết cặp G-protein 1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) 13 1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV) 13 1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) 14 1.2.3 Tiềm ứng dụng khác hệ vector SFV 17 1.2.4 Các yếu tố cần cải tiến hệ vector SFV 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Chuẩn bị tế bào khả biến biến nạp 28 2.2.2 Phương pháp tách chiết plasmit 29 2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trình phân lập nhân dòng 29 2.2.4 Thiết kế mồi 30 2.2.5 Khuếch đại gen nhờ phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 31 2.2.6 Cắt ADN sử dụng enzym giới hạn chống tự nối/đóng vịng 31 2.2.7 Tạo đoạn ADN sợi đôi linker từ đoạn oligonucleotit 32 2.2.8 Phản ứng nối đoạn ADN 33 2.2.9 Sàng lọc khuẩn lạc 34 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị tế bào khả biến biến nạp 35 3.2 Cải tiến vector pSFV 37 3.3 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 hệ vector SFV 43 3.4 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 hệ vector SFV cải tiến 46 3.5 Sàng lọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 52 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 53 Tài liệu tiếng Anh 53 Tài liệu tiếng web 57 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Bốn họ thụ thể Hình Quy trình thời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái tổ hợp hệ thống biểu khác Hình Hệ gen SFV tự nhiên 13 Hình Cấu trúc vector pSFV 15 Hình Cấu trúc vector pHelper 15 Hình Mơ hình hoạt động hệ vector SFV 16 Hình Cấu trúc vector pJET1.2 23 Hình Vị trí mồi cADN mã cho thụ thể NK1 25 Hình Trình tự vị trí nhân dịng đa điểm đoạn O-M7 25 Hình 10 Sơ đồ nghiên cứu tạo hệ vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8 27 Hình 11 Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn vector pSFV cải tiến 27 Hình 12 Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn vector pSFV 28 Hình 13 Đường cong sinh trưởng E.coli DH5α 35 Hình 14 Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mã vỏ capsit SFV 38 Hình 15 Một phần kết giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit SFV 39 Hình 16 Vị trí đoạn chèn thứ pHelper 39 Hình 17 Ảnh điện di đoạn chèn gel agarrose 1% 40 Hình 18 Ảnh điện di sản phẩm colony PCR kiểm tra khuẩn lạc mang vùng cải biến 41 Hình 19 Kết giải trình đoạn cải tiến vector pSFV-M7 42 Hình 20 Kết giải trình đoạn cải tiến vector pSFV-M8 43 Hình 21 Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA polymerase 43 Hình 22 Ảnh điện di sản phẩm cắt pSFV mở vòng SmaI 45 Hình 23 Ảnh điện di sản phẩm cắt thu cADN mã cho NK1 từ pJET1.2 46 Hình 24 Ảnh điện di cADN mã cho NK1 (XhoI/Klenow/ XbaI) sau tinh 47 Hình 25 Ảnh điện di mở vịng pSFV-M7 pSFV-M8 48 Hình 26 Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 50 Hình 27 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809 51 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Một số promoter bổ sung vào vectơ biểu Bảng Trình tự, kích thước số đuôi lực Bảng Các vị trí cắt số protease phổ biến Bảng Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 24 Bảng Trình tự oligonucleotit sử dụng nghiên cứu 24 Bảng Phản ứng cắt với enzym giới hạn 31 Bảng Điều kiện phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN 32 Bảng Thành phần phản ứng nối ADN vector đầu 33 Bảng Thành phần phản ứng nối ADN vector đầu dính 33 Bảng 10 Điều kiện phản ứng nối linker 34 Bảng 11 Tần số biến nạp số lô tế bào khả biến 36 Bảng 12 Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit SFV 38 Bảng 13 Thành phần điều kiện phản ứng cắt thu đoạn chèn 40 Bảng 14 Thành phần điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8 41 Bảng 15 Quy trình cho phản ứng nhân dịng đoạn cADN mã hóa cho thụ thể NK1 44 Bảng 16 Thành phần điều kiện phản ứng cắt pSFV SmaI 44 Bảng 17 Thành phần điều kiện phản ứng cắt pSFV mở vòng XhoI 45 Bảng 18 Thành phần điều kiện phản ứng chống tự đóng vịng pSFV 46 Bảng 19 Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có đầu bằng/ đầu dính 47 Bảng 20 Quy trình mở vịng pSFV cải biến kiểm tra hiệu suất mở vịng 48 Bảng 21 Quy trình tạo đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến 49 Bảng 22 Thành phần điều kiện phản ứng colony PCR để xác định khuẩn lạc tái tổ hợp pSFV-NK1 50 BẢNG CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) GPCR Thụ thể kết cặp G- protein kb kilobase (= 1000 bp) LB Lubertani Broth NK1 Neurokinin-1 Nu Nucleotit OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) ARN Axit ribonucleic SFV Semliki Forest Virut SOC Super Optimal broth with Catabolite repression TAE Đệm Tris/Axit acetic/EDTA BẢNG VIẾT TẮT CÁC AXIT AMIN Ala (A): alanin Leu (L): leucin Arg (R): arginin Lys (K): lysin Asn (N): asparagin Met (M): methionin Asp (D): axit aspartic Phe (F): phenylalanin Cys (C): cystein Pro (P): prolin Gln (Q): glutamin Ser (S): serin Glu (E): axit glutamic Thr (T): threonin Gly (G): glycin Try (W): trytophan His (H): histidin Tyr (Y): tyrosin Ile (I): isoleucin Val (V): valin Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học MỞ ĐẦU Mặc dù ngành đời thành tựu mà công nghệ sinh học phân tử (molecular biotechnology) mang lại lớn Những bước phát triển nhanh chóng cơng nghệ sinh học phân tử lĩnh vực điều chế dược liệu, tạo kháng thể đơn dịng, sản xuất vacxin, thành cơng giải trình tự hệ gen người góp phần đắc lực giúp người công đấu tranh chống bệnh tật không ngừng cải thiện, nâng cao chất lượng sống Ngày nay, biểu protein tái tổ hợp phần quan trọng công nghệ sinh học phân tử với nhiều ứng dụng rộng rãi lĩnh vực y dược Biểu protein quan tâm tế bào động vật người giúp thiết lập mơ hình điều trị bệnh liệu pháp gen, bao gồm điều trị ung thư Biểu protein tái tổ hợp đặc biệt protein thụ thể kết cặp G-protein (Gprotein coupled receptor, viết tắt GPCR) phục vụ hữu ích cho nghiên cứu phát triển thuốc, tìm hiểu cấu trúc chức sinh học thụ thể, qua làm sáng tỏ đường truyền tin nội bào Các protein thụ thể kết cặp Gprotein liên quan trực tiếp đến phát sinh nhiều bệnh lý người, “đích” có vai trị quan trọng bậc chương trình sàng lọc dược chất Các nhà khoa học mong muốn xây dựng hệ thống biểu GPCR chủ động mức độ cao để dùng cho nghiên cứu dược lý học phân tử, thí nghiệm sàng lọc để phát dược chất phát triển dược phẩm Trên giới, số hệ thống biểu GPCR tiềm thiết lập thử nghiệm, chẳng hạn hệ thống dịch mã phi tế bào, hệ thống biểu tế bào nhân sơ (E.coli Halobacterium salinarum) nhân chuẩn (nấm men, côn trùng động vật có vú) Một số GPCR biểu thành công hệ thống mức độ cao từ đến 10 mg/l môi trường nuôi cấy [19] Trong hệ thống biểu trên, hệ thống sử dụng hệ vector Semliki Forest Virut (SFV) ghi nhận hệ thống có nhiều đặc điểm ưu việt giàu tiềm ứng dụng [34] Tuy vậy, SFV không Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 3.5 Sàng lọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1 3.5.1 Colony PCR dùng mồi NK1 F/ R1 để xác định khuẩn lạc tái tổ hợp Chỉ đĩa LB có đĩa đối chứng âm (hỗn hợp nối có vector, khơng có đoạn chèn) khơng mọc khuẩn lạc mơi trường LB có bổ sung ampicillin tương ứng khơng có tượng tự đóng vịng dùng để sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn Chúng sử dụng phản ứng colony PCR nhân dòng đầu 5’ cADN mã cho NK1 (cặp mồi NK1 F/NK1 R1) để xác định khuẩn lạc mang vector pSFV cài đoạn NK1 Đoạn khuếch đại có chiều dài 788 bp nhân lên theo điều kiện mô tả bảng 22 Bảng 22 Thành phần điều kiện phản ứng colony PCR để xác định khuẩn lạc tái tổ hợp pSFV-NK1 Thành phần Thể tích ( µl) H2O 9.7 Đệm 10X 1.5 MgCl2 25 mM 0.3 dNTP 2mM 1.0 NK1F / NK1 R1 µM 0.5 Taq Polymerase u/µl 0.5 Khn 1.0 Tổng 15.0 Chu trình nhiệt Thời gian biến tính đầu tiên: 940C, phút Lặp lại 45 chu kì: + Biến tính: 940C, 30 giây + Gắn mồi: 600C, 30 giây + Tổng hợp: 720C, 90 giây Thời gian tổng hợp sau cùng: 720C, 10 phút 788 bp Hình 26 Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 Làn đánh số 1-13: mẫu khuẩn lạc, M: tháng chuẩn 100bp Kết điện di sản phẩm PCR hình 26 cho thấy chúng tơi thu 8/250 khuẩn lạc có khả mang đoạn chèn cADN-NK1 Các khuẩn lạc 50 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học mang đoạn chèn có đoạn chèn chèn ngược chiều xi chiều Các khuẩn lạc lưu lại làm khn để tìm khuẩn lạc chứa đoạn chèn NK1 chiều phương pháp colony PCR dùng cặp mồi 808/809 3.5.2 Tối ưu phản ứng colony PCR để sàng lọc khuẩn lạc mang gen mã cho NK1 chiều Cặp mồi 808/809 dùng để xác định đoạn chèn cADN NK1 có cài chiều vào vector pSFV hay khơng Do mồi tự thiết kế chưa xác định nhiệt độ gắn mồi (Tm) tối ưu thực nghiệm, ngồi chưa sẵn có đối chứng dương (khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 chiều), lý trên, mẫu khuẩn lạc xác định mang đoạn chèn NK1 (thông qua colony PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1 nêu mục 3.5.1) dùng để chạy colony PCR dải nhiệt độ từ 48 đến 56oC Khuẩn lạc số 97 lô biến nạp tế bào mang vector pSFV chèn NK1 mẫu xuất băng ~650bp, phù hợp với kích thước băng ADN nhân cặp mồi 808/809 Chủng 97 sau dùng làm đối chứng dương để thực tối ưu nhiệt độ gắn mồi với cặp mồi 808/809 650 bp Hình 27 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809 Hình 27 cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho cặp mồi 808/809 520C Với nhiệt độ gắn mồi tối ưu, tượng âm tính giả q trình sàng lọc khuẩn lạc clonyPCR giảm thiểu đáng kể, tăng hiệu sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 phiên pSFV 51 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Với kết bước đầu thu từ nghiên cứu phát triển hệ vector SFV nhằm nhân dịng biểu gen mã hóa thụ thể NK1, rút số kết luận sau: 1) Đã tối ưu điều kiện chuẩn bị tế bào khả biến DH5α biến nạp cho phép nhân dòng vector cách dễ dàng 2) Đã chuyển thành công vector SFV vào tế bào khả biến DH5α xác lập điều kiện tối ưu để nhân dòng lưu giữ ổn định 3) Đã tiến hành cải biến hệ vector SFV hướng tới việc biểu gen mã NK1 tế bào động vật có vú Hệ vector cải biến cài thêm vùng tăng cường dịch mã, đuôi tag hỗ trợ trình tinh thu hồi protein tái tổ hợp, vị trí nhân dịng đa điểm mở rộng thuận tiện cho việc chèn gen ngoại lai 4) Đã thiết lập quy trình kỹ thuật điều kiện phản ứng cài cADN mã NK1 vào vector SFV 5) Đã thiết lập quy trình colony PCR nhằm sàng lọc chủng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector SFV chèn gen mã hóa NK1 chiều Kiến nghị Trên sở kết nghiên cứu này, chúng tơi có số kiến nghị sau: 1) Tiến hành cài ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 hệ vector SFV cải tiến chọn lọc chủng tái tổ hợp ổn định 2) Tiến hành nghiên cứu biểu gen NK1 hệ vector pSFV cải biến dòng tế bào chủ khác nhau, thử nghiệm sử dụng thụ thể NK1 tái tổ hợp nghiên cứu dược phẩm 52 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở Di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Giáo trình Cơng nghệ DNA tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hóa sinh dược lý phân tử, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 10 11 12 13 14 Andersen B and Stevens R.C (1998), “The human D1A dopamine receptor: heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and purification of the functional receptor”, Protein Expr Purif, 13, pp 111–119 Asselin-Paturel C., Lassau N., Guinebretiere J M., Zhang J., Gay F., Bex F., Hallez S., Leclere J., Peronneau P., Mami-Chouaib F., and Chouaib S (1999), “Transfer of the murine interleukin-12 gene in vivo by a Semliki Forest virus vector induces B16 tumor regression through inhibition of tumor blood vessel formation monitored by Doppler ultrasonography”, Gene Ther., 6, pp 606-615 Boorsma M, Saudan P, Pfruender H, Bailey Je, Schlesinger S, Renner Wa, and Bachmann Mf (2003), “Alphavirus cDNA-based expression vectors: effects of RNA transcription and nuclear export”, Biotechnol Bioeng, 81, pp 553-562 Cereghino Jl and Cregg Jm (2000), “Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol Rev,(24), pp 45-66 Chang J.Y (1985), “Thrombin specificity:Requirement for apolar amino acids adja-cent to the thrombin cleavage site of polypeptide substrate”, Eur J Biochem, 151, pp 217-224 Cordingley.M.G., Callahan.P.L., Sardana.V.V., Garsky.V.M., and Colonno.R.J (1990), “Substrate requirements of human rhinovirus 3C protease for peptidecleavage in vitro”, J Biol Chem., 265, pp 9062-9065 E Mathilda Sjoberg and Henrik Garoff (1996), “The translation-enhancing region of the Semliki Forest virus subgenome is only functional in the virusinfected cell”, Journal of General Virology, 77, pp 1323 1327 Federal Register 58 No 19, Addition of Appendix DL-X to the NIH guidelines regarding Semliki Forest virus Human Gene Therapy 1993 p Frolov I and Schlesinger S (1994), “Translation of Sindbis virus mRNA: effects of sequences downstream of the initiation codon”, Journal of Virology, 68, pp 8111-8117 Frolova E., Frolov I., and Schlesinger S (1997), J Virol, 71, pp 248-258 Frolow I and Schlesinger S (1994), J Virol, 68, pp 8111-8117 53 Luận văn tốt nghiệp-2012 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Gerstein A.S (2001), Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide, Wiley-Liss, Inc Giraud A., Ataman-Onal Y., Battail N., Piga N., Brand D., Mandrand B, and Verrier B (1999), “Generation of monoclonal antibodies to native human immunodeficiency virus type envelope glycoprotein by immunization of mice with naked RNA”, J Virol Meth., 79, pp 75-84 Glasgow G M., Mcgee M M., Tarbatt C J., Mooney D A., Sheahan B J., and Atkins G J (1998), “The Semliki Forest virus vector induces p53independent apoptosis”, Journal of General Virology, 79, pp 2405-2410 Gunnar Schulte, Basic Receptor Pharmacology 2008 Hassaine G., Wagner R., Kempf J., Cherouati N., Hassaine N., Prual C., Andre N., Reinhart C., Pattus F., and Lundstrom K (2006), “Semliki Forest virus vector for overexpression of 101 G protein-coupled receptors in mammalian host cell”, Protein Expr Purif, 45(2), pp 343-351 Hengen P (1995), “Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli”, Trends in Biochemical Sciences, 20(7), pp 285-286 Jarvis Dl and Finn Ee (1995), “Biochemical analysis of the N-glycosylation pathway in baculovirus-infected lepidopteran insect cells”, Virology,(212), pp 500–511 K Terpe ((2003) ), “Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems”, Appl Microbiol Biotechnol 60, pp 523-533 Kenneth H Lundstrom and M.L Chiu (2006), G Protein - Coupled receptors in Drug Discovery, Taylor & Francis Group Kiefer H., Vogel R., and Maier K (2000), “Bacterial expression of Gprotein-coupled receptors: prediction of expression levels from sequence”, Receptors Channels, 7, pp 109-119 Klabunde T and Hessler G (2002), “Drug design strategies for targeting Gproteincoupled receptors”, Chembiochem, 3(10), pp 929-944 Klammt C., Lohr F., Schafer B., Haase W., Dotsch V., Ruterjans H., Glaubitz C., and Bernhard F (2004), “High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins”, Eur J Biochem, 271, pp 568–580 Krasemann S., Jurgens T., and Bodemer W (1999), “Generation of monoclonal antibodies against prion proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy”, J Biotechnol, 73, pp 119-129 Kunji Er, Slotboom Dj, and Poolman B (2003), “Lactococcus lactis as host for overproduction of functional membrane proteins”, Biochim Biophys Acta,(1610), pp 97-108 Kunz D, Gerad Np, and Gerad C (1992), “The human leukocyte plateletactivating factor receptor”, J Biol Chem, 267, pp 9101-9106 Lee S B and Esteban M (1994), “The interferon-induced doublestranded RNA-activated protein kinase induces apoptosis”, Virology, 199, pp 491496 54 Luận văn tốt nghiệp-2012 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Loll P J (2003), “Membrane protein structural biology: the high throughput challenge”, J Struct Biol, 142(1), pp 144-153 Lundstrom K (2003), “Semliki Forest virus vectors for rapid and high-level expression of integral membrane proteins”, Biochim Biophys Acta., 1610, pp 90-96 Lundstrom K (2009), “An overview on GPCRs and drug discovery: structure-based drug design and structural biology on GPCRs ”, Methods Mol Biol., 552, pp 66-51 Lundstrom K., Wagner R., Reinhart C., Desmyter A., Cherouati N., et al (2006), “Structural genomics on membrane proteins: comparison of more than 100 GPCRs in expression sytems”, Struct Funct Genomics, 7(2), pp 77 - 91 Luque T and O’reilly D.R (1999), “Generation of baculovirus expression vectors”, Mol Biotechnol, 13, pp 153-163 Maa M.C., Chinsky J M., Ramamurthy V., Martin B D., and Kellems R E (199), “Identification of transcription stop sites at the 59 and 39 ends of the murine adenosine deaminase gene”, J Biol Chem., 265, pp 12513-12519 Madin K., Sawasaki T., Ogasawara T., and Endo Y (2000), “A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes”, Proc Natl Acad Sci USA, 97, pp 559–564 Massotte D (2003), “G protein-coupled receptor overexpression with the baculovirus–insect cell system: a tool for structural and functional studies”, Biochim Biophys Acta, 1610, pp 77-89 Mathiot C C., Grimaud G., Garry P., Bouquety J C., A Mada, Daguisy A M., and Georges A J (1990), “An outbreak of human Semliki Forest virus infection in Central African Republic”, American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 42, pp 386-393 Matsushima.M., Ichinose.M., Yahagi.N., Kakei.N., Tsukada.S., et al (1994), “Structural characterization of porcineenteropeptidase”, J Biol Chem., 269, pp 19976-19982 Mossman S.P., Bex F., Berglund P., Arthos J., O’neil S.P., et al (1996), “Protection against lethal simian immunodefieciency virus SIVsmmPBj14 disease by a recombinant Semliki Forest virus gp160 vaccine and by gp120 subunit vaccine”, J Virol., 70, pp 1953-1960 Nagai K and Thogersen H.C (1984), “Generation of beta-globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli”, Nature, 309, pp 810-812 Nambi P., A.N (2003), “G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery”, Assay and Drug Develop Tech., 1(2), pp 305-310 Patzelt H., Goto N., Iwai H., Lundstrom K., and Fernholz E (2003), “Modern methods for the expression of proteins in isotopically enriched form”, Drug Research, pp 1-38 Sambrook J and Russel D.W (2001), Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 55 Luận văn tốt nghiệp-2012 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Savvas C.M (1999), “Components of Vectors for Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells”, Protein Expression and Purification, 17, pp 183-202 Schmidt M, Tuominen N, Johansson T, Weiss Sa, Keinamen K, and Oker-Blom C (1998), “Baculovirus-mediated large-scale expression and purification of a polyhistidine-tagged Rubrella virus capsid protein”, Protein Expr Purif 12, pp 323-330 Sjoberg M., Suomalainen M, and Garoff H (1994)), “A significantly improved Semliki Forest virus expression system based on translation enhancer segments from the viral capsid gene”, Biotechnology, 12, pp 11271131 Smithburn K C and Haddow A J (1944), “Semliki Forest virus I Isolation and pathogenic properties”, Journal of Immunology, 49, pp 141-157 Strauss J H and Strauss E G (1994), “The alphaviruses : gene expression, replication and evolution”, Microbiological Reviews, 58, pp 491-562 Thomas P Hopp, Kathryn S Prickett, Virginia L Price, Randell T Libby, Carl J March, Douglas Pat Cerretti, David L Urdal, and Paul J Conlon (1988), “A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification”, Nature Biotechnology, 6, pp 1204 1210 Vassilatis D K., Hohmann J G., Zeng H., Li F S., Ranchalis J E., Mortrud M T., Brown A., Rodriguez S S., Weller J R., Wright A C., Bergmann J E., and Gaitanaris G A (2003), “The G protein-coupled receptor repertoires of human and mouse”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(8), pp 4903-4908 Winter-Vann Am, Martinez L, Bartus C, Levay A, and Turner Gj (2001), “G protein-coupled expression in Halobacterium salinarum.”, In: Kuehne SR, de Groot H, Eds Perspectives on Solid State NMR in Biology, Dordrecht: Kluwer, pp 141-159 Yamanaka R and Xanthopoulos Kg (2004), “Development of improved Sindbis virus-based DNA expression vector”, DNA Cell Biol., 23(2), pp 7580 Ying H., Zaks T.Z., Wang R.-F., Irvine K.R., Kammula U.S., Marincola F.M., Lettner W.W, and Restifo N.P (1999), “Cancer therapy using selfreplicating RNA vaccine”, Nat Medicine, 5, pp 823-827 Zhou X., Berglund P., Rhodes G., Parker S.E., Jondal M., and Liljeström P (1994), “Self-replicating Semliki Forest virus RNA as a recombinant vaccine”, Vaccine, 12, pp 1510-1513 Zhou X., Berglund P., Zhao H., Liljeström P., and Jonda M (1995), “Generation of cytotoxic and humoral immune responses by nonreplicative recombinant Semliki Forest virus”, Proc Natl Acad Sci USA, 92, pp 30093013 56 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Tài liệu web http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.sciencedirect.com http://vectordb.atcg.com http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/mapper 57 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học PHỤ LỤC Các vector virut dùng chuyển biểu gen động vật có vú Vector virut có hệ gen ADN Virut Cytomegalo Virut Herpes simplex Virut Epstein-Barr Virut Simian Virut Papilloma Adenovirut Virut liên hợp với Adenovirut Virut Vaccinia Baculovirut Vector virut có hệ gen ARN Virut Semliki Forest Virut Sindbis Poliovirut Virut dại Virut cúm SV5 Virut hô hấp hợp bào Virut viêm não ngựa Venezuela Virut Kunjin Virut Sendai Virut gây mụn nước viêm miệng Retrovirut Vector virut dạng lai Virut Adenovirut-Sindbis Adenovirut-virut liên hợp với Adenovirut Trình tự vector pSFV 61 121 181 241 301 ATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCG CTACGCGAGAGATTAACCACCCACGATGGCCGCCAAAGTGCATGTTGATATTGAGGCTGA CAGCCCATTCATCAAGTCTTTGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGCA GGTCACACCAAATGACCATGCAAATGCCAGAGCATTTTCGCACCTGGCTACCAAATTGAT CGAGCAGGAGACTGACAAAGACACACTCATCTTGGATATCGGCAGTGCGCCTTCCAGGAG AATGATGTCTACGCACAAATACCACTGCGTATGCCCTATGCGCAGCGCAGAAGACCCCGA Luận văn tốt nghiệp-2012 7321 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học GTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTA Vị trí bắt cặp mồi F-N SFV replicase- dependent subgenomic promoter 7381 ATACACAGAATTCTGATTGGATCCCGGGTAATTAATTGAATTACATCCCTACGCAAACGT Vị trí nhân dòng đa điểm mã kết thúc liên tiếp 7441 7501 7561 7621 7681 7741 7801 TTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTC CGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCG TAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGA AGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGC AGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAG AAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGTATGCGGCTAGCCACAGTAAC GTAGTGTTTCCAGACATGTCGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGT Vị trí bắt cặp mồi 809 CTGGGGGCCTTCGCAATCGGCGCTATCCTGGTGCTGGTTGTGGTCACTTGCATTGGGCTC CGCAGATAAGTTAGGGTAGGCAATGGCATTGATATAGCAAGAAAATTGAAAACAGAAAAA GTTAGGGTAAGCAATGGCATATAACCATAACTGTATAACTTGTAACAAAGCGCAACAAGA CCTGCGCAATTGGCCCCGTGGTCCGCCTCACGGAAACTCGGGGCAACTCATATTGACACA TTAATTGGCAATAATTGGAAGCTTACATAAGCTTAATTCGACGAATAATTGGATTTTTAT TTTATTTTGCAATTGGTTTTTAATATTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTAGTGATCATAATCAGCCA TACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCT GAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA CAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAG TTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTAGTCTGCATTAAT GAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGC TCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGG CGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAG GCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCC GCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAG GACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGA CCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTC AATGCTCGCGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGT CCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCA GAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACA CTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAG TTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCA AGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGG GGCATTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTAT CAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAA GTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT CAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTA CGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCT CACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTG GTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAA GTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGT CACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTA CATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA GAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTA CTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCT GAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCG CGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAAC TCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACT GATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAA 7861 7921 7981 8041 8101 8161 8221 8281 8341 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 8821 8881 8941 9001 9061 9121 9181 9241 9301 9361 9421 9481 9541 9601 9661 9721 9781 9841 9901 9961 10021 10081 10141 10201 10261 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 10321 ATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTT 10381 TTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAAT 10441 GTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTG 10501 ACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGC 10561 CCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGG 10621 AGACGGTCACAGCTTCTGTCTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGT 10681 CAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTAC 10741 TGAGAGTGCACCATATCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAG 10801 TACTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCGTAATCAATTA 10861 CGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATG 10921 GCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTC 10981 CCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAA 11041 CTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCA 11101 ATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTA 11161 CTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGT 11221 ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTG 11281 ACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACA 11341 ACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCA 11401 GAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTAACTGGCTTATCGAAATTAATACGACT 11461 CACTATAGGGAGACCGGAAGCTTGAATTC Ghi cho vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein phi cấu trúc (nsP1-4) Vùng gen cấu trúc bị cắt phần lớn Đầu 3’ khơng mã hóa SFV Đi polyA69 Tín hiệu kết thúc SV40 Đoạn trình tự pBR322-origin Đoạn trình tự mã gen kháng ampicillin Promoter CMV Trình tự vector pHelper 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 ATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCG CTACGCGAGAGATTAACCACCCACGATGGCCGCCAAAGTGCATGTTGATATTGAGGCTGA CAGCCCATTCATCAAGTCTTTGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGCA GGTCACACCAAATGACCATGCAAATGCCAGAGCATTTTCGCACCTGGCTACCAAATTGAT CGAGCAGGAGACTGACAAAGACACACTCATCTTGGATATCGGCAGTGCGCCTTCCAGGAG AATGATGTCTACATGAAACGAGATGTCAAAGTCACTCCAGGGACGAAACACACAGAGGAA AGACCCAAAGTCCAGGTAATTCAAGCAGCGGAGCCATTGGCGACCGCTTACCTGTGCGGC ATCCACAGGGAATTAGTAAGGAGACTAAATGCTGTGTTACGCCCTAACGTGCACACATTG TTTGATATGTCGGCCGAAGACTTTGACGCGATCATCGCCTCTCACTTCCACCCAGGAGAC CCGGTTCTAGAGACGGACATTGCATCATTCGACAAAAGCCAGGACGACTCCTTGGCTCTT ACAGGTTTAATGATCCTCGAAGATCTAGGGGTGGATCAGTACCTGCTGGACTTGATCGAG GCAGCCTTTGGGGAAATATCCAGCTGTCACCTACCAACTGGCACGCGCTTCAAGTTCGGA GCTATGATGAAATCGGGCATGTTTCTGACTTTGTTTATTAACACTGTTTTGAACATCACC ATAGCAAGCAGGGTACTGGAGCAGAGACTCACTGACTCCGCCTGTGCGGCCTTCATCGGC GACGACAACATCGTTCACGGAGTGATCTCCGACAAGCTGATGGCGGAGAGGTGCGCGTCG TGGGTCAACATGGAGGTGAAGATCATTGACGCTGTCATGGGCGAAAAACCCCCATATTTT TGTGGGGGATTCATAGTTTTTGACAGCGTCACACAGACCGCCTGCCGTGTTTCAGACCCA CTTAAGCGCCTGTTCAAGTTGGGTAAGCCGCTAACAGCTGAAGACAAGCAGGACGAAGAC AGGCGACGAGCACTGAGTGACGAGGTTAGCAAGTGGTTCCGGACAGGCTTGGGGGCCGAA CTGGAGGTGGCACTAACATCTAGGTATGAGGTAGAGGGCTGCAAAAGTATCCTCATAGCC Luận văn tốt nghiệp-2012 1201 1261 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học ATGGCCACCTTGGCGAGGGACATTAAGGCGTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACAC Vị trí bắt cặp mồi F-N CTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTAATACACAGAATTCTGATTATAGCGCACTATT SFV replicase- dependent subgenomic promoter 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 EcoRI ATAGCACCATGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCC CGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCC AGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACG CAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGA AAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAG CCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATG ACTGTATCTTCGAAGTCAAACACGAAGGAAAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGTGGGCG ACAAAGTCATGAAACCTGCCCACGTGAAAGGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGCAAAGC TAGCTTTCAAGAAATCGAGCAAGTATGACCTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCACATGA GGTCGGATGCCTCAAAGTACACGCATGAGAAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCACCACG GGGCTGTTCAGTACAGCGGAGGTAGGTTCACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACCGGGAG ACAGTGGCCGGCCCATCTTTGACAACAAGGGGAGGGTAGTCGCTATCGTCCTGGGCGGGG CCAACGAGGGCTCACGCACAGCACTGTCGGTGGTCACCTGGAACAAAGATATGGTGACTA GAGTGACCCCCGAGGGGTCCGAAGAGTGGTCCGCCCCGCTGATTACTGCCATGTGTGTCC Vị trí bắt cặp mồi R-N TTGCCAATGCTACCTTCCCGTGCTTCCAGCCCCCGTGTGTACCTTGCTGCTATGAAAACA ACGCAGAGGCCACACTACGGATGCTCGAGGATAACGTGGATAGGCCAGGGTACTACGACC TCCTTCAGGCAGCCTTGACGTGCCGAAACGGAACATCCCACCAATTGAGCGTGTCGCAAC ACTTCAACGTGTATAAGGCTACACGCCCTTACATCGCGTACTGCGCCGACTGCGGAGCAG GGCACTCGTGTCATAGCCCCGTAGCAATTGAAGCGGTCAGGTCCGAAGCTACCGACGGGA TGCTGAAGATTCAGTTCTCGGCACAAATTGGCATAGATAAGAGTGACAATCATGACTACA CGAAGATAAGGTACGCAGACGGGCACGCCATTGAGAATGCCGTCCGGTCATCTTTGAAGG TAGCCACCTCCGGAGACTGTTTCGTCCATGGCACAATGGGACATTTCATACTGGCAAAGT GCCCACCGGGTGAATTCCTGCAGGTCTCGATCCAGGACACCAGAAACGCGGTCCGTGCCT GCAGAATACAATATCATCATGACCCTCAACCGGTGGGTAGAGAAAAATTTACAATTAGAC CACACTATGGAAAAGAGATCCCTTGCACCACTTATCAACAGACCACAGCGAAGACCGTGG AGGAAATCGACATGCATATGCCGCCAGATACGCCGGACAGGACGTTGCTATCACAGCAAT CTGGCAATGTAAAGATCACAGTCGGAGGAAAGAAGGTGAAATACAACTGCACCTGTGGAA CCGGAAACGTTGGCACTACTAATTCGGACATGACGATCAACACGTGTCTAATAGAGCAGT GCCACGTCTCAGTGACGGACCATAAGAAATGGCAGTTCAACTCACCTTTCGTCCCGAGAG CCGACGAACCGGCTAGAAAAGGCAAAGTCCATATCCCATTCCCGTTGGACAACATCACAT GCAGAGTTCCAATGGCGCGCGAACCAACCGTCATCCACGGCAAAAGAGAAGTGACACTGC ACCTTCACCCAGATCATCCCACGCTCTTTTCCTACCGCACACTGGGTGAGGACCCGCAGT ATCACGAGGAATGGGTGACAGCGGCGGTGGAACGGACCATACCCGTACCAGTGGACGGGA TGGAGTACCACTGGGGAAACAACGACCCAGTGAGGCTTTGGTCTCAACTCACCACTGAAG GGAAACCGCACGGCTGGCCGCATCAGATCGTACAGTACTACTATGGGCTTTACCCGGCCG CTACAGTATCCGCGGTCGTCGGGATGAGCTTACTGGCGTTGATATCGATCTTCGCGTCGT GCTACATGCTGGTTGCGGCCCGCAGTAAGTGCTTGACCCCTTATGCTTTAACACCAGGAG CTGCAGTTCCGTGGACGCTGGGGATACTCTGCTGCGCCCCGCGGGCGCACGCAGCTAGTG TGGCAGAGACTATGGCCTACTTGTGGGACCAAAACCAAGCGTTGTTCTGGTTGGAGTTTG CGGCCCCTGTTGCCTGCATCCTCATCATCACGTATTGCCTCAGAAACGTGCTGTGTTGCT GTAAGAGCCTTTCTTTTTTAGTGCTACTGAGCCTCGGGGCAACCGCCAGAGCTTACGAAC ATTCGACAGTAATGCCGAACGTGGTGGGGTTCCCGTATAAGGCTCACATTGAAAGGCCAG GATATAGCCCCCTCACTTTGCAGATGCAGGTTGTTGAAACCAGCCTCGAACCAACCCTTA ATTTGGAATACATAACCTGTGAGTACAAGACGGTCGTCCCGTCGCCGTACGTGAAGTGCT GCGGCGCCTCAGAGTGCTCCACTAAAGAGAAGCCTGACTACCAATGCAAGGTTTACACAG GCGTGTACCCGTTCATGTGGGGAGGGGCATATTGCTTCTGCGACTCAGAAAACACGCAAC TCAGCGAGGCGTACGTCGATCGATCGGACGTATGCAGGCATGATCACGCATCTGCTTACA AAGCCCATACAGCATCGCTGAAGGCCAAAGTGAGGGTTATGTACGGCAACGTAAACCAGA CTGTGGATGTTTACGTGAACGGAGACCATGCCGTCACGATAGGGGGTACTCAGTTCATAT TCGGGCCGCTGTCATCGGCCTGGACCCCGTTCGACAACAAGATAGTCGTGTACAAAGACG Luận văn tốt nghiệp-2012 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 5521 5581 5641 5701 5761 5821 5881 5941 6001 6061 6121 6181 6241 6301 6361 6421 6481 6541 6601 6661 6721 6781 6841 6901 6961 7021 7081 7141 7201 7261 7321 7381 7441 7501 7561 7621 7681 7741 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học AAGTGTTCAATCAGGACTTCCCGCCGTACGGATCTGGGCAACCAGGGCGCTTCGGCGACA TCCAAAGCAGAACAGTGGAGAGTAACGACCTGTACGCGAACACGGCACTGAAGCTGGCAC GCCCTTCACCCGGCATGGTCCATGTACCGTACACACAGACACCTTCAGGGTTCAAATATT GGCTAAAGGAAAAAGGGACAGCCCTAAATACGAAGGCTCCTTTTGGCTGCCAAATCAAAA CGAACCCTGTCAGGGCCATGAACTGCGCCGTGGGAAACATCCCTGTCTCCATGAATTTGC CTGACAGCGCCTTTACCCGCATTGTCGAGGCGCCGACCATCATTGACCTGACTTGCACAG TGGCTACCTGTACGCACTCCTCGGATTTCGGCGGCGTCTTGACACTGACGTACAAGACCA ACAAGAACGGGGACTGCTCTGTACACTCGCACTCTAACGTAGCTACTCTACAGGAGGCCA CAGCAAAAGTGAAGACAGCAGGTAAGGTGACCTTACACTTCTCCACGGCAAGCGCATCAC CTTCTTTTGTGGTGTCGCTATGCAGTGCTAGGGCCACCTGTTCAGCGTCGTGTGAGCCCC CGAAAGACCACATAGTCCCATATGCGGCTAGCCACAGTAACGTAGTGTTTCCAGACATGT CGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGTCTGGGGGCCTTCGCAATCG GCGCTATCCTGGTGCTGGTTGTGGTCACTTGCATTGGGCTCCGCAGATAAGTTAGGGTAG GCAATGGCATTGATATAGCAAGAAAATTGAAAACAGAAAAAGTTAGGGTAAGCAATGGCA TATAACCATAACTGTATAACTTGTAACAAAGCGCAACAAGACCTGCGCAATTGGCCCCGT GGTCCGCCTCACGGAAACTCGGGGCAACTCATATTGACACATTAATTGGCAATAATTGGA AGCTTACATAAGCTTAATTCGACGAATAATTGGATTTTTATTTTATTTTGCAATTGGTTT TTAATATTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTAGTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTT TTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCA ATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATC ACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTC ATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTAGTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGG GAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTC GGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCAC AGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAA CCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCA CAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGC GTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATA CCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCGCGCTGTAGGTA TCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCA GCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGA CTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGG TGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGG TATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGG CAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAG AAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGCATTCTGACGCTCAGTG GAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTA GATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG GTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCG TTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACC ATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATC AGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGC CTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAG TTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTAT GGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTG CAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGT GTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAG ATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCG ACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTT AAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCT GTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTAC TTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAAT AAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCAT TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACA AATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTAT TATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTT CGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTCTGT Luận văn tốt nghiệp-2012 7801 7861 7921 7981 8041 8101 8161 8221 8281 8341 8401 8461 8521 8581 8641 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học CTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTG TCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATCGA CGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTACTAGGTTGAGGCCGTTG AGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAG CCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCC CAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGG GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGC CTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGT ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATA GCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTT TTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCA AATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAG AGAACCCACTGCTTAACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGAA GCTTGAATTC Ghi cho vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein vỏ capsit Đoạn trình tự mã cho protein E3 Đoạn trình tự mã cho protein E2 Đoạn trình tự mã cho protein 6K Đoạn trình tự mã cho protein E1 Đi polyA Tín hiệu kết thúc SV40 Đoạn trình tự pBR322-origin A/T/G/C Đoạn trình tự mã gen kháng ampicillin Promoter CMV Vùng trình tự cải biến pSFV-M7 7321 GTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTA 7381 7441 7501 7561 7621 7681 7741 7801 7861 7921 7981 8041 ATACACAGAATTCTGATTATAGCGCACTATTATAGCACCATGAATTACATCCCTACGCAA ACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCCTGGCCGTTGCAGGCC ACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGC GCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCA AAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAA ACGCAGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAA AGAGAAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGAAGTCAAACACGAAGGA AAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGTGGGCGACAAAGTCATGAAACCTGCCCACGTGAAA GGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGCAAAGCTAGCTTTCAAGAAATCGAGCAAGTATGAC CTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCACATGAGGTCGGATGCCTCAAAGTACACGCATGAG AAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCACCACGGGGCTGTTCAGTACAGCGGAGGTAGGTTC ACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACCGGGAGACAGTGGCCGGCCCATCTTTGACAACAAG Vị trí bắt cặp mồi 807 GGTAGGGTAGTCGCTATCGTCCTGGGCGGGGCCAACGAGGGCTCACGCACAGCACTGTCG GTGGTCACCTGGAACAAAGATATGGTGACTAGAGTGACCCCCGAGGGGTCCGAAGAGTGG GATCTTGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACCACCATCATCACCACCATCACCATCAC FLAG-tag HIS –tag SFV replicase- dependent subgenomic promoter 8101 8161 8221 8281 AGCAGCGGCCTGGTTCCGCGTGGGTCTGGATCCGCTAAGCGCGCTTCGAATCGATGCATC Luận văn tốt nghiệp-2012 8341 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Vị trí Thrombin Vị trí nhân dòng đa điểm CTAGGGCCCGGGTAATTAATTGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGCCGGTG ba kết thúc liền kề GCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGT CCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTGACAAT GAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGAAGAAGAAGACAACCAA ACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGCAGCAAAAGAAGAA AGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGCATGAA GATTGAAAATGACTGTATCTTCGTATGCGGCTAGCCACAGTAACGTAGTGTTTCCAGACA TGTCGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGTCTGGGGGCCTTCGCAA Vị trí bắt cặp mồi 809 Ghi cho vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein vỏ capsit Vùng trình tự cải biến pSFV-M8 7321 GTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTA SFV replicase- dependent subgenomic promoter 7381 7441 7501 7561 7621 7681 7741 7801 7861 7921 7981 8041 8101 8161 8221 8281 8341 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 ATACACAGAATTCTGATTATAGCGCACTATTATAGCACCATGAATTACATCCCTACGCAA ACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCCTGGCCGTTGCAGGCC ACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGC GCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCA AAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAA ACGCAGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAA AGAGAAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGAAGTCAAACACGAAGGA AAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGTGGGCGACAAAGTCATGAAACCTGCCCACGTGAAA GGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGCAAAGCTAGCTTTCAAGAAATCGAGCAAGTATGAC CTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCACATGAGGTCGGATGCCTCAAAGTACACGCATGAG AAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCACCACGGGGCTGTTCAGTACAGCGGAGGTAGGTTC ACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACCGGGAGACAGTGGCCGGCCCATCTTTGACAACAAG Vị trí bắt cặp mồi 807 GGTAGGGTAGTCGCTATCGTCCTGGGCGGGGCCAACGAGGGCTCACGCACAGCACTGTCG GTGGTCACCTGGAACAAAGATATGGTGACTAGAGTGACCCCCGAGGGGTCCGAAGAGTGG GATCTTGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACCACCATCATCACCACCATCACCATCAC FLAG-tag HIS –tag AGCAGCGGCCTGGTTCCGCGTGGGTCTGGATCGGATCCGCTAAGCGCGCTTCGAATCGAT Vị trí Thrombin Vị trí nhân dòng đa điểm GCATCCTAGGGCCCGGGTAATTAATTGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGC ba kết thúc liền kề CGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCC GTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTG ACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGAAGAAGAAGACA ACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGCAGCAAAAG AAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGC ATGAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGTATGCGGCTAGCCACAGTAACGTAGTGTTTCC AGACATGTCGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGTCTGGGGGCCTT Vị trí bắt cặp mồi 809 Ghi cho vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein vỏ capsit Đoạn Nu thêm đẩy khung đọc mở lệch Nu ... Hồng Nhung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên... ĐT-PTNTĐ.2 011 -G/04, đề xuất thực đề tài: ? ?Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng biểu gen mã hóa thụ thể Neurokinin- 1 phục vụ nghiên cứu dược lý phát triển thuốc Việt. .. 1. 2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) 13 1. 2 .1 Virut Semliki Forest (SFV) 13 1. 2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) 14 1. 2.3 Tiềm ứng dụng khác hệ vector SFV